應 春，沈彩燕，詹建華，郭利琴，吳慧芬，李鵬飛

（浙江中醫(yī)藥大學附屬江南醫(yī)院蕭山區(qū)中醫(yī)院，浙江杭州 311201）

毛細支氣管炎常見于1 至6 個月的嬰幼兒，是兒童常見的急性下呼吸道感染性疾病，其特征性病變部位為肺細支氣管。該病臨床癥狀主要表現(xiàn)為為喘息、氣短和三凹征，其常發(fā)生在冬季，最常見病原體為呼吸道合胞病毒［1］?，F(xiàn)有研究表明，呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）毛細支氣管炎是嬰幼兒毛細支氣管炎發(fā)展為支氣管哮喘的高危因素之一［2］。流行病學研究表明呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎與兒童期反復發(fā)作喘息和哮喘具有相關性，呼吸道合胞病毒可以從母體垂直傳播到胎兒的肺和呼吸道，嬰兒出生后病毒持續(xù)感染與氣道高反應性也具有顯著相關性［3-4］。但在目前的臨床研究中，嬰幼兒呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎仍然缺乏可靠的生物標志物、有效的疫苗和治療策略。

高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種高度敏感的核DNA 結(jié)合蛋白，主要存在于細胞核內(nèi)，具有參與核小體穩(wěn)定、細胞分化和DNA 修復等功能［5］，HMGB1 是在炎癥中啟動先天性和適應性免疫反應的關鍵介質(zhì)分子［6］。Zhou等［7］研究觀察HMGB1 在小鼠RSV 感染和慢性氣道功能障礙的疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，同時該項研究認為HMGB1 在RSV 感染相關呼吸道疾病中可作為一種生物標志物。然而，關于HMGB1在臨床RSV 毛細支氣管炎的表達及其在疾病發(fā)展過程中激活免疫細胞作用的研究報道仍然很少。因此，本研究對相關臨床標本和體外細胞中HMGB1 的表達進行了探討，并探討了HMGB1 對單核細胞功能的影響，旨在提供RSV 毛細支氣管炎診斷和治療的參考資料。

材料和方法

1 臨床資料

選取于2018 年1 月至2020 年1 月期間兒科住院治療并給予精細化護理的確診為RSV 毛細支氣管炎的30例患兒作為研究（research）組，選取同期于我院進行體檢的30 例健康足月嬰幼兒作為對照（control）組。研究獲得患者知情同意并通過倫理委員會審批。兩組基本資料經(jīng)比較無顯著性差異（P＞0.05），具有可比性，見表1。納入標準：（1）患兒年齡在2 歲以下且患病時間少于3 d；（2）入院后檢測到血清特異性RSV 特異性IgM 為陽性；（3）符合《毛細支氣管炎診斷、治療與預防專家共識（2014 年版）》診斷標準［8］；（4）均為首次診斷為RSV 毛細支氣管炎。排除標準：（1）有哮喘相關疾病家族史的；（2）具有先天性心臟病和肺功能不全的；（3）疑似免疫缺陷和過敏性疾病的兒童；（4）治療前4 周內(nèi)服用過抗病毒藥物的。研究組的所有患者均接受了為期12 個月的門診隨訪，以評估兒童是否有胸悶、干咳、喘息、呼氣困難及支氣管擴張等癥狀。

表1 基線數(shù)據(jù)的比較Table 1.Comparison of baseline data

2 主要方法

2.1 外周血采集及檢測 兩組嬰幼兒入院時均采集2 mL 外周靜脈血置于EDTA 管內(nèi)，并將其置于4°C保存，離心，分離上清液，采用自動生化分析儀進行常規(guī)血細胞分析和C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）水平檢測。外周血血漿HMGB1 水平檢測采用ELISA 法，檢測步驟嚴格按照HMGB1 試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）說明操作。

2.2 細胞培養(yǎng) 人支氣管上皮細胞16HBE（上海中喬新舟生物科技有限公司）采用角質(zhì)形成細胞完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，單核細胞THP-1 細胞系（上海中喬新舟生物科技有限公司）使用90% 1640 培養(yǎng)基（Corning）、10% FBS、100 U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素（上海碧云天生物技術有限公司）進行培養(yǎng)，細胞均在5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37 ℃，當細胞密度至90%時進行下一步實驗。

2.3 RSV 病毒轉(zhuǎn)染及共培養(yǎng) 使用前，人重組RSVA2 菌株（ATCC）經(jīng)5 000×g連續(xù)離心10 min 進行純化，-80 ℃分裝保存。在RSV 病毒轉(zhuǎn)染前6 h 用堿性培養(yǎng)液替換16HBE 細胞培養(yǎng)液，當細胞密度達到90%時，根據(jù)感染，感染倍數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=1.0，未感染的16HBE 細胞采用與感染組相同量的30%蔗糖溶液進行處理。細胞培養(yǎng)上清液和提取的蛋白質(zhì)均儲存在-80 ℃保存，待后續(xù)檢測。轉(zhuǎn)染RSV 組和轉(zhuǎn)染對照組的細胞在傳代后生長到30%～50%時，將細胞分為HMGB1 抑制組和觀察組，觀察組細胞培養(yǎng)液中加入DMSO，HMGB1抑制組在RSVA2 轉(zhuǎn)染的16HBE 細胞培養(yǎng)液中加入0.16μmol/L甘草酸（glycyrrhizin），直到細胞生長到適當?shù)臐舛?。采用Transwell 板（Corning）進行THP-1細胞系和16HBE 細胞系的共培養(yǎng)，THP-1 細胞接種密度為1×109/L，按5 mL 每孔加入Transwell 下孔，上孔分別加入RSV 病毒轉(zhuǎn)染的1×106HMGB1 抑制組16HBE細胞和觀察組16HBE 細胞，兩組細胞共培養(yǎng)48 h 后提取下細胞層總蛋白待測。

2.4 RT-qPCR 采用RNeasy Mini Kit（凱杰生物工程有限公司）提取RSVA2 轉(zhuǎn)染的16HBE 細胞和非轉(zhuǎn)染的細胞mRNA，提取后采用NanoDrop 儀器（Thermo）進行定量，按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。正向和反向引物序列為5'-ACTGCAATCAYACAAGATGCAACRA-3' 和5'-CAGATTGRAGAAGCTGATTCCA-3'。以β-actin 為內(nèi)參照，根據(jù)2-ΔΔCt方法來計算基因的相對表達量。

2.5 Western blot 收集細胞，加入RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司）和終濃度為1 mmol/L 的蛋白酶抑制劑PMSF（北京索萊寶科技有限公司）進行超聲裂解，提取蛋白。采用BCA法定量蛋白濃度后，用8%SDS-PAGE 分離蛋白。電泳結(jié)束后，用半濕轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入TLR-4（1∶2 000）、TLR-7（1∶500）和GAPDH（1∶5 000）的Ⅰ抗稀釋液，4 °C 下孵育過夜，然后用0.1% PBST 洗滌3 次，加入相應的HRP 標記的山羊抗兔（小鼠）Ⅱ抗（1∶3 000）、室溫孵育1 h，然后用0.1%的PBST 洗滌3 次。最后加入ECL 化學發(fā)光溶液，曝光。采用ImageJ軟件進行圖像分析。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。ELISA 和RT-qPCR 實驗檢測結(jié)果用均值±標準差（mean±SD）表示，組間兩兩比較使用獨立樣本的t檢驗。免疫組化方法分析HMGB1的數(shù)量和表達，其相關性采用Person 相關分析。不同治療組之間的細胞數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 嬰幼兒外周血血漿HMGB1的表達水平比較

與健康對照組比較，RSV 毛細支氣管炎患兒外周血中HMGB1的表達水平顯著升高（P＜0.01），見圖1A。且外周血單核細胞數(shù)量、外周淋巴細胞數(shù)量及CRP 水平與RSV 毛細支氣管炎患兒外周血中HMGB1表達水平成正相關性（P＜0.05），其中外周血單核細胞數(shù)量與外周血中HMGB1 表達水平相關性最顯著，見圖1B～1D。

2 RSV轉(zhuǎn)染細胞中HMGB1的表達

通過qRT-PCR 檢測確定細胞經(jīng)過RSVA2 病毒轉(zhuǎn)染（圖2A），相較對照組，經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后的16HBE細胞培養(yǎng)液中HMGB1的表達顯著增加（P＜0.01），提示16HBE 細胞經(jīng)RSVA2 轉(zhuǎn)染后HMGB1 的表達可上調(diào)，而加入甘草酸可顯著下調(diào)HMGB1 的表達（P＜0.01），見圖2B。

3 單核細胞中Toll樣受體的表達水平

RSVA2 轉(zhuǎn)染的16HBE 細胞、感染對照組細胞、HMGB1 抑制組細胞分別與單核細胞THP-1 進行共培養(yǎng)后，經(jīng)Western blot 檢測單核細胞中TLR-4 和TLR-7 蛋白的表達水平，結(jié)果顯示與RSVA2 轉(zhuǎn)染的16HBE細胞共培養(yǎng)后，THP-1細胞中TLR-4的表達水平顯著增加（P＜0.01），而TLR-7 水平無顯著變化；通過在細胞培養(yǎng)液中添加甘草酸抑制RSVA2 轉(zhuǎn)染的16HBE 細胞HMGB1 表達可以顯著抑制共培養(yǎng)的THP-1細胞中TLR-4的表達（P＜0.01），見圖3。

討 論

嬰幼兒的毛細支氣管炎也被稱為哮喘性肺炎，伴有急性RSV 感染的毛細支氣管炎可能會伴有繼發(fā)性細菌感染和呼吸衰竭，則需要進行機械通氣治療且在治療過程中需進行精細化的護理。因RSV 感染引起的嚴重呼吸道疾病和死亡率較高，是全球5 歲以下兒童死亡的一個重要原因［9］，有研究觀察到在RSV 感染的活躍階段的標志物和相關靶點關系密切。HMGB1 主要存在于細胞核中，當細胞受到“危險信號”的刺激時，HMGB1 作為警報素蛋白家族分子，其可以被快速激活并釋放到細胞外部，直接作為啟動炎癥細胞因子和維持由感染性或非感染性疾病引起的免疫反應，并維持受損組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡［10］。HMGB1 通過影響免疫細胞不僅可以參與多種細胞因子和趨化促炎細胞引起的炎癥反應，而且還參與了哮喘的氣道致敏和誘導［11］，直接影響氣道炎癥。有研究認為HMGB1 可以作為反映氣道炎癥的一種生物標志物［12］。但目前臨床研究對HMGB1 在合胞病毒感染肺炎中研究較少的同時其作用機制亦鮮有研究，因此本文選取合胞病毒肺炎的患兒外周血研究呼吸道合胞病毒支氣管患者體內(nèi)HMGB1 水平的表達及機制。

Figure 1.Expression level and correlation analysis of HMGB1 in peripheral blood plasma of infants and young children.A：comparison of the levels of HMGB1 in peripheral blood between the two groups；B：the correlation between the number of monocytes and the level of HMGB1；C：the correlation between the number of monocytes in peripheral blood and the level of HMGB1；D：the correlation between the level of CRP in peripheral blood and the level of HMGB1.Mean±SD. n=30.**P＜0.01 vs control group.圖1 嬰幼兒外周血血漿HMGB1的表達水平及相關性分析

Figure 2.Related mRNA levels and HMGB1 expression in RSVA2-transfected 16HBE cells.A：RT-qPCR detection of RSVA2 infection status；B：the level of HMGB1 in cell supernatant.Mean±SD. n=30.**P＜0.01 vs β-actin group；##P＜0.01 vs control group；&&P＜0.01 vs RSVA2 group.圖2 RSVA2轉(zhuǎn)染的16HBE細胞中相關mRNA水平及HMGB1的表達

Figure 3.Expression levels of Toll-like receptors in THP-1 cells.The TLR-4 and TLR-7 protein expression levels in monocytes were detected by Western blot.Mean±SD. n=30.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs RSVA2 group.圖3 單核細胞中Toll樣受體的表達水平

本研究收集了RSV 毛細支氣管炎兒童和健康兒童的血漿樣本，結(jié)果顯示RSV 毛細支氣管炎患兒血漿HMGB1水平顯著增加，這與之前報道中RSV 毛細支氣管炎動物模型中的結(jié)果一致［13］。RSV 毛細支氣管炎患兒外周血中HMGB1 表達水平與外周血單核細胞數(shù)量、外周淋巴細胞數(shù)量及CRP 水平與成正相關，其中外周血單核細胞數(shù)量與外周血中HMGB1表達水平相關性最顯著，說明因RSV 感染引起的毛細支氣管炎患兒機體中存在炎癥反應增加，由于受到本院資源條件的限制，納入研究病例數(shù)較少，因此對于HMGB1 在臨床上RSV 感染毛細支氣管炎的表達水平和預后研究仍有待通過更大的數(shù)據(jù)和高質(zhì)量的臨床對照實驗來驗證。有學者對HMGB1 與肺部炎癥發(fā)展的關系進行相關研究，結(jié)果觀察有密切相關性，為本研究提供依據(jù)［12］。本研究基于人支氣管上皮細胞16HBE 建立RSV 感染細胞系，并檢測細胞上清中HMGB1 水平，同時將RSV 感染的16HBE 細胞系與單核細胞THP-1 細胞系共培養(yǎng)以檢測單核細胞中TLR-4 和TLR-7 蛋白的表達水平，進而探討RSV感染、HMGB1 水平與單核細胞中免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后的16HBE 細胞培養(yǎng)液中HMGB1的表達顯著增加，說明16HBE細胞經(jīng)RSV轉(zhuǎn)染后可上調(diào)HMGB1的表達，提示該模型可以模擬感染RSV 的人支氣管上皮細胞。共培養(yǎng)結(jié)果顯示結(jié)果顯示THP-1 細胞中TLR-4 的表達水平顯著增加，而TLR-7水平無顯著變化，通過在細胞培養(yǎng)液中添加甘草酸可以顯著抑制THP-1 細胞中TLR-4 的表達，以抑制RSV 轉(zhuǎn)染的細胞HMGB1 水平，這一結(jié)果提示，RSV 在感染16HBE 細胞后可以通過HMGB1 激活單核細胞相關的免疫功能。Hou 等［14］報道了RSV 感染小鼠肺組織中HMGB1 水平的升高。有研究對純化的HMGB1 與人氣道上皮細胞系和外周血單核細胞及從外周血單核細胞中分離和誘導的各種免疫細胞進行共培養(yǎng)［15］，其結(jié)果顯示，HMGB1 治療可顯著增加人氣道上皮細胞系中NF-κB 和P38 MAPK 的磷酸化。在免疫細胞中添加HMGB1 可以同時促進細胞因子/趨化因子釋放，并激活NF-κB 和P38 MAPK 通路。這些結(jié)果表明，HGMB1 可促進免疫細胞分泌的促炎介質(zhì)及其介導的炎癥反應，參與RSV 的發(fā)病機制。TLR-4 是近年來觀察到存在于先天性免疫系統(tǒng)中的識別受體，TLR-4參與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生。有研究提示，TLR-4 參與RSV 感染后的支氣管上皮細胞凋亡，敲低其表達后可以減少支氣管上皮細胞凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示感染RSV 的16HBE 細胞可以顯著激活單核細胞中的TLR-4 信號通路，從而誘導體內(nèi)先天免疫系統(tǒng)激活，本研究還觀察到HMGB1可以通過激活單核細胞中的TLR-4 來介導一系列下游的細胞因子/趨化因子級聯(lián)，因此，阻斷HMGB1 的促炎功能可能是開發(fā)新的治療方法的有效途徑。

本研究淺層分析了HMGB1 的表達水平與兒童呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎的發(fā)展的關系當仍存在許多不足：（1）本研究以患兒的外周血為基點對HMGB1、TLR-4 和TLR-7 的表達進行觀察，但是炎癥反應和患兒機體免疫對抗時一系列的反應過程，單論TLR-4 和TLR-7 的分泌狀況具有一定局限性。（2）本次研究僅在外周血層面討論HMGB1、TLR-4 和TLR-7 蛋白的表達水平與兒童呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎的關系缺乏動物實驗的驗證，臨床研究還需通過動物模型深入探討以驗證結(jié)論。

綜上所述，HMGB1 的表達水平與兒童呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎的發(fā)展有關，HMGB1 在單核細胞介導的炎癥過程中起著重要作用。