汪望佳，王 敏，李翅翅，張 丹△

（1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江溫州 325000；2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，浙江溫州 325000）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種持續(xù)進(jìn)展的間質(zhì)性肺病，患者通常以進(jìn)行性呼吸困難和干咳為主要臨床癥狀，臨床確診后中位生存期僅為3～5 年［1］。IPF 的病因尚不明確，但研究證實(shí)持續(xù)的炎癥反應(yīng)及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程與IPF 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，應(yīng)用激素、免疫抑制劑及抗EMT過(guò)程的藥物在臨床上發(fā)揮了一定的治療效果，然而這些藥物的使用存在其局限性。目前最有效的治療手段仍是肺移植，卻受限于轉(zhuǎn)診時(shí)機(jī)的確定和移植后的低存活率。因此進(jìn)一步研究IPF 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋求新的治療靶點(diǎn)具有重大的臨床意義。

脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年來(lái)再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，該細(xì)胞不僅可通過(guò)增殖、歸巢和定向分化作用直接參與受損組織的修復(fù)，還可通過(guò)旁分泌功能間接參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及氧化應(yīng)激等病理生理過(guò)程［2］。相對(duì)于干細(xì)胞直接定向分化作用而言，旁分泌功能被證明具有作用范圍廣和免疫異質(zhì)性小等優(yōu)勢(shì)。其中最受關(guān)注的是攜帶各種生物活性成分的外泌體，作為細(xì)胞間信息傳遞的重要媒介已被證實(shí)是干細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵旁分泌物質(zhì)［3］。本文就ADSCs 來(lái)源的外泌體（ADSCs-derived exosomes，ADSCs-Exo）在治療IPF中的研究進(jìn)展展開(kāi)綜述，討論其潛在的作用機(jī)制及應(yīng)用前景。

1 外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)及功能

外泌體是一類(lèi)在大小和生物功能等方面具有高度特異性的膜性囊泡，直徑約30～100 nm［4］。外泌體來(lái)源于細(xì)胞膜內(nèi)吞形成的早期內(nèi)體，逐步成熟為富含管腔狀囊泡的多囊體（multivesicular body，MVB）也就是外泌體前體。MVB主要通過(guò)內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）機(jī)制形成。ESCRT 是一組胞質(zhì)蛋白復(fù)合物，其中ESCRT-0 識(shí)別和結(jié)合早期內(nèi)體表面泛素化標(biāo)記的特異性受體，在ESCRT-I和ESCRT-II協(xié)同誘導(dǎo)下，內(nèi)體膜包裹特異性物質(zhì)形成出芽小泡，隨后ESCRTIII 剪切分離囊泡和內(nèi)體膜形成MVB，最后輔助蛋白VPS4（vacuolar protein sorting 4）分離并進(jìn)入ESCRT再循環(huán)［5］。MVB 有兩個(gè)去向，大部分經(jīng)溶酶體途徑被降解，少數(shù)與細(xì)胞膜融合并向胞外釋放外泌體從而發(fā)揮作用［6］。見(jiàn)圖1。

Figure 1.The biological structure，formation and secretion process of exosomes.圖1 外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)、形成和釋放過(guò)程

隨著對(duì)外泌體研究的逐漸深入，研究者對(duì)其功能有了更多的認(rèn)識(shí)。在發(fā)現(xiàn)初期，大多數(shù)研究者認(rèn)為外泌體是細(xì)胞分泌的廢棄物，細(xì)胞通過(guò)外泌體將胞內(nèi)一些多余的代謝物排出到胞外以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。隨著研究的進(jìn)展，研究者們發(fā)現(xiàn)外泌體不僅可通過(guò)運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、核酸及脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞間的相互調(diào)節(jié)，還可作為穩(wěn)定的藥物載體進(jìn)行疾病治療，并與多種疾病診斷及預(yù)后判斷密切相關(guān)［7］。

2 ADSCs-Exo通過(guò)調(diào)節(jié)EMT 過(guò)程干預(yù)IPF 的發(fā)生發(fā)展

EMT 是正常胚胎發(fā)育和組織重建的生理過(guò)程，但其異常發(fā)生與腫瘤形成和纖維化過(guò)程相關(guān)［8］。EMT 的特征包括上皮鈣黏素（E-cadherin）表達(dá)減少，以及波形蛋白（vimentin）、I 型膠原和IV 型膠原等間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)增加［9］。最近的研究表明，組織損傷后肺上皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的通訊失調(diào)在IPF發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，EMT通過(guò)激活與此過(guò)程相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)纖維化［10］。與此一致的是，小鼠模型實(shí)驗(yàn)以及一些IPF患者標(biāo)本檢測(cè)也同樣顯示了EMT 在IPF 中的重要作用［11］。目前ADSCs-Exo 對(duì)EMT 調(diào)控機(jī)制的研究尚不多，主要集中于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）及Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，已證實(shí)這兩條信號(hào)通路在EMT過(guò)程中發(fā)揮重要的正向調(diào)節(jié)作用。

2.1 ADSCs-Exo 通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad 相關(guān)信號(hào)通路影響EMT過(guò)程 在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠中，敲除Smad3或轉(zhuǎn)染TGF-β 拮抗劑Smad7，可有效抑制肺纖維化程度及EMT 水平，由此表明TGF-β/Smad通路正向調(diào)控EMT過(guò)程［12］。Yao等［13］將間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體與經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，外泌體促進(jìn)E-cadherin 表達(dá)，而降低vimentin、TGF-β1 和Smad2 表達(dá)，提示外泌體可抑制上皮細(xì)胞表型向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)換，其具體機(jī)制可能是通過(guò)其活性物質(zhì)直接或間接抑制TGF-β/Smad 信號(hào)通路以逆轉(zhuǎn)EMT 過(guò)程。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的微小RNA（microRNAs，miRNAs）在EMT 過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可作為胞外穿梭RNA 介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)通路以抑制EMT過(guò)程。Gao等［14］證實(shí)了ADSCs-Exo 可通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)let-7d-5p 抑制I 型和IV 型膠原形成及TGF-β 和TGF-β 受體1（TGF-β receptor 1，TGFβR1）表達(dá)，從而延緩PM2.5誘導(dǎo)的EMT 和肺纖維化進(jìn)程。此外，目前研究也在ADSCs-Exo 中發(fā)現(xiàn)了一系列靶向TGF-β/Smad 信號(hào)通路的特異性miRNAs，如靶向下調(diào)TGF-β 的miR-19b［15］、靶向下調(diào)TGF-β1的miR-21［16］、靶向下調(diào)TGF-β2 的miR-200［17］等。上述miRNAs 已被證明在IPF 患者及實(shí)驗(yàn)性肺纖維化小鼠細(xì)胞及組織中表達(dá)水平下調(diào)，而通過(guò)誘導(dǎo)這些miRNAs 表達(dá)可以抑制EMT 進(jìn)而緩解甚至逆轉(zhuǎn)肺纖維化進(jìn)程［18］。另一方面，ADSCs-Exo 可通過(guò)調(diào)控Smad 非依賴(lài)的TGF-β 信號(hào)通路抑制EMT 形成。研究者們發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exo 可釋放大量的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），這兩種細(xì)胞因子通過(guò)阻斷TGF-β 活化抑制成纖維細(xì)胞的增殖，并以PI3K/Akt依賴(lài)的方式抑制EMT［19］。ADSCs-Exo 也可通過(guò)降低TGF-β 的表達(dá)，靶向調(diào)控ZEB1（zinc finger E-box binding homeobox 1）/miR-200 信號(hào)通路，從而抑制和逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程［20］。

2.2 ADSCs-Exo 通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 通路信號(hào)調(diào)節(jié)EMT 過(guò)程 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Wnt/β-catenin 信號(hào)在IPF中異常激活，降低該信號(hào)通路活化水平可以部分恢復(fù)上皮表型并抑制肺纖維化的進(jìn)展，提示W(wǎng)nt/β-catenin 介導(dǎo)的EMT 在IPF 中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［21］。Shao 等［22］發(fā)現(xiàn)，ADSCs-Exo 中含有Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的拮抗劑分泌型糖蛋白Dickkopf-1（DKK-1），可以有效阻斷電離輻射誘導(dǎo)的EMT進(jìn)而限制放射性肺纖維化的發(fā)生。Rong 等［23］的研究表明，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以下調(diào)Wnt 信號(hào)通路中的β-catenin 及WISP1（Wnt1-inducible signaling pathway protein 1）的表達(dá)，對(duì)WISP1 表達(dá)的抑制作用尤為顯著，由此不僅延緩EMT進(jìn)程，而且降低細(xì)胞外基質(zhì)沉積以抑制纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)誘導(dǎo)Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）磷酸化而抑制Wnt/βcatenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而下調(diào)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白及I型和III 型膠原的表達(dá)［24］。YAP 信號(hào)是Hippo 信號(hào)通路的核心成分，可阻止β-catenin 核轉(zhuǎn)位并降低βcatenin 穩(wěn)定性進(jìn)而抑制Wnt 信號(hào)，Hippo 和Wnt 信號(hào)通路之間相互調(diào)控共同參與EMT 過(guò)程［25］。另外，Wnt 和TGF-β 信號(hào)通路之間也互相調(diào)節(jié)、互相影響，Wnt 已被證明與TGF-β 信號(hào)通路通過(guò)協(xié)同作用共同誘導(dǎo)EMT 過(guò)程，這些復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在IPF 發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［26］。Tsukasa 等［27］通過(guò)氣管內(nèi)注射人支氣管上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體減輕了博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化發(fā)展，并發(fā)現(xiàn)外泌體中某些高表達(dá)的miRNAs（miR-200a 和miR-26a）通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β-Wnt 的協(xié)同作用發(fā)揮抗纖維化作用。因此，靶向調(diào)控TGF-β 和Wnt 的相互調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)可能是治療IPF 的有效策略之一。

EMT 是正常生長(zhǎng)發(fā)育和傷口愈合的重要生理過(guò)程，但失調(diào)的EMT過(guò)程促進(jìn)組織纖維化和腫瘤形成。EMT 的穩(wěn)態(tài)通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)控，ADSCs-Exo 通過(guò)調(diào)控其中一個(gè)及多個(gè)信號(hào)通路影響EMT 過(guò)程（總結(jié)見(jiàn)表1），進(jìn)一步研究ADSCs-Exo 在EMT 進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制有望發(fā)現(xiàn)治療IPF的新方法。

3 ADSCs-Exo調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)影響IPF的發(fā)生發(fā)展

異常的免疫反應(yīng)是促進(jìn)IPF 發(fā)生發(fā)展的重要病因。動(dòng)物及人類(lèi)相關(guān)研究結(jié)果表明，先天性和獲得性免疫過(guò)程參與了IPF形成的整個(gè)階段，并可能決定疾病進(jìn)展的速度［28］。研究者發(fā)現(xiàn)，在確診的IPF患者肺組織中，纖維化病灶中存留大量的CD4+T 細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞，并且在該類(lèi)患者血清及支氣管肺泡灌洗液中可檢測(cè)到高水平的自身抗體及各種趨化因子［29］。ADSCs-Exo 具有減輕炎癥及免疫反應(yīng)的作用，已被廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病的研究及治療中，但在IPF 中的治療作用及機(jī)制仍處于探索階段，從現(xiàn)有的研究來(lái)看，ADSCs-Exo 免疫調(diào)節(jié)功能可能對(duì)IPF發(fā)生發(fā)展有著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用［30］。

3.1 ADSCs-Exo通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答維持免疫穩(wěn)態(tài) 研究者們將缺乏CD28（一種T 細(xì)胞完全活化所必需的細(xì)胞表面共刺激分子）的小鼠用博來(lái)霉素處理后，發(fā)現(xiàn)其肺纖維化程度較野生型小鼠明顯減輕；進(jìn)一步將CD28+T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至CD28-/-小鼠體內(nèi)，可恢復(fù)小鼠對(duì)博來(lái)霉素的纖維化反應(yīng)，表明T 細(xì)胞對(duì)IPF 形成起驅(qū)動(dòng)作用［31］。然而T 細(xì)胞種類(lèi)繁多，各亞群及其分泌的細(xì)胞因子可能于不同層面影響IPF的形成。目前的研究主要集中在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）與輔助性T 細(xì)胞17（T helper 17 cells，Th17）。IPF 患者存在Treg/Th17 比例下調(diào)，研究證明Treg 減少了成纖維細(xì)胞的交聯(lián)、聚集，抑制了炎癥反應(yīng)；與此相反，Th17 通過(guò)分泌白細(xì)胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并降低成纖維細(xì)胞對(duì)Treg 免疫調(diào)節(jié)的反應(yīng)［32］。因此T 細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)IPF發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，ADSCs-Exo可通過(guò)對(duì)T細(xì)胞亞群的調(diào)控發(fā)揮其在IPF 中的調(diào)節(jié)作用。Blazquez 等［33］發(fā)現(xiàn)，ADSCs-Exo 可抑制T 細(xì)胞的功能，包括減少干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的分泌以抑制T 細(xì)胞的激活，以及阻礙抗CD3/CD2/CD28 抗體介導(dǎo)的T 細(xì)胞向效應(yīng)-記憶細(xì)胞表型的分化。同時(shí)，Blazquez 等［33］猜測(cè)，由于缺乏MHC-II類(lèi)分子和共刺激分子，ADSCs-Exo 對(duì)T 細(xì)胞可能有不依賴(lài)于抗原提呈的直接抑制作用。此外，Bolandi 等［34］發(fā)現(xiàn)，ADSCs-Exo 通過(guò)攜帶并轉(zhuǎn)移miR-10a 促進(jìn)T 細(xì)胞向Treg 轉(zhuǎn)化，并抑制其向Th17分化。ADSCs-Exo含有的眾多miRNAs 中，不僅上文提及的miR-10a，其它miRNAs 如miR-21、miR-20和miR-93也相繼被證明可提高Treg與Th17比例，它們可能是通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3、STAT5 或TGF-β 通路實(shí)現(xiàn)的［35-36］。另有研究表明，ADSCs-Exo 中含有腫瘤壞死因子刺激基因6（tumor necrosis factor-stimulated gene 6，TSG-6）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）和程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）三種負(fù)反饋免疫調(diào)節(jié)分子，可通過(guò)控制T 細(xì)胞增殖和提高Treg 的數(shù)量及活性而抑制免疫反應(yīng)［37］。

3.2 ADSCs-Exo 通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 型極化調(diào)節(jié)免疫反應(yīng) 巨噬細(xì)胞作為非特異性免疫的重要組成部分，具有多樣性和可塑性特征，在環(huán)境刺激或不同的生理病理?xiàng)l件下可通過(guò)M1（促炎）/M2（抗炎）表型轉(zhuǎn)換參與炎癥調(diào)控及組織修復(fù)過(guò)程［38］。有文獻(xiàn)報(bào)道M2 型巨噬細(xì)胞不僅通過(guò)分泌IL-10 發(fā)揮抗炎作用，同時(shí)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)途徑降解膠原參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑［39］。在矽肺和肺損傷模型小鼠中，研究者們也發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加可延緩肺纖維化發(fā)展。Heo 等［39］將ADSCs-Exo 和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測(cè)后者的表型變化，發(fā)現(xiàn)外泌體下調(diào)了M1 型標(biāo)志物TNF-α 和iNOS 表達(dá)，并使M2型標(biāo)志物Arg-1、IL-10 和CCL22 表達(dá)上調(diào)，表明ADSCs-Exo 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化。同樣，Shang 等［40］在ADSCs 和巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)中驗(yàn)證了外泌體從ADSCs到巨噬細(xì)胞的單向轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)其向M2 型極化，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)缺乏p-STAT3 的ADSCs-Exo 不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)Arg-1，而巨噬細(xì)胞中STAT3的敲除對(duì)ADSCs-Exo 觸發(fā)的Arg-1 高表達(dá)無(wú)明顯影響，表明ADSCs-Exo 通過(guò)攜帶的p-STAT3 激活A(yù)rg-1 進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 型極化。此外，相關(guān)研究表明，ADSCs-Exo 在心肌梗死模型中可通過(guò)激活S1P/SK1/S1PR1 及AKT1/AKT2 信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，從而減輕心肌梗死后炎癥及纖維化反應(yīng)［41-42］。ADSCs-Exo 也可通過(guò)釋放某些參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的miRNAs 進(jìn)而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，如靶向上調(diào)PI3K/Akt 信號(hào)的miR-21［43］、靶向下調(diào)TLR4/NF-κB 信號(hào)的miR-181c［44］、同時(shí)靶向調(diào)節(jié)2條信號(hào)通路的miR-182［45］等。PI3K/Akt和TLR4/NF-κB 信號(hào)通路是巨噬細(xì)胞極化機(jī)制中研究最廣泛的，兩者之間的相互作用機(jī)制復(fù)雜，ADSCs-Exo 如何通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miRNAs 調(diào)節(jié)這2 條信號(hào)通路的平衡尚需進(jìn)行深入研究。

先天性和獲得性免疫反應(yīng)參與了IPF 形成的各個(gè)階段，在其發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位。ADSCs-Exo通過(guò)控制T細(xì)胞增殖分化、Treg細(xì)胞活性和巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用（總結(jié)見(jiàn)表1），有望成為IPF潛在的治療藥物。

表1 ADSCs-Exo攜帶的蛋白及RNAs在調(diào)節(jié)IPF中的作用機(jī)制Table 1.The mechanism of ADSCs-Exo-secreted proteins or RNAs in mediating idiopathic pulmonary fibrosis

4 小結(jié)和前景

IPF 病理過(guò)程復(fù)雜，目前尚缺乏有效的防治措施，發(fā)病率和病死率仍呈升高趨勢(shì)。本文中，我們介紹了目前ADSCs-Exo 在IPF 治療方面的一些主要國(guó)內(nèi)外研究成果。我們發(fā)現(xiàn)，盡管ADSCs-Exo 在治療IPF中的研究尚處于起步階段，但目前僅有的研究結(jié)果顯示其對(duì)IPF 具有潛在的臨床治療作用及價(jià)值。然而將外泌體用于治療IPF仍存在諸多挑戰(zhàn)。首先，外泌體提取方式、保存條件、給藥途徑及劑量方面尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化，此方面有待深入的研究；其次，目前的研究多集中于ADSCs-Exo 中miRNAs 的探討，對(duì)其分泌的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他非編碼RNA 的生物潛能知之甚少；最后，ADSCs-Exo 應(yīng)用于IPF 治療的研究尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，需進(jìn)一步探究其臨床治療的安全性及可行性。隨著未來(lái)研究的不斷深入，肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和ADSCs-Exo 對(duì)肺纖維化的調(diào)控作用及其機(jī)制將被逐漸闡明，ADSCs-Exo 有望成為未來(lái)臨床治療IPF的重要手段。