付 陽(yáng)，董一飛

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西南昌 330006）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種常見(jiàn)危重癥，是指腎功能在短時(shí)間內(nèi)突然下降引起血清肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）顯著升高的臨床綜合征，可由多種病因引起，如膿毒癥、休克和心肌梗死等［1-3］。AKI的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈逐漸升高趨勢(shì)，每年大約有近200 萬(wàn)的病死率，造成嚴(yán)重的醫(yī)療安全問(wèn)題［4］。一般來(lái)說(shuō)，AKI 的病程是短程的，但長(zhǎng)時(shí)間患病會(huì)引起腎臟功能障礙，并最終發(fā)展成為慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）［5］。膿毒癥（sepsis）是引起AKI 的主要原因之一，會(huì)導(dǎo)致微血管功能障礙、炎癥和小管損傷等許多病理改變［6-7］。目前對(duì)AKI 的病理機(jī)制研究已很透徹，但臨床治療手段有限，因此，亟需尋找新的、有效的AKI治療方法。

白細(xì)胞介素33（interleukin-33，IL-33）是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，屬于IL-1 家族，可由上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞合成分泌［8-12］。當(dāng)IL-33 與其受體ST2結(jié)合后，能發(fā)揮多種生物學(xué)特性［13］。有報(bào)道指出，IL-33通過(guò)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)和增加微血管通透性加重脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷［14］。而另有其它研究顯示，IL-33 在一些炎性疾病中具有保護(hù)作用［15］。目前，對(duì)IL-33 在炎性疾病中的確切作用機(jī)制仍不清晰，有待進(jìn)一步研究。

本研究擬采用LPS 構(gòu)建膿毒癥所致AKI 小鼠模型，探索IL-33在AKI中的作用及其可能的機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物和試劑

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重（22±3）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；IL-33 購(gòu)自Enzo Life Sciences；LPS購(gòu)自Sigma；IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒購(gòu)自Invitrogen；蛋白提取試劑盒購(gòu)自蘇州碧云天生物技術(shù)研究中心；抗IL-1β、IL-6、TNF-α、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、IL-33 和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗體均購(gòu)自Abcam；相應(yīng)Ⅱ抗購(gòu)自Proteintech。

2 動(dòng)物模型

小鼠飼養(yǎng)在南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理中心，光照/黑暗周期為12 小時(shí)，飲水和食物自由。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在（22±3）℃，濕度保持在（54±6）%。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)環(huán)境約7 d。然后將小鼠隨機(jī)分為3組：（1）control組（n=8）：小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均給予腹腔注射磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS），不使用其他試劑；（2）LPS 組（n=8）：小鼠腹腔注射等體積的PBS，6 h 后再注射LPS（10 mg/kg），24 h 后處死小鼠；（3）LPS+IL-33 組（n=8）：小鼠先腹腔注射IL-33（50 μg/kg），6 h 后再注射LPS（10 mg/kg），24 h 后處死小鼠。注射試劑的方式和劑量參照以前的研究［16-17］。小鼠處理流程總結(jié)見(jiàn)圖1。所有小鼠的處理均經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)均按照相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行。

Figure 1.A summary of treatment procedure in mice.PBS：phosphate-buffered saline；LPS：lipopolysaccharide；IL-33：interleukin-33.圖1 小鼠處理流程總結(jié)示意圖

3 SCr和BUN測(cè)定

處死小鼠后，用真空管從右心室取得全血。然后用離心機(jī)在4 ℃、4 000×g離心30 min，提取出血清。采用BS-800化學(xué)分析儀（邁瑞公司）自動(dòng)檢測(cè)各組腎損傷標(biāo)志物SCr和BUN水平。

4 ELISA法檢測(cè)血清中炎癥因子水平

血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的檢測(cè)采用相應(yīng)的ELISA 試劑盒。具體操作流程按試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行。

5 HE染色

收集的腎組織立即用4%甲醛固定，經(jīng)酒精脫水后，采用石蠟包埋（5μm），然后用蘇木精/伊紅染色，最后用光學(xué)顯微鏡觀察組織切片。腎損傷評(píng)分用于評(píng)估腎損傷程度。

6 Western blot法檢測(cè)相應(yīng)蛋白表達(dá)變化

采用蛋白提取試劑盒提取腎組織的總蛋白溶液，按比例將總蛋白溶液和上樣緩沖液均勻混合，置于100 ℃水中10 分鐘使其變性，蛋白上樣量為50μg。使用10%的SDS-PAGE 分離總蛋白，然后將分離的蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，最后用5%的牛奶封閉該膜1 h。特定的蛋白條帶采用相應(yīng)的一抗在4 ℃冰箱中孵育約24 h，取出后用相應(yīng)的二抗在室溫條件下孵育約1 h。最后，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和相應(yīng)的掃描儀來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 LPS能增加腎組織中IL-33的表達(dá)

如圖2 所示，小鼠腎組織IL-33 蛋白表達(dá)水平在LPS 刺激后顯著增加。該結(jié)果證明，IL-33 的表達(dá)與LPS的刺激密切相關(guān)。

Figure 2.The protein expression of interleukin-33（IL-33）was markedly up-regulated by stimulation of lipopolysaccharide（LPS）.The protein expression of IL-33 was detected by Western blot.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group.圖2 LPS能增加小鼠腎組織中IL-33的表達(dá)

2 IL-33預(yù)處理顯著加重LPS誘導(dǎo)的AKI

如圖3A、B所示，與control組相比，LPS組中小鼠BUN 和SCr 水平在LPS 刺激后顯著升高；而給予IL-33 預(yù)處理后，LPS+IL-33 組小鼠BUN 和SCr 水平進(jìn)一步升高，表明IL-33 預(yù)處理可明顯加重LPS 刺激引起的AKI。同時(shí)，ELISA 檢測(cè)結(jié)果如圖3C～E 所示，血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平變化與BUN 和SCr 的變化一致，說(shuō)明IL-33 預(yù)處理能明顯加重LPS刺激引起的全身炎癥反應(yīng)。上述結(jié)果提示，IL-33 預(yù)處理可顯著加重LPS誘導(dǎo)的AKI。

3 IL-33預(yù)處理加重LPS所致小鼠腎組織病理?yè)p傷

如圖4 所示，與control 組相比，LPS 組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)明顯被破壞，腎組織水腫明顯，而IL-33 預(yù)處理顯著增強(qiáng)了LPS 的腎損傷作用。該結(jié)果提示，IL-33 預(yù)處理能顯著加重LPS 刺激所致的腎組織病理?yè)p傷。

4 IL-33預(yù)處理通過(guò)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)加重LPS誘導(dǎo)的AKI

如圖5 所示，與control 組相比，LPS 組小鼠腎組織中炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3）表達(dá)水平顯著升高，而給予IL-33 預(yù)處理后，小鼠腎組織中炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3）表達(dá)水平進(jìn)一步升高。上述結(jié)果表明IL-33 預(yù)處理可通過(guò)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重LPS誘導(dǎo)的AKI。

5 IL-33預(yù)處理通過(guò)進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)炎癥反應(yīng)

如圖6 所示，與control 組相比，LPS 組小鼠腎組織NF-κB p65 磷酸化水平顯著升高，而IL-33 預(yù)處理后NF-κB p65 磷酸化水平進(jìn)一步升高。這一結(jié)果表明，IL-33 預(yù)處理可能是通過(guò)進(jìn)一步激活NF-κB 信號(hào)通路增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。

討 論

AKI 是一種以腎功能損害為特征的復(fù)雜性疾病。根據(jù)之前的研究顯示，急性腎功能衰竭（acute kidney failure，AKF）的主要病因是膿毒癥，而膿毒癥與AKI 的結(jié)合使AKF 的死亡率從45%顯著提高到70%［1，18］。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明AKI 患者在長(zhǎng)期可能發(fā)展成為CKD［5］。然而，迄今為止尚無(wú)有效的AKI 治療策略，所有亟需我們進(jìn)一步探索膿毒性AKI的發(fā)病機(jī)制，并研究新的預(yù)防和治療措施。

Figure 3.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）aggravated the renal dysfunction and systemic inflammation of acute kidney injury mice induced by lipopolysaccharide（LPS）.A and B：the levels of renal injury biomarkers，blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（SCr）；C，D and E：the serum levels of inflammatory cytokines，IL-1β，IL-6 and tumor nwcrosis factor-α（TNF-α），were assessed by ELISA kits.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖3 IL-33預(yù)處理加重LPS誘導(dǎo)的AKI小鼠腎功能不全和全身炎癥反應(yīng)

Figure 4.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）aggravated the histopathological injury of kidney tissues induced by lipopolysaccharide（LPS）.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖4 IL-33預(yù)處理加重LPS所致腎組織病理?yè)p傷

IL-33，也被稱(chēng)為IL-1F11 和NF-HEV，于2005 年首次被確定為IL-1 家族的新成員［19-20］。與傳統(tǒng)的細(xì)胞因子不同，IL-33 對(duì)炎癥反應(yīng)具有雙重作用，這主要是由于IL-33 的不同存在形式（如細(xì)胞內(nèi)核因子或細(xì)胞因子）［21］。當(dāng)IL-33 作為細(xì)胞內(nèi)核因子時(shí)，它可以隔離轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，從而抑制NF-κB 表達(dá)，最終減輕炎癥反應(yīng)［22］。而作為細(xì)胞因子時(shí)，IL-33 可通過(guò)與ST2 受體結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。IL-33 和ST2 受體結(jié)合對(duì)不同T 細(xì)胞的分化和功能產(chǎn)生顯著影響，尤其是調(diào)節(jié)2 型免疫應(yīng)答。例如，IL-33 可以增加Th2免疫細(xì)胞的數(shù)量，并促進(jìn)Th2 細(xì)胞的細(xì)胞因子或趨化因子的過(guò)度表達(dá)，如IL-13、IL-9 和IL-5［23］。IL-33還可以促進(jìn)Th1 細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，表現(xiàn)出抗病毒作用［24-25］。另?yè)?jù)報(bào)道，IL-33 可通過(guò)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)從而加重LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷［14］。而其他一些研究表明，IL-33 在某些炎癥性疾病中具有保護(hù)作用［15］。因此，IL-33 的確切作用機(jī)制仍不明確。在本研究中，我們探討了IL-33 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠AKI的影響。

Figure 5.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）enhanced renal inflammation induced by lipopolysaccharide（LPS）.The protein expression of IL-1β，IL-6，tumor nwcrosis factor-α（TNF-α）and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3（NLRP3）in kidney tissues was detected by Western blot.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖5 IL-33預(yù)處理能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重LPS誘導(dǎo)的AKI

Figure 6.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）enhanced inflammation by expediting the activation of nuclear factor-κB（NF-κB）signaling pathway.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs lipopolysaccharide（LPS）group.圖6 IL-33預(yù)處理通過(guò)進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)炎癥反應(yīng)

在本研究中，我們探討了IL-33 對(duì)LPS 刺激引起AKI 的影響，并進(jìn)一步深入研究了其可能存在的分子機(jī)制。多項(xiàng)研究表明，IL-33 的表達(dá)與LPS 的刺激密切相關(guān)，我們的研究再次證實(shí)了IL-33 的表達(dá)與LPS 的刺激密切相關(guān)。我們構(gòu)建了LPS 刺激誘導(dǎo)的AKI模型小鼠，以IL-33預(yù)處理后，血清BUN和SCr水平進(jìn)一步升高，表明IL-33 能使LPS 所致AKI 的腎功能進(jìn)一步受損。同時(shí)，IL-33 預(yù)處理后，血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 等炎癥因子水平也進(jìn)一步增加，表明IL-33 能明顯加重LPS 刺激引起全身炎癥反應(yīng)。HE染色結(jié)果顯示，LPS刺激破壞了腎臟結(jié)構(gòu)，腎組織出現(xiàn)水腫，而IL-33 預(yù)處理進(jìn)一步增強(qiáng)了這種作用。我們還發(fā)現(xiàn)，IL-33 預(yù)處理顯著加重了AKI 的炎癥水平，表現(xiàn)為炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3的蛋白表達(dá)水平比單純LPS 刺激增加更為顯著。最后，我們研究了IL-33 在NF-κB 信號(hào)通路中的作用，結(jié)果表明，IL-33 預(yù)處理可進(jìn)一步激活NF-κB 信號(hào)通路。所有這些數(shù)據(jù)表明，IL-33 可通過(guò)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)加重LPS誘導(dǎo)的AKI，其分子機(jī)制可能是進(jìn)一步激活了腎臟NF-kB信號(hào)通路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-33 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AKI具有加重?fù)p傷的作用。進(jìn)一步研究提示IL-33 能通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)加重LPS誘導(dǎo)的AKI，其分子機(jī)制可能是進(jìn)一步促進(jìn)了腎臟NF-kB 信號(hào)通路的激活。本研究提示IL-33 可能成為膿毒癥所致AKI 或者其他腎臟炎性疾病的新干預(yù)靶點(diǎn)。