李海濤，蔡 飛，胡國富，滕云飛

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北武漢 430000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以血管內皮細胞損傷、慢性炎癥、氧化應激失衡及脂質代謝障礙等為主要特征的慢性疾病［1］。在AS發(fā)展的初期進程中單核細胞通過向內膜遷移聚集以分化成巨噬細胞。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）是AS 發(fā)生及發(fā)展進程中的關鍵因子，巨噬細胞通過其細胞膜上的跨膜蛋白如清道夫受體A（scavenger receptor-A，SR-A）、CD36等過度攝取ox-LDL，變成膽固醇負載的泡沫細胞［2］。泡沫細胞可以通過分泌炎癥細胞因子如白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，增強局部炎癥反應，促進斑塊不穩(wěn)定從而加重AS［3-4］。miRNA 是一種高度保守的長為20 個左右核苷酸序列的非編碼單鏈小分子RNA，其能通過靶向mRNA 而介導基因轉錄后水平的調節(jié)。近年來大量文獻證明，微小RNA（microRNA，miRNA）在AS 的發(fā)生發(fā)展進程中有著極其關鍵的作用［5］。miRNA-218-5p 與肺癌、宮頸癌、骨肉瘤、結腸癌及前列腺癌等癌癥的發(fā)生緊密相關［6］。文獻表明，miRNA-218-5p在AS患者外周血中的表達顯著下降，可以作為AS 臨床診斷的生物標志物［7-8］。但miRNA-218-5p 在AS 中的作用尚未有明確的闡述。高遷移率族盒蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種DNA 結合蛋白，在炎癥調節(jié)過程中有著極為關鍵的作用。研究表明，HMGB1 信號通路在AS 疾病中被異常激活，且通過調控炎癥因子的表達而影響疾病的進展［9］。另外，我們通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)HMGB1 為miRNA-218-5p 的預測靶點。鑒于此，本研究通過構建RAW264.7 小鼠巨噬細胞源性泡沫細胞模型探討miRNA-218-5p 對泡沫細胞形成及HMGB1信號通路的影響。

材料和方法

1 細胞、試劑和儀器

RAW264.7 細胞（貨號：CL-0190）購自武漢普諾賽公司。

miRNA-218-5p mimics、miRNA mimics control、HMGB1-3' 端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'UTR）野生型（wild-type，WT）報告質粒及HMGB1-3'UTR 突變型（mutant，MUT）報告質粒均購自上海吉瑪生物有限公司；Lipofectamin 2000 轉染試劑（貨號：11668027）購自Invitrogen；ox-LDL、蛋白提取試劑盒及BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：IO1300、BC3711 和PC0020）均購自北京索萊寶生物有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：RG027）購自上海碧云天生物公司；小鼠IL-1β、IL-6 和TNFα ELISA 檢測試劑盒（貨號：CSB-E08054m、CSBE04639m 和CSB-E04741m）均購自武漢華美生物科技有限公司；兔抗小鼠GAPDH、HMGB1、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 多克隆抗體（貨號：10494-1-AP、10829-1-AP、19811-1-AP 和10745-1-AP）均購自武漢三鷹生物有限公司；兔抗小鼠p-NF-κB p65單克隆抗體（貨號：3033）購自Cell Signaling Technology。

離心機購自Eppendorf；PCR 儀購自Applied Biosystems；超低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自Sanyo。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7 細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中生長，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況2～3 d 傳代1 次，用0.25%胰酶消化，取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

2.2 細胞轉染 將對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞（1×106個）接種于6 孔板中，細胞生長密度至70%～90%時，根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書分別轉染miRNA-218-5p mimics及miRNA mimics control。

2.3 油紅O 染色 實驗分為4 組：對照組、模型組、miRNA mimics 組及miRNA NC 組。對照組細胞正常培養(yǎng)；模型組細胞采用80 mg/L ox-LDL 誘導24 h 建立泡沫細胞模型；miRNA mimics 組及miRNA NC 組分別轉染miRNA-218-5p mimics 及miRNA mimics control 24 h 后再用80 mg/L ox-LDL 誘導24 h 建立泡沫細胞模型。將細胞接種在鋪有蓋玻片的6 孔板中，ox-LDL 誘導處理細胞24 h 后除去培養(yǎng)液，用PBS沖洗細胞后4%多聚甲醛固定10 min，用新鮮配制的油紅O染液室溫下孵育15 min后，PBS沖洗后甘油封片，顯微鏡下觀察拍照。

2.4 ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-6 及TNF-α 表達量 ox-LDL 誘導處理細胞24 h 后收集各組細胞，分別采用IL-1β、IL-6 及TNF-α 的ELISA 試劑盒檢測細胞中相應細胞因子的表達水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.5 qPCR 檢測 ox-LDL 誘導處理細胞24 h后收集各組細胞，按照TRIzol 試劑盒中說明書的步驟提取樣本總RNA，通過逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。miRNA-218-5p 的上游引物序列為5'-GCCGAGTTGTGCTTGATCTAA-3'，下游引物序列為5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；內參照U6 的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。qPCR的總體積為20μL：10μL 的PCR 預混液，上、下游引物各0.8 μL，7.4 μL 的超純水，1.0 μL 的模板。采用三步法進行qPCR，具體如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個循環(huán)。每個樣品做3 次重復檢測。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達情況。

2.6 Western blot 檢測 ox-LDL 誘導處理細胞24 h后收集對照組、模型組、miRNA mimics 組及miRNA NC 組細胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒步驟提取細胞總蛋白。然后定量30 μg 進行SDS-PAGE，轉移至PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入Ⅰ抗（GAPDH 抗體，1∶10 000 稀釋；HMGB1 抗體，1∶500稀釋；TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65抗體，1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次后，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（1∶5 000 稀釋），室溫下孵育2 h，TBST清洗4次。加入ECL化學發(fā)光顯影后掃描膠片，采用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶的灰度值/內參照GAPDH條帶的灰度值。

2.7 雙螢光素酶實驗 實驗分為4 組：HMGB1-3'UTR-WT+miRNA NC 組（RAW264.7 細胞共轉染HMGB1-3'UTR-WT 報告質粒和miRNA mimics control）、HMGB1-3'UTR-WT+miRNA-218-5p mimics 組（RAW264.7 細胞共轉染HMGB1-3'UTR-WT 報告質粒和miRNA-218-5p mimics）、HMGB1-3'UTR-MUT+miRNA NC組（RAW264.7細胞共轉染HMGB1-3'UTRMUT 報告質粒和miRNA mimics control）和HMGB1-3'UTR-MUT+miRNA-218-5p mimics組（RAW264.7細胞共轉染HMGB1-3'UTR-MUT 報告質粒和miRNA-218-5p mimics）。轉染48 h 后參照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作步驟進行檢測，計算螢光素酶相對活性（螢火蟲螢光素酶/海腎螢光素酶）。

3 統(tǒng)計學處理

通過SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 油紅O 染色觀察各組RAW264.7 細胞內脂質變化

油紅O 染色結果顯示，與對照組相比，模型組RAW264.7 細胞經過80 mg/L 的ox-LDL 誘導24 h 后可見細胞中存在大量紅色脂滴，表明成功建立了RAW264.7 細胞源性泡沫細胞模型；與模型組相比，miRNA mimics組RAW264.7細胞源性泡沫細胞內脂滴染色較淡，見圖1。

Figure 1.Changes of intracellular lipids in RAW264.7 cell-derived foam cells of each group（oil red O staining，×400）.圖1 各組RAW264.7細胞源性泡沫細胞內脂質變化

2 ELISA 試劑盒檢測各組細胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α表達量

與對照組相比，模型組RAW264.7 細胞中IL-1β、IL-6及TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，miRNA mimics 組RAW264.7 細胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），而miRNA NC 組RAW264.7 細胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平無顯著變化（P＞0.05），見圖2。

3 qPCR檢測各組細胞中miRNA-218-5p的表達

與對照組相比，模型組RAW264.7 細胞中miRNA-218-5p 表達水平均顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，miRNA mimics 組RAW264.7細胞中miRNA-218-5p表達水平顯著上升（P＜0.05），而miRNA NC 組RAW264.7 細胞中miRNA-218-5p 表達水平無顯著變化（P＞0.05），見圖3。

Figure 2.Changes of IL-1β，IL-6 and TNF-α expression levels in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖2 各組細胞中IL-1β、IL-6及TNF-α表達量變化

Figure 3.Changes of miRNA-218-5p expression in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖3 各組細胞中miRNA-218-5p表達量變化

4 Western blot 檢測各組細胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平

與對照組相比，模型組RAW264.7 細胞中HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），NF-κB p65 無顯著變化（P＞0.05）；與模型組相比，miRNA mimics 組RAW264.7 細胞中HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），NF-κB p65無顯著變化（P＞0.05），而miRNA NC 組RAW264.7 細胞中HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 和NF-κB p65 蛋白水平均無顯著變化（P＞0.05），見圖4。

Figure 4.The protein levels of HMGB1，TLR4，NF-κB p65 and p-NF-κB p65 in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖4 各組細胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65 和p-NF-κB p65蛋白水平的變化

5 雙螢光素酶報告基因實驗檢測miRNA-218-5p對HMGB1的靶向作用

經TargetScan（http：//www.targetscan.org/）預測，HMGB1-3'UTR 具有miRNA-218-5p 高度保守的結合位點，見圖5A。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，與HMGB1-3'UTR-WT+miRNA NC 組相比，HMGB1-3'UTR-WT+miRNA-218-5p mimics 組螢光素酶活性顯著下降（P＜0.05），而HMGB1-3'UTR MUT+miRNA NC 組與HMGB1-3'UTR MUT+miRNA-218-5p mimics 組中螢光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見圖5B。

討 論

Figure 5.Targeting relationship between miRNA-218-5p and HMGB1.A：TargetScan prediction result；B：relative luciferase activity in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs miRNA NC group.圖5 miRNA-218-5p對HMGB1的靶向作用

AS 是一種常見的慢性疾病，主要特點為動脈血管管腔在粥狀脂質斑塊沉積作用下變窄引起血流不暢，最終造成起下游組織缺血性損傷。AS 不僅直接危害機體健康，還能引發(fā)動脈瘤，主動脈夾層以及冠狀動脈疾病等一系列高危疾病，具有較高的發(fā)病率及致死率，而且治療難度大，治療成本高［10］。隨著人們生活水平的逐漸提高，中老年人對于高脂食物的過量攝入，使AS 己成為中老年人容易患病的主要疾病之一。據(jù)文獻報道，2020年全球頸AS預估有近20億人，而估算我國可能有近2.7 億的患者，而且呈逐年上升的趨勢［11］。目前，臨床上對于AS 的治療一般通過調節(jié)機體反應降低體內血脂水平為主，治療藥物種類一般分為他汀類、煙酸類、貝特類及膽酸螯合劑類藥物等。這類藥物雖然對AS 具有一定的治療作用，但是也存在許多副作用，如損傷肝臟功能、導致胃腸道消化不良、過敏反應等［12］。因此尋找開發(fā)AS 疾病中的新型有效治療靶點極其重要。miRNA是近年來研究非常熱門的非編碼單鏈小分子RNA，miRNA 能通過與其相應mRNA 靶標堿基配對從而引導沉默復合體以降解mRNA 或阻止其翻譯的方式導致mRNA 沉默［13］。大量研究者證實，miRNA 影響著AS 的進程及其可以作為診治AS 疾病中的靶點［14］。文獻表明，miRNA-218-5p在AS臨床患者外周血中表達顯著下降，其可以作為AS 臨床診斷的生物標志物［7-8］。本研究中通過qPCR 結果也發(fā)現(xiàn)在ox-LDL 誘導的RAW264.7 細胞源性泡沫細胞中miRNA-218-5p表達水平下降。另外本研究中油紅O 染色結果表明提高miRNA-218-5p 表達水平能抑制RAW264.7細胞源性泡沫細胞形成。而巨噬源性泡沫細胞的形成是AS 疾病進程的初始環(huán)節(jié)。在AS 疾病初期，巨噬細胞通過大量攝取ox-LDL 形成了泡沫細胞，后期泡沫細胞的過度沉積能導致AS 初期形狀不規(guī)則病理脂質條紋的出現(xiàn)，從而導致脂質斑塊的形成［3］。所以miRNA-218-5p 能抑制泡沫細胞形成可作為其能防止AS發(fā)生發(fā)展的重要手段。

自Ross提出AS的炎癥學說以來，炎癥反應已被證實于AS 的發(fā)病機制中至關重要。大量研究文獻證明AS病灶處有大量炎癥因子存在，進而推進了AS的發(fā)展進程［15］。HMGB1 炎癥通路于炎癥刺激和調節(jié)中有著極為關鍵的作用［16］。HMGB1 是一種高度保守的核DNA 結合蛋白，在細胞核中作為轉錄因子調控下游基因的轉錄表達。同時HMGB1 也是損傷相關模式分子家族主要成員之一，可從免疫細胞自主分泌或從損傷的細胞被動轉移到胞漿或胞外，通過作用于細胞膜上晚期糖基化終末產物受體和Toll樣受體如TLR4的激活完成信號傳導過程，這些激活的受體能進而引發(fā)NF-κB 的活化從而誘導炎癥反應［17-18］。近年來大量文獻證實HMGB1信號通路介導了AS疾病的進展。de Souza 等［19］的研究表明，HMGB1 在AS 病變組織的巨噬細胞和平滑肌細胞中表達顯著增加，并與AS 脂質斑塊的形成有關。Xiao等［20］的研究表明，對ApoE基因敲除的AS小鼠給予丙酮酸乙酯治療能阻斷HMGB1 的表達進而減少其下游炎癥因子表達，從而抑制小鼠AS 的發(fā)展進程。Li等［21］的研究表明，HMGB1 是miR-141-5p的靶標，miR-141-5p 通過靶向HMGB1 通路抑制AS 中血管平滑肌細胞的炎癥、增殖和遷移。所以，針對HMGB1炎癥途徑可能是診治AS 疾病的有效策略。本研究中，通過miRNA-218-5p mimics 提高RAW264.7 細胞源性泡沫細胞中miRNA-218-5p 表達水平能抑制HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、IL-1β、IL-6 及TNF-α 表達，同時雙螢光素酶報告基因實驗也表明了miRNA-218-5p 能直接靶向結合HMGB1 的3'UTR 從而調控其表達。上述結果提示，RAW264.7 細胞源性泡沫細胞中HMGB1 通路被激活，而miRNA-218-5p 可抑制HMGB1 通路激活，進而減少RAW264.7 細胞源性泡沫細胞IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥因子分泌。

綜上所述，miRNA-218-5p 可以抑制RAW264.7細胞源性泡沫細胞的形成，調節(jié)HMGB1通路減少炎癥因子分泌，減輕細胞炎癥反應，對防治AS 疾病有重要的意義。