魯 艷，黃 瑤，葉姿妤，周麗倩，劉欣嵐，丁 祥，侯怡鈴*

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川 南充 637009；2.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 四川 南充 637009）

多糖是一種天然高分子聚合物，與蛋白質(zhì)和多核苷酸類似，是生命活動(dòng)中必不可少的大分子[1]。近年來，從天然資源如植物、動(dòng)物、真菌和海藻中分離的多糖因其廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗炎作用日益受到關(guān)注，特別是多糖的抗腫瘤作用吸引了越來越多科學(xué)家的注意[2]。腫瘤已經(jīng)成為了危害人類最大的疾病之一，常規(guī)療法會(huì)引起一系列的不良反應(yīng)，而多糖的抗腫瘤作用相對(duì)安全。研究發(fā)現(xiàn)，地榆多糖對(duì)小鼠S180腫瘤的抑制率可達(dá)到56.5%[3]，乳菇多糖(LEP)對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑瘤率能達(dá)到66.31%，并且這兩種多糖對(duì)S180細(xì)胞均無毒性[4]；海洋真菌多糖(YCP)對(duì)小鼠移植性瘤S180、Heps和Lewis的抑制率能達(dá)到43%左右且對(duì)小鼠無毒副作用[5]。羊肚菌Morchella esculenta具有非常高的藥食兩用價(jià)值，分子量為1 000 kDa的羊肚菌多糖(半乳甘露聚糖)能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活化[6]。分子量為53.3 kDa的羊肚菌發(fā)酵雜多糖(MEP-II)能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系HepG2凋亡并能通過減少自由基的產(chǎn)生來幫助治療肝癌[7]。分子量為81.8 kDa的羊肚菌多糖(MEP)能夠抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖和生長，且呈時(shí)間和劑量依賴性[8]。在我們的前期研究中，從羊肚菌中分離純化得到一種平均分子量為16.3 kDa的羊肚菌多糖，命名為ME-X。ME-X由甘露糖、葡萄糖、半乳糖，比例為4∶4∶1；且具有（2,4→6）-α-D-吡喃甘露糖主鏈骨架，細(xì)胞活性試驗(yàn)證實(shí)ME-X能夠促進(jìn)Raw264.7、Jurkat和Raji細(xì)胞增殖[9-10]，但ME-X能否抑制腫瘤，若能，其抑制腫瘤的分子機(jī)制還未解決。

本研究主要通過構(gòu)建小鼠S180肉瘤模型結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序分析，探索研究羊肚菌多糖抑制小鼠S180腫瘤過程中可能涉及的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，擬為分子水平上揭示羊肚菌多糖的抗腫瘤機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

羊肚菌多糖(ME-X)分離純化自四川省阿壩藏族自治州小金縣羊肚菌，S180小鼠腫瘤細(xì)胞購自四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。雌性昆明小鼠(KM)購自川北醫(yī)學(xué)院。

1.2 體內(nèi)抗小鼠S180腫瘤試驗(yàn)

雌性昆明小鼠在室溫(23±2)℃、通風(fēng)良好的環(huán)境下飼養(yǎng)。培養(yǎng)S180細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞配制成密度為2×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。隨機(jī)取4只小鼠，腹腔注射S180細(xì)胞懸液，喂養(yǎng)7 d至腹部腫大，抽取腹水收集細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞使其密度為4×106個(gè)/mL，腋下皮下多點(diǎn)注射到15只正常雌性昆明小鼠身上，100 μL/只。24 h后，將小鼠隨機(jī)平均分成3組，每組5只，分別為空白組(control組)、羊肚菌多糖組(ME-X組)、陽性對(duì)照組(甘露聚糖肽，Man組)。ME-X組每天按20 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)灌胃ME-X溶液100 μL，Man組每天灌胃20 mg/kg甘露聚糖肽100 μL，其余飼養(yǎng)條件均相同。連續(xù)給藥8 d后，處死小鼠，測量每只小鼠的體重并編號(hào)記錄，快速解剖小鼠取其免疫器官(包括肝、脾、胸腺)和腫瘤組織進(jìn)行稱重，并計(jì)算抑瘤率。計(jì)算方法如下:

式(1)中M1為ME-X組腫瘤重量的平均值或Man組腫瘤重量的平均值；M2為control組腫瘤重量的平均值。

1.3 總RNA提取、檢測及測序

提取上述3組小鼠的S180腫瘤組織總RNA，提取按照Trizol試劑操作說明書進(jìn)行。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA的降解程度和污染狀況進(jìn)行初步檢測，使用Nonodrop對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行精確檢測，使用Agilent2100對(duì)RNA的完整度進(jìn)行精確檢測。將上述檢測合格后的總RNA送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建，庫檢合格后進(jìn)行Illumina測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

對(duì)測序后得到原始測序數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行質(zhì)控，得到分析數(shù)據(jù)clean reads。采用subread軟件對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析；采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)反應(yīng)3組間基因表達(dá)水平的線性相關(guān)程度；采用clusterProfiler軟件對(duì)差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO富集分析、KEGG通路富集分析，閾值設(shè)置為Padj<0.05。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS中的單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間差異為P<0.05代表顯著，以“*”表示；P<0.01代表極顯著，以“**”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體內(nèi)抗小鼠S180腫瘤試驗(yàn)結(jié)果

體內(nèi)抗小鼠S180腫瘤試驗(yàn)結(jié)果(見表1和圖1)可知：在20 mg/kg的劑量下，小鼠的S180腫瘤組織的平均重量在ME-X組中為(0.48±0.12)g，在Man組中為(0.45±0.06)g，在 control組中為(0.96±0.20)g。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，ME-X能極顯著地降低小鼠S180腫瘤的重量，并且ME-X和Man對(duì)小鼠S180移植性腫瘤的抑制率分別為53.81%和50.32%。顯然，ME-X的抑瘤率略高于Man，且3組小鼠的體重、肝、脾及胸腺無顯著變化。

表1 ME-X體內(nèi)對(duì)小鼠S180腫瘤的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of ME-X on tumor of S180 mice in vivo

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

測序獲得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)去掉帶接頭和低質(zhì)量的reads后，control組獲得8.97G、Man組獲得8.35G、ME-X組獲得7.83G的clean reads。其中每個(gè)樣品的Q30(%)均大于93.4%，GC含量均在50%左右，堿基錯(cuò)誤率在0.03%，說明該測序結(jié)果高度可靠，可進(jìn)行下一步分析研究(見表2)。

表2 樣品組轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Quality assessment for sequencing data of transcriptome

2.3 基因表達(dá)水平分析

樣本組間基因表達(dá)水平皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果（見圖2A）表明ME-X組與Man組的基因表達(dá)水平相關(guān)性較高；而ME-X與control組之間的基因表達(dá)水平相關(guān)度較低，提示S180腫瘤細(xì)胞經(jīng)ME-X處理后其基因表達(dá)水平存在一定的變化。

圖2 皮爾遜相關(guān)性及差異表達(dá)分析Figure 2 Pearson correlation and differential expression analysis

通過RSEM軟件對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，當(dāng)FPKM>1，F(xiàn)PKM?60，F(xiàn)PKM<0.3分別被認(rèn)為基因有表達(dá)，高表達(dá)，表達(dá)較低或不表達(dá)。分析結(jié)果顯示control組中有12 203個(gè)基因表達(dá)(FPKM≥1)，約占基因總數(shù)的23.18%，其中1 052個(gè)基因高表達(dá)(FPKM≥60)，約占基因總數(shù)的2.00%。Man組中有12 240個(gè)基因表達(dá)(FPKM≥1)，約占基因總數(shù)的23.25%，其中1 028個(gè)基因高表達(dá)(FPKM≥60)，約占基因總數(shù)的1.95%。ME-X組中有13 006個(gè)基因表達(dá)(FPKM≥1)，約占基因總數(shù)的24.70%，其中961個(gè)基因高表達(dá)(FPKM≥60)，約占基因總數(shù)的1.83%。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在control組中有9個(gè)基因極高表達(dá)(FPKM>2 200)，包括：mt-Co1、Rplp1、Eef1a1、Rpl36、Rpl34-ps1、Lgals1、mt-Cytb、mt-Nd1、Rpl13；Man組中有9個(gè)基因?yàn)闃O高表達(dá)(FPKM>2 200)，包括：mt-Co1、Rplp1、Eef1a1、Rpl36、Lgals1、mt-Nd1、mt-Cytb、Rpl13、Rps2-ps10；ME-X組中有6個(gè)基因?yàn)闃O高表達(dá) (FPKM?2 200)，包括 ：mt-Co1、Rplp1、Eef1a1、mt-Nd1、mt-Cytb、Lgals1；詳見表3。

表3 3組中極高表達(dá)的基因(FPKM>2 200)Table 3 Quantification of gene expression in three groups(FPKM>2 200)

在以上篩選出的高表達(dá)基因中，mt-Co1、mt-Nd1、mt-Cytb在3組中同時(shí)高表達(dá)且均屬于線粒體基因[11-13]：所編碼的蛋白共同參與細(xì)胞氧化磷酸化過程[14-15]。其中值得關(guān)注的是mt-Co1，它的FPKM值在3組中均為最高：在ME-X組中為5 530.09、在Man組中高達(dá)6 760.32、在control組中為5 108.05。以上結(jié)果表明S180腫瘤細(xì)胞在ME-X的作用下，其氧化磷酸化釋放能量的過程與control組無太大差異但與Man組存在一定的差異。

此外，Rplp1、Eef1a1均在蛋白質(zhì)合成過程中發(fā)揮重要的作用[16-22]；對(duì)應(yīng)的FPKM值在ME-X組分別為3 058.59、2 731.75，在Man組分別為3 866.62、3 179.32，在control組分別為4 231.25、3 449.33——即FPKM值排序?yàn)镸E-X組

不僅如此，我們還篩選到Lgals1：它編碼半乳糖凝集素1[23-24]。該基因FPKM值在ME-X組中為2 214.15，低于Man組中的2 730.60和control組中的2 782.25，提示在ME-X的作用下，S180腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程均有所改變，且不同于Man組。

2.4 差異基因GO功能富集分析

差異基因GO功能富集分析結(jié)果顯示：ME-X抑制S180腫瘤生長的關(guān)鍵基因功能分類顯著富集在生物過程中的T細(xì)胞激活和獲得性免疫反應(yīng)過程，細(xì)胞組分中的質(zhì)膜外側(cè)和細(xì)胞外基質(zhì)，分子功能中G蛋白偶聯(lián)受體活性和細(xì)胞因子結(jié)合(見圖3A)。而Man抑制S180腫瘤的基因功能主要富集在生物過程中的吞噬作用、識(shí)別和循環(huán)免疫球蛋白介導(dǎo)的體液免疫(見圖3B)。這提示我們，與Man作用機(jī)制所涉及的關(guān)鍵基因門類不同，ME-X主要通過獲得性免疫中的細(xì)胞免疫來達(dá)到抑制S180腫瘤的目的。

圖3 差異表達(dá)基因GO和KEGG富集結(jié)果Figure 3 GO annotation and KEGG enrichment of DEGs

2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異表達(dá)基因(DEGs)分析

ME-X組和Man組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別與control組通過edgeR進(jìn)行差異表達(dá)基因(DEGs)分析，設(shè)定顯著差異表達(dá)的閾值為Padj<0.05、∣log2FoldChange∣>0.80。結(jié)果顯示，與control組相比：ME-X組中共存在3 150個(gè)差異基因，其中有2 774個(gè)基因上調(diào)，376個(gè)基因下調(diào)(見圖2B)，差異倍數(shù)較大的10個(gè)基因主要有Prlr、Cited1、Foxa1、Nlrp1c-ps、Slc7a10、Tmprss2、Btnl2、Cyp2e1、Fgg、Timp4(見表4)；而 Man組中共存在1 725個(gè)差異基因，其中有956個(gè)基因上調(diào)，769個(gè)基因下調(diào)(見圖2C)，差異倍數(shù)較大的10個(gè)基因主要有Prlr、Cited1、Foxa1、Pgr、Tmprss2、Cd200r4、Gzmd、Spint1、Myl2、Myh7(見表5)。

表4 ME-X組相較于control組的差異表達(dá)基因(前10)Table 4 DEGs of ME-X group vs control group（Top 10）

表5 Man組相較于control組的差異表達(dá)基因（前10）Table 5 DEGs of Man group vs control group（Top 10）

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Prlr、Cited1、Foxa1、Tmprss2在ME-X組和Man組中均上調(diào)。其中Prlr和Cited1上調(diào)最顯著：在ME-X組中兩基因的log2FoldChange分別為11.539 6、10.944 7；Man組中l(wèi)og2FoldChange值分別為10.674 9、10.237 8。Prlr編碼催乳素受體，Cited1則編碼一種CREB結(jié)合蛋白[25-27]。這兩個(gè)基因上調(diào)說明ME-X和Man能夠改變S180腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程，并且具有一定的相似性。

此外，F(xiàn)oxa1編碼DNA結(jié)合蛋白FOXA1，Timp4編碼金屬蛋白酶抑制劑TIMP4：兩者均能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，TIMP4還能特異性抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[28-31]。前者log2FoldChange在ME-X組為10.134 1、Man組為10.134 0；后者只在ME-X組上調(diào)，log2FoldChange為9.478 9。這說明ME-X不僅能以多種方式調(diào)節(jié)S180腫瘤細(xì)胞的凋亡，還能以不同的途徑來改變其增殖和遷移能力。Btnl2編碼主要組織相容性復(fù)合物[32-33]，它只在ME-X組中顯著性上調(diào)：log2FoldChange為10.335 3，提示ME-X能調(diào)節(jié)S180腫瘤小鼠T細(xì)胞的激活。

另外Cyp2e1編碼蛋白質(zhì)P450 2e1[34]，該基因只在ME-X組上調(diào)：log2FoldChange為9.982 7，提示ME-X能以不同的途徑催化S180小鼠體內(nèi)多種與藥物代謝和膽固醇、類固醇及其他脂質(zhì)合成有關(guān)的反應(yīng)來改變腫瘤細(xì)胞的代謝活動(dòng)。

2.6 差異基因KEGG信號(hào)通路富集分析

差異基因KEGG富集分析結(jié)果顯示：ME-X組相較于control組的差異基因中有1 202個(gè)成功富集并注釋在291條通路中；Man組相較于control組的差異基因中有545個(gè)成功注釋在262條通路中。這些差異基因均顯著富集在細(xì)胞黏附分子(CAMs)和細(xì)胞因子與其受體之間相互作用中(見圖3C、3D)，這表明ME-X抑制小鼠S180腫瘤的機(jī)制與Man具有相同之處。此外，ME-X組差異基因還顯著富集在NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用及PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中(見表6)，表明ME-X抑制小鼠S180腫瘤的機(jī)制與Man又存在較大差異。

表6 ME-X組中不同于Man組的KEGG富集結(jié)果Table 6 Different KEGG pathways enrichment of ME-X group vs Man group

對(duì)KEGG信號(hào)通路進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ME-X組富集在P13K-AKT信號(hào)通路中的差異基因最多，這說明P13K-AKT信號(hào)通路是ME-X抑制S180腫瘤最主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI3K-AKT信號(hào)通路是癌癥信號(hào)通路中非常重要的通路之一[35-36]。在ME-X作用下，該通路中表達(dá)顯著上調(diào)的基因包括Prlr、Col4a6、Fgfr2、Pck1、Ghr、Ntrk2、Myb、Fgf10、Ccnd2、Il2rb。Prlr、Fgfr2、Ghr、Ntrk2及Il2rb均編碼上游細(xì)胞膜受體蛋白：其中PRLR在該通路中主要負(fù)責(zé)識(shí)別催乳素；GHR主要與生長激素結(jié)合[37-38]。FGFR2主要識(shí)別成纖維細(xì)胞生長因子——如該通路中顯著上調(diào)的Fgf10[39]。這提示ME-X能夠通過上調(diào)表達(dá)膜受體蛋白來啟動(dòng)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和存活相關(guān)的信號(hào)。還有一些基因編碼下游的蛋白，比如Pck1和Myb：Pck1在葡萄糖缺乏肝癌細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)可增加肝癌細(xì)胞死亡[40]。而Myb過表達(dá)能增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的記憶形成、多功能性和回憶反應(yīng)，促進(jìn)過繼轉(zhuǎn)移后的治療性抗腫瘤免疫[41-42]。綜合以上結(jié)果表明P13K-AKT信號(hào)通路在ME-X抑制S180腫瘤細(xì)胞中承擔(dān)著非常重要的作用。

3 討論

羊肚菌多糖同其他真菌多糖一樣被證實(shí)具有抗氧化作用，不僅可以保護(hù)斑馬魚胚胎免受AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷[43]，還可以通過PI3K/AKT途徑減輕肺癌細(xì)胞A549氧化應(yīng)激[44]。此外，羊肚菌多糖還有抗炎作用[45]。更重要的是羊肚菌多糖能抑制腫瘤細(xì)胞增殖[8,46-48]，但其抗腫瘤機(jī)制還有待解決。

本次研究發(fā)現(xiàn)我們前期提純的新的羊肚菌多糖ME-X能夠抑制小鼠S180腫瘤生長，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析ME-X能夠顯著下調(diào)S180腫瘤細(xì)胞中與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因Rplp1和Eef1a1，上調(diào)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因Foxa1、Timp4等，這與體內(nèi)S180腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。且ME-X組中差異表達(dá)基因功能主要富集在T細(xì)胞激活門類下，表明ME-X能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，這與我們前期研究相一致[9]。

然而不同于蔡偉等人研究發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉總多糖與紫杉醇聯(lián)用是通過線粒體途徑和Wnt信號(hào)通路來抑制S180腫瘤生長[49]：本研究發(fā)現(xiàn)ME-X對(duì)線粒體基因表達(dá)影響不明顯，結(jié)合KEGG富集分析初步判斷PI3K-AKT信號(hào)通路是ME-X抑制S180腫瘤細(xì)胞的生長中最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

4 結(jié)論

綜上所述，羊肚菌多糖ME-X能夠通過上調(diào)Prlr、Ghr和Fgf10/Fgfr2等信號(hào)(圖4)，來激活PI3K，在細(xì)胞膜附近招募并磷酸化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3作為第二信使，激活下游底物，最終導(dǎo)致Pck1和Myb等上調(diào)，來調(diào)控小鼠的免疫過程并影響S180腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖及遷移，從而達(dá)到抑制S180腫瘤生長的目的。本研究為真菌多糖抗腫瘤機(jī)制探索提供了一定的理論依據(jù)。