黃華龍，宮喜雙，穆艷超，朱慧，謝巧婷

(安陽(yáng)市婦幼保健院 a.婦科；b.檢驗(yàn)科；c.病理科，河南 安陽(yáng) 455000)

卵巢癌具有早期癥狀隱匿、易轉(zhuǎn)移和化療后易耐藥的特點(diǎn)，在婦科惡性腫瘤中，其病死率居首位[1]，確診時(shí)約75%的患者已屬晚期[2]?，F(xiàn)有的治療方案不斷發(fā)展，但均未達(dá)到完全治愈，晚期卵巢癌患者的5 a生存率為20%～30%[3]，對(duì)女性的身體健康和生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。以往流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究表明，焦慮、抑郁、社會(huì)隔離等心理因素和生活習(xí)慣與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。該病尚缺乏有效的篩查手段，因此研發(fā)靈敏度和特異性高的早期診斷標(biāo)志物，有利于有效抑制卵巢癌進(jìn)展，對(duì)于降低卵巢癌患者病死率和提高5 a生存率具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)對(duì)于腫瘤具有調(diào)節(jié)作用。NA可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，如通過(guò)抑制T細(xì)胞對(duì)有絲分裂原刺激的反應(yīng)、削弱自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性等促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展[5]。另外，NA可直接作用于腫瘤細(xì)胞，上調(diào)促血管生成分子表達(dá)，加快腫瘤組織生長(zhǎng)和血管形成[6]，因此NA對(duì)卵巢癌的影響受到了廣泛關(guān)注。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選候選基因，并驗(yàn)證FOSB、JUNB、CD4、HLA-DRA基因在NA水平高的卵巢癌組織中表達(dá)異常。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取安陽(yáng)市婦幼保健院婦科2020年7月至2021年6月50例卵巢患者腫瘤組織作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理檢查確診為上皮來(lái)源的Ⅰ～Ⅱ期卵巢漿液性癌；(2)無(wú)其他主訴癥狀，輔助檢查無(wú)其他器官異常病變；(3)患者年齡為52～66歲。將術(shù)后組織NA≤1.00 ng·L-1的患者納入對(duì)照組，≥1.00 ng·L-1的患者納入試驗(yàn)組。對(duì)照組25例，年齡52～66(60.0±4.4)歲；試驗(yàn)組25例，年齡52～66(57.8±5.1)歲。兩組間臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究報(bào)請(qǐng)安陽(yáng)市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審議獲得批準(zhǔn)，患者均已知情并簽署知情同意書。

1.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理從National Center for Biotechnology Information(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)在線獲取高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)，系列號(hào)為GSE103737。GSE103737數(shù)據(jù)集共97例卵巢癌患者，NA≤1.00 ng·L-1的患者為對(duì)照組，≥1.00 ng·L-1的患者為試驗(yàn)組，取卵巢癌組織，抽提總RNA，按照Illumina作業(yè)指導(dǎo)書對(duì)RNA依次進(jìn)行片段化、修復(fù)端部、連接和建庫(kù)，使用Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip對(duì)文庫(kù)測(cè)序。

1.3 篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEG)篩選條件：|log2(fold change)|>1，且-log10P>-log100.05。其中，log2(fold change)>1即高表達(dá)，log2(fold change)<-1即低表達(dá)。

1.4 基因富集分析使用在線工具DAVID對(duì)差異表達(dá)基因富集情況和信號(hào)通路Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)進(jìn)行分析。使用DAVID在線工具計(jì)算各富集組的P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析進(jìn)入STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)主頁(yè)(https://cn.string-db.org)，點(diǎn)擊搜索，選擇多蛋白分析模式，將DEG列表導(dǎo)入在線搜索框，物種選擇為“Homo sapiens”，點(diǎn)擊提交進(jìn)行識(shí)別和在線分析，下載分析后的蛋白間的相互關(guān)系(protein- protein interaction，PPI)數(shù)據(jù)表格，置信度大于0.99篩選為候選基因。

1.6 組織NA水平檢測(cè)在冰盤上取腫瘤組織，加入預(yù)冰冷的1 mol·L-1的高氯酸溶液(20 mL·g-1組織)和2 g·L-1的3，4-二羥基芐胺(3,4-dihydroxybenzylamine，DHBA)(25 mL·g-1組織)，在研缽中加入液氮研磨，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心20 min，取上清用于分析。上清液pH值調(diào)制為6.0，加入0.2 g酚醛離子交換樹脂，震蕩10 min，吸出上清。在樹脂中加入1 mL蒸餾水洗滌，棄上清。取0.5 mol·L-1的HCl于試管中，混合10 min，洗提出組氨酸(Histamin，Hist)和NA，離心后取40 μL上清用于衍生反應(yīng)，取20 μL進(jìn)行色譜測(cè)定。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)取新鮮組織，在核酸提取儀上研磨組織，提取總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度儀檢測(cè)RNA濃度，OD260/OD280>1.90表示RNA純度良好，用于試驗(yàn)。Roche Titan One Tube RT-PCR試劑盒用于逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系為：1 μL Random Primer，3.5 μg RNA，加無(wú)酶水至25 μL。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-80 ℃冰箱。qPCR實(shí)驗(yàn)在Roche combas z480儀器上進(jìn)行，擴(kuò)增引物選購(gòu)于上海生工公司。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，每個(gè)基因3個(gè)平行孔，ACTB為內(nèi)參基因，擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min，(95 ℃ 15 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán))，37 ℃ 1 min。擴(kuò)增數(shù)據(jù)分析使用2-ΔΔCt法。引物序列見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中不同組織的DEG原始數(shù)據(jù)首先歸一化處理，共計(jì)110個(gè)DEG滿足篩選條件[|log2(fold change)|>1，且-log10P>-log100.05]，其中高表達(dá)12個(gè)，低表達(dá)98個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 符合篩選條件的DEG P值的負(fù)對(duì)數(shù)與倍數(shù)對(duì)數(shù)分布圖

2.2 DEG功能分布情況DAVID在線工具分析顯示DEG富集最多的10個(gè)信號(hào)通路為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、炎癥反應(yīng)通路、免疫反應(yīng)通路、凋亡通路、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因表達(dá)正調(diào)控通路、凋亡正調(diào)控通路、基因表達(dá)負(fù)調(diào)控通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和胞外基質(zhì)組織通路。見(jiàn)表2。

表2 GSE103737中DEG富集的信號(hào)通路情況

2.3 候選基因的篩選情況使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析DEG。在PPI關(guān)系網(wǎng)中，39個(gè)基因編碼蛋白PPI置信度大于0.99。見(jiàn)表3。符合篩選條件的39個(gè)基因列為候選基因，進(jìn)一步驗(yàn)證。

表3 GSE103737中DEG編碼蛋白PPI分析

2.4 候選基因驗(yàn)證結(jié)果在50例Ⅰ～Ⅱ期漿液性卵巢癌組織中驗(yàn)證39個(gè)候選基因，其中FOSB、JUNB、CD4、HLA-DRA表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余35個(gè)基因表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。試驗(yàn)組FOSBmRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)，JUNBmRNA、CD4mRNA、HLA-DRAmRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表4。驗(yàn)證基因表達(dá)散點(diǎn)圖見(jiàn)圖2。

表4 qPCR驗(yàn)證候選基因mRNA表達(dá)情況

圖2 驗(yàn)證基因表達(dá)情況

3 討論

近年來(lái)我國(guó)卵巢癌發(fā)病率與病死率總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但存在地區(qū)差異。城市女性卵巢癌發(fā)病率與病死率處于下降與平穩(wěn)狀態(tài)，農(nóng)村有逐年上升趨勢(shì)。卵巢癌的進(jìn)展機(jī)制尚未完全明確。以往研究表明，心理因素和生活習(xí)慣均與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[7]。探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物標(biāo)志物有助于實(shí)施精準(zhǔn)治療措施、及時(shí)明確其診斷、科學(xué)評(píng)價(jià)患者預(yù)后，對(duì)于保障患者的生命安全和提升患者的生活質(zhì)量具有重要意義。

本研究從生物信息學(xué)分析出發(fā)，在97例Ⅰ～Ⅳ期卵巢癌患者組織高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)110個(gè)基因滿足建立的篩選條件，在卵巢癌進(jìn)展過(guò)程中，表達(dá)發(fā)生變化的基因存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，共同協(xié)作完成腫瘤惡性行為的進(jìn)展，或相互拮抗實(shí)現(xiàn)機(jī)體的自我保護(hù)功能。篩選DEG利于從卵巢癌基因調(diào)控出發(fā)，開啟后續(xù)研究。本研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)及基因內(nèi)在聯(lián)系，數(shù)據(jù)顯示DEG富集最多信號(hào)通路涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凋亡、胞外基質(zhì)組織信號(hào)傳遞等。這些重要的生理功能在細(xì)胞生命周期中發(fā)揮著重要作用，信號(hào)通路發(fā)生失衡將影響正常的細(xì)胞周期活動(dòng)。炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凋亡等信號(hào)的失調(diào)對(duì)于卵巢癌的治療具有顯著影響，許多患者在一線治療完全緩解后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，且在后續(xù)化療周期中，患者復(fù)發(fā)時(shí)間間隔逐步縮短、化療藥物劑量限制性毒性顯著增加，最終導(dǎo)致患者對(duì)藥物敏感性降低，這也是卵巢癌患者治療失敗及死亡的主要原因[8]。

多種生物標(biāo)志物被驗(yàn)證在卵巢癌進(jìn)展中具有顯著作用，慢性應(yīng)激與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，交感神經(jīng)遞質(zhì)NA在卵巢癌中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和加快腫瘤血管形成的作用，干預(yù)NA途徑的特定靶基因有助于控制卵巢癌的進(jìn)展[9]。本文發(fā)現(xiàn)NA≥1.00 ng·L-1的試驗(yàn)組卵巢癌組織中FOSB基因相對(duì)表達(dá)量高于NA≤1.00 ng·L-1的對(duì)照組卵巢癌組織，JUNB、CD4、HLA-DRA基因相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組。以往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OSB基因在卵巢癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，NA可正向調(diào)控FOSB基因表達(dá)，NA高表達(dá)的患者腫瘤組織中FOSB基因表達(dá)進(jìn)一步提高，其表達(dá)產(chǎn)物可驅(qū)動(dòng)卵巢癌的增殖與轉(zhuǎn)移[10]，在體外實(shí)驗(yàn)中使用siRNA下調(diào)FOSB基因表達(dá)可降低卵巢癌的增殖與轉(zhuǎn)移行為。JUN家族成員有多個(gè)蛋白，在卵巢癌組織中可調(diào)控細(xì)胞增殖和血管生成[11]。本研究發(fā)現(xiàn)JUN家族成員JUNB在NA≥1.00 ng·L-1的試驗(yàn)組中表達(dá)減少，這對(duì)于卵巢癌患者是一項(xiàng)有利的指標(biāo)。CD4與HLA-DRA通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)參與腫瘤的進(jìn)展。CD4/CD8比值降低和CD8水平增高是免疫球蛋白G無(wú)應(yīng)答者個(gè)體化多肽接種后良好的預(yù)后指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)在NA≥1.00 ng·L-1的試驗(yàn)組中CD4表達(dá)減少，這將有助于降低CD4/CD8比值，有助于卵巢癌的治療。HLA-DRA在卵巢癌中被證實(shí)高表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌的惡性行為，本研究發(fā)現(xiàn)在NA≥1.00 ng·L-1的試驗(yàn)組中HLA-DRA表達(dá)減少，這將不利于卵巢癌細(xì)胞的惡行進(jìn)展。本研究提示，NA水平高的卵巢癌患者中，DEG對(duì)于腫瘤的惡性進(jìn)展調(diào)控作用并不一致，這將提示人們需要綜合調(diào)節(jié)卵巢癌中不同指標(biāo)，有效利用有利指標(biāo)并且合理抑制不利指標(biāo)，達(dá)到精準(zhǔn)治療目標(biāo)。

基因相關(guān)研究有望為探明卵巢癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供依據(jù)。本研究未建立動(dòng)物模型且樣本量較小，更大樣本量與動(dòng)物模型的建立將有助于深入研究基因表達(dá)差異、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制。