吳雨晗 吳 婷 涂 健 李 哲 盛婷婷 李 峰 姚皓洲

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230000)

我國(guó)作為畜禽生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥性問(wèn)題已嚴(yán)重影響到養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，直接或間接影響到公眾健康[1]。耐藥病菌引起畜禽疫病時(shí)將會(huì)更難治療，且會(huì)影響畜禽養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展[2]；畜禽食品中抗生素殘留也極易使人體產(chǎn)生過(guò)敏、耳聾及人體菌群失調(diào)導(dǎo)致的二次感染等不良反應(yīng)[3]。因此，尋找一種無(wú)毒副作用、無(wú)殘留的抗生素替代品已迫在眉睫。其中，益生菌可以克服抗生素所帶來(lái)的負(fù)面影響，具有廣闊的發(fā)展前景。

益生菌作為一種在適當(dāng)劑量下給宿主帶來(lái)健康益處的活微生物，主要種類(lèi)有乳酸菌、芽孢桿菌和酵母等[4]。芽孢桿菌可使胃腸道處于一種厭氧環(huán)境，導(dǎo)致需氧和兼氧性致病菌的數(shù)量減少[5]；酵母可分泌具有生物活性的酶，促進(jìn)腸道有益菌群的生長(zhǎng)[6]；乳酸菌既可通過(guò)自身代謝的產(chǎn)物抑制病原菌的活性，又可通過(guò)黏附性影響其免疫調(diào)節(jié)活性，保護(hù)宿主腸道健康[7]。雖然益生菌具有抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)等益生功能，但不同的菌株，即使為同一種屬，其功能也可能會(huì)有很大差別，再加之目前我國(guó)自主開(kāi)發(fā)的菌種很少，市售的益生菌相關(guān)產(chǎn)品中的菌株幾乎被國(guó)外菌株所壟斷[7]，所以篩選優(yōu)良的生產(chǎn)菌株是研制益生菌制品的關(guān)鍵步驟[8]。

因此，本試驗(yàn)旨在篩選出一株抗逆性強(qiáng)、抗菌效果好的乳酸菌，系統(tǒng)研究其環(huán)境耐受能力、抑菌能力、黏附能力、產(chǎn)酸能力以及生長(zhǎng)曲線，為抗生素替代提供助力，為開(kāi)發(fā)安全有效的益生菌微生態(tài)制劑或菌體產(chǎn)物相關(guān)免疫調(diào)節(jié)制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基、乳酸菌專(zhuān)用生化管(蔗糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、水楊苷、甘露醇、纖維二糖、棉子糖、七葉苷)購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司，溴甲酚綠購(gòu)于天津市廣復(fù)精細(xì)化工研究所，二甲苯購(gòu)于西隴化工股份有限公司，抗熒光淬滅封片劑購(gòu)于山東思科捷生物技術(shù)有限公司，異硫氰酸熒光素(FITC)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，革蘭氏染色液試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 樣品和菌株

豬糞來(lái)源于安慶六白豬，大腸桿菌CMCC 44102來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，沙門(mén)氏菌ATCC 9150、金黃色葡萄球菌ATCC 25923來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離鑒定

1.2.1.1 菌株的分離篩選

配制1%碳酸鈣(CaCO3)的MRS固體培養(yǎng)基，取豬糞1 g與1 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)混合，倍比稀釋后涂布于含有1% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，挑取其中有明顯溶鈣圈的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

將純化后的乳酸菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，按1%接種量接種于無(wú)菌MRS液體培養(yǎng)基中，于50 ℃水浴20 min，培養(yǎng)4 h后吸取200 μL至96孔板中，使用酶標(biāo)儀測(cè)定620 nm處的吸光度值(OD600)，計(jì)算其存活率。

乳酸菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，按1%接種量接種于pH=3的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h后吸取200 μL至96孔板中，測(cè)定OD600，計(jì)算其存活率。

乳酸菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，按1%接種量接種于含0.1%豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h后吸取200 μL至96孔板中，測(cè)定OD600，計(jì)算其存活率。

存活率計(jì)算公式[9]：

存活率(%)=(A-B)/(a-b)。

式中：A為處理后菌液培養(yǎng)4 h后的OD600；B為處理后菌液培養(yǎng)0 h的OD600；a為37 ℃靜置培養(yǎng)4 h的菌液的OD600；b為37 ℃靜置培養(yǎng)0 h的菌液的OD600。

根據(jù)以上3種耐受性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行初篩，耐受優(yōu)秀的乳酸菌采用凝膠打孔方法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，根據(jù)抑菌活性結(jié)果進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.1.2 菌株的鑒定

對(duì)篩選出來(lái)的菌株進(jìn)行生化管試驗(yàn)鑒定[10]。純化3次后挑取單菌落于1.5 mL EP管中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，使用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照2 μL菌液，8 μL Mix，1 μL引物27F，1 μL引物1492R，8 μL雙蒸水配制20 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16S rRNA反應(yīng)程序?yàn)閇11]：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，以上重復(fù)30個(gè)循環(huán)，終端延伸72 ℃ 10 min。

配制1.5%瓊脂糖凝膠，于1×TAE緩沖液中，以80 V、80 mA電泳30 min，使用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，產(chǎn)物送至上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得結(jié)果使用BLAST分析，使用MAGE 7.0繪制進(jìn)化樹(shù)。

1.2.1.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

于培養(yǎng)基上挑取單菌落，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，按1%接種量轉(zhuǎn)接至無(wú)菌的MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，每2 h測(cè)定菌液的OD600。

1.2.2 乳酸菌的環(huán)境耐受性評(píng)價(jià)

1.2.2.1 耐熱評(píng)價(jià)

菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，按1%接種量接種于無(wú)菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于40、50、60、70、80、90 ℃水浴15 min，培養(yǎng)4 h后吸取200 μL至96孔板中，測(cè)定OD600，計(jì)算其存活率，計(jì)算公式見(jiàn)1.2.1.1。

1.2.2.2 耐酸評(píng)價(jià)

菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，按1%接種量接種于pH=2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h后吸取200 μL至96孔板中，測(cè)定OD600，計(jì)算其存活率，計(jì)算公式見(jiàn)1.2.1.1。

1.2.3 乳酸菌的生物學(xué)功能評(píng)價(jià)

1.2.3.1 產(chǎn)酸能力測(cè)定

按1%接種量接種菌液至無(wú)菌的液體MRS中，培養(yǎng)24 h，每隔2 h測(cè)1次pH。

配制溴甲酚綠蛋白胨培養(yǎng)基，每升水加入蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，溴甲酚綠0.012 g，瓊脂15 g。凝固后使用打孔器打孔，每孔注入200 μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期菌液(pH=6.0)，當(dāng)pH變?yōu)?.6時(shí)固體培養(yǎng)基從藍(lán)綠色變成黃色。冰箱放置3 h后放入培養(yǎng)箱，過(guò)夜后觀察。

1.2.3.2 抑菌能力測(cè)定

于LB固體培養(yǎng)基按1%接種量加入OD600=1.0的大腸桿菌CMCC 44102、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、沙門(mén)氏菌ATCC 9150，輕搖混勻，凝固后使用打孔器打孔，每板一孔加入200 μL OD600=1.0的乳酸菌菌液，一孔加入離心過(guò)濾后的上清，最后一孔加入無(wú)菌的MRS液體培養(yǎng)基，于冰箱放置4 h后恢復(fù)室溫30 min，放入培養(yǎng)箱過(guò)夜即可觀察結(jié)果[12]。

1.2.3.3 疏水能力測(cè)定

將乳酸菌菌液5 000×g離心棄去上清，加入PBS清洗3次菌體，使用0.1 mol/L的KNO3重懸，調(diào)整OD600=0.5，取3 mL菌懸液+1 mL二甲苯靜置10 min，振蕩1 min，靜置30 min，取水相測(cè)定OD600，計(jì)算公式如下：

疏水性(%)=(1-OD600/0.5)×100。

1.2.3.4 自聚合能力測(cè)定

將乳酸菌菌液5 000×g離心棄去上清，加入PBS清洗3次菌體，使用PBS重懸，調(diào)整OD600=0.5，振蕩10 s，37 ℃靜置2 h，取上層清液測(cè)定OD600，計(jì)算公式如下：

自聚合性(%)=(1-OD600/0.5)×100。

1.2.3.5 共凝集能力測(cè)定

將各菌菌液調(diào)整OD600=0.5，取等量乳酸菌的菌懸液與大腸桿菌CMCC 44102、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、沙門(mén)氏菌ATCC 9150分別混合，室溫靜置，于0和18 h取上清液測(cè)OD600，計(jì)算公式如下：

共凝集性(%)=[0.5-OD600]/0.5×100。

1.2.4 乳酸菌的動(dòng)物飼喂試驗(yàn)

1.2.4.1 乳酸菌的腸道內(nèi)定植觀察

使用無(wú)菌PBS將FITC粉末稀釋為200 μg/mL的儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆茫瑢⑷樗峋囵B(yǎng)至對(duì)數(shù)期，4 ℃、5 000×g離心10 min，去上清，使用無(wú)菌PBS洗滌菌體3次，使用FITC儲(chǔ)備液重懸成109CFU/mL的菌懸液，避光37 ℃孵育2 h取出，使用無(wú)菌PBS洗滌其至無(wú)色，并使用PBS將其配制為109CFU/mL的菌懸液。

選擇20只小鼠，隨機(jī)分為2組，分別為飼喂菌液組和對(duì)照組，每組10只，公母各占1/2。飼喂菌液組小鼠灌胃被FICT標(biāo)記過(guò)的109CFU/mL菌懸液0.5 mL，對(duì)照組小鼠灌胃PBS稀釋后的FITC溶液0.5 mL，12 h后安樂(lè)處死小鼠并快速收集腸組織(0.5 mm×0.5 mm)，PBS避光清洗，放置于玻片上滴加1滴抗熒光猝滅劑，于上方輕輕蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察[13]。

1.2.4.2 乳酸菌誘導(dǎo)臟器指數(shù)變化觀察

選擇20只小鼠，隨機(jī)分為2組，分別為飼喂菌液組和對(duì)照組，每組10只，公母各占1/2。飼喂菌液組小鼠灌胃0.5 mL 109CFU/mL乳酸菌，對(duì)照組小鼠灌胃0.5 mL PBS，7 d后安樂(lè)處死小鼠并采集胸腺和脾臟，進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)。計(jì)算公式如下：

臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質(zhì)量(mg)/

小鼠質(zhì)量(g)。

1.2.4.3 乳酸菌生物安全性評(píng)價(jià)

選擇20只小鼠，隨機(jī)分為2組，分別為飼喂菌液組和對(duì)照組，每組10只，公母各占1/2。飼喂菌液組小鼠灌胃0.5 mL 109CFU/mL乳酸菌，對(duì)照組小鼠灌胃0.5 mL PBS，飼喂14 d后，觀察小鼠精神狀態(tài)、生病或死亡情況以及解剖腔(包括胸腔、腹腔與其中臟器)是否有病理變化。

1.3 數(shù)據(jù)的處理及分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行了6次重復(fù)試驗(yàn)，去最高與最低數(shù)據(jù)后，剩余數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離篩選與鑒定結(jié)果

2.1.1 初篩結(jié)果

從健康六白豬糞便中獲得了6株疑似乳酸菌，分別命名為T(mén)’-1、T’-2、J’-1、J’-3、Tβ、J’-4，對(duì)其進(jìn)行酸處理(pH=3)、熱處理(50 ℃)和膽鹽處理(0.1%)，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行初篩。由表1可見(jiàn)，J’-1、J’-3、Tβ、J’-4酸處理下的存活率顯著高于T’-2(P<0.05)，T’-1、Tβ、J’-4熱處理下的存活率顯著高于T’-2、J’-1、J’-3(P<0.05)，J’-1，Tβ，J’-4膽鹽處理下的存活率顯著高于T’-1(P<0.05)。綜合上述結(jié)果，挑選J’-1、Tβ、J’-4進(jìn)行復(fù)篩。

表1 酸處理、熱處理和膽鹽處理下菌株存活率

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果

從初篩結(jié)果挑選J’-1、Tβ、J’-4進(jìn)行抑菌試驗(yàn)復(fù)篩。由表2可見(jiàn)，3株菌株對(duì)大腸桿菌CMCC 44102、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、沙門(mén)氏菌ATCC 9150均有不同程度的抑制作用，J’-1、Tβ對(duì)大腸桿菌CMCC 44102的抑菌能力顯著高于J’-4(P<0.05)，Tβ對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 25923、沙門(mén)氏菌ATCC 9150的抑菌能力顯著高于J’-1、J’-4(P<0.05)。

表2 J’-1、Tβ、J’-4對(duì)不同致病菌的抑菌能力

2.1.3 形態(tài)特征及染色結(jié)果

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，挑取具有優(yōu)秀抗逆性和抑菌能力的Tβ進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由圖1可見(jiàn)，Tβ進(jìn)行3次純化培養(yǎng)之后于MRS固體培養(yǎng)基上可以觀察到白色濕潤(rùn)、邊緣光滑的菌落，菌落直徑在1～2 mm；革蘭氏染色鏡檢可以觀察到單個(gè)或成對(duì)存在的革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)芽孢和鞭毛，符合乳酸菌特征。

A：菌落形態(tài) colony morphology；B：革蘭氏染色鏡檢 Gram stain microscopy(1 000×)。

2.1.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

由圖2可見(jiàn)，通過(guò)通用引物(27F、1492R)對(duì)Tβ進(jìn)行擴(kuò)增，在1 500 bp處出現(xiàn)條帶。由圖3可見(jiàn)，通過(guò)核苷酸同源性比對(duì)，Tβ與約翰氏乳桿菌同源性高達(dá)99.50%。

1：Trans2K Plus DNA Ladder；2：Tβ；3：陰性對(duì)照 negative control。

Lactobacillus kitasatonis strain：北卡羅來(lái)納乳桿菌菌株；Lactobacillus amylovorus：淀粉乳桿菌；Lactobacillus gallinarum strain：雞乳桿菌菌株；Lactobacillus kefiranofaciens：雞乳桿菌；Lactobacillus hamsteri strain：哈姆斯特乳桿菌菌株；Lactobacillus amylolyticus：淀粉乳桿菌；Lactobacillus amylolyticus strain：淀粉乳桿菌菌株；Lactobacillus intestinalis strain：腸道乳酸桿菌菌株；Lactobacillus jenseni strain：詹森乳桿菌菌株；Lactobacillus rodentium strain：乳酸桿菌菌株；Lactobacillus hominis：人乳桿菌；Lactobacillus gasseri：格氏乳桿菌；Lactobacillus johnsonii strain：約氏乳桿菌菌株。

2.1.5 生理生化特性結(jié)果

由表3可見(jiàn)，通過(guò)形態(tài)觀察、染色結(jié)果、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果、生理生化試驗(yàn)結(jié)果綜合分析可知，該菌株為約翰氏乳桿菌。

表3 Tβ的生理生化鑒定結(jié)果

2.1.6 生長(zhǎng)曲線結(jié)果

由圖4可見(jiàn)，Tβ在4～8 h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，生長(zhǎng)較快，10 h開(kāi)始生長(zhǎng)速度下降，16 h之后進(jìn)入平穩(wěn)期。

圖4 Tβ生長(zhǎng)曲線

2.2 Tβ的環(huán)境耐受性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2.1 耐熱評(píng)價(jià)結(jié)果

由圖5-A可見(jiàn)，40 ℃熱處理之后的Tβ存活率為93.54%，50 ℃熱處理之后的Tβ存活率為73.09%，60 ℃熱處理之后的Tβ存活率為60.33%，說(shuō)明在60 ℃之前，溫度對(duì)于Tβ的存活與生長(zhǎng)沒(méi)有太大的影響。70 ℃熱處理之后的Tβ存活率為16.82%，80 ℃熱處理之后的Tβ存活率為15.05%，90 ℃熱處理之后的Tβ存活率為14.02%。70、80、90 ℃熱處理之后的Tβ存活率顯著低于40、50、60 ℃(P<0.05)。以上結(jié)果表明，70 ℃及以上較為不利于Tβ生長(zhǎng)，但是在90 ℃時(shí)Tβ依舊可以存活并且緩慢生長(zhǎng)，說(shuō)明此菌耐熱性較強(qiáng)。

2.2.2 耐酸評(píng)價(jià)結(jié)果

由圖5-B可見(jiàn)，pH為2.0培養(yǎng)時(shí)Tβ存活率為12.1%，pH為2.5培養(yǎng)時(shí)Tβ存活率為13.45%，pH為3.0培養(yǎng)時(shí)Tβ存活率為32.01%，pH為3.5培養(yǎng)時(shí)Tβ存活率為45.41%，pH為4.0培養(yǎng)時(shí)Tβ存活率為53.2%，而當(dāng)pH為4.5培養(yǎng)時(shí)Tβ存活率為60.13%，pH為5.0培養(yǎng)時(shí)Tβ存活率為68.47%。pH為4.0、4.5、5.0培養(yǎng)時(shí)Tβ存活率顯著高于pH為2.0、2.5、3.0培養(yǎng)時(shí)(P<0.05)。以上結(jié)果表明，pH為4.0～5.0時(shí)Tβ可正常生長(zhǎng)，而在pH為2.0時(shí)也有Tβ存活生長(zhǎng)，說(shuō)明Tβ的耐酸能力較為優(yōu)秀。

A：不同溫度處理后的Tβ存活率 survival rate of Tβ treated at different temperatures；B：不同pH培養(yǎng)時(shí)Tβ存活率 survival rate of Tβ when cultured at different pH。

2.3 乳酸菌的生物學(xué)功能評(píng)價(jià)

2.3.1 產(chǎn)酸能力測(cè)定

由圖6-A可見(jiàn)，溴甲酚綠在pH為3.6時(shí)會(huì)由藍(lán)色變?yōu)辄S色，加入Tβ菌液的培養(yǎng)基有明顯變化，且產(chǎn)酸圈直徑達(dá)到了35 mm，與對(duì)照組相比變化明顯。由此可見(jiàn)，Tβ產(chǎn)酸效果優(yōu)異。

由圖6-B可見(jiàn)，在0、2 h Tβ菌液的pH分別為7.2、6.8，但在4 h急劇下降至6.0，并且在6 h達(dá)到5.1，一直到8 h降至4.5后才回歸平穩(wěn)，后續(xù)在10 h到達(dá)了4.1，12 h到達(dá)了3.6。于培養(yǎng)箱放置24 h后菌液的pH為3.4。由此可見(jiàn)，Tβ產(chǎn)酸能力較好，2～12 h為產(chǎn)酸高峰期。

A：產(chǎn)酸圈圖 acid-producing circle diagram；B：產(chǎn)酸曲線 acid-producing curve。

2.3.2 抑菌能力測(cè)定

由表4、圖7可見(jiàn)，Tβ菌懸液和上清液對(duì)大腸桿菌CMCC 44102、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、沙門(mén)氏菌ATCC 9150都有良好的抑菌能力，其中Tβ菌懸液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力顯著高于上清液(P<0.05)。

1：空白對(duì)照 blank control；2：Tβ上清液 Tβ supernatant；3：Tβ菌懸液 Tβ bacterial suspension。

表4 Tβ菌懸液和上清液對(duì)不同致病菌的抑菌能力

2.3.3 自聚合能力測(cè)定

細(xì)菌對(duì)于自聚合能力的劃分標(biāo)準(zhǔn)為，自聚合性在16%～35%為低自聚合能力，在36%～50%為中等自聚合能力，在50%以上為高自聚合能力。Tβ的自聚合性為16.77%，說(shuō)明Tβ具有較低的自聚合能力。

2.3.4 疏水能力測(cè)定

細(xì)菌對(duì)于疏水能力的劃分標(biāo)準(zhǔn)為，疏水性在20%以下為非疏水，在20%～50%為中度疏水，在50%以上為高度疏水。Tβ的疏水性為51.80%，說(shuō)明Tβ具有較高的疏水能力。

2.3.5 共凝集能力測(cè)定

由圖8可見(jiàn)，Tβ與金黃色葡萄球菌ATCC 25923共凝集性為52.11%，與沙門(mén)氏菌ATCC 9150共凝集性為75.64%，與大腸桿菌CMCC 44102共凝集性為73.95%；Tβ與金黃色葡萄球菌ATCC 25923的共凝集性顯著低于沙門(mén)氏菌ATCC 9150和大腸桿菌CMCC 44102(P<0.05)。由此可知，Tβ與沙門(mén)氏菌ATCC 9150的共凝集能力最好，對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 25923的共凝集能力較弱。

1：金黃色葡萄球菌ATCC 25923 Staphylococcus aureus ATCC 25923；2：沙門(mén)氏菌ATCC 9150 Salmonella ATCC 9150；3：大腸桿菌CMCC 44102 Escherichia coli CMCC 44102。

2.4 乳酸菌的動(dòng)物飼喂試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 乳酸菌的腸道內(nèi)定植觀察

由圖9可見(jiàn)，取腸道組織于熒光顯微鏡下觀察，飼喂菌液組腸道組織可觀察到大量熒光，熒光來(lái)源于被FITC標(biāo)記的菌體，說(shuō)明Tβ腸道黏附能力優(yōu)秀。

A：飼喂菌液組的腸道組織顯微鏡觀察圖 microscopic view of intestinal tissue of the fed bacteria solution group；B：對(duì)照組的腸道組織顯微鏡觀察圖 microscopic view of intestinal tissue of the control group。

2.4.2 臟器指數(shù)

由表6可見(jiàn)，飼喂菌液組的小鼠脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)較對(duì)照組均增加，飼喂菌液組的肝臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且解剖觀察到飼喂菌液組和對(duì)照組小鼠免疫器官均無(wú)病理變化，說(shuō)明Tβ有促進(jìn)免疫器官生長(zhǎng)的效果。

表6 臟器指數(shù)結(jié)果

2.4.3 動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)

經(jīng)過(guò)14 d的飼喂，試驗(yàn)小鼠精神狀態(tài)良好，無(wú)生病或者死亡，解剖觀察解剖腔無(wú)病理變化，證明Tβ無(wú)致病性，是一種安全無(wú)毒的優(yōu)秀的微生態(tài)制劑備用菌。

3 討 論

乳酸菌是哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的益生菌之一，對(duì)動(dòng)物機(jī)體有著不可小覷的益生作用。張?jiān)诘萚15]通過(guò)溶鈣圈法從豬糞中提取出了10株疑似乳酸菌。本試驗(yàn)借鑒了此方法，通過(guò)在MRS培養(yǎng)基中加入CaCO3，挑取具有溶鈣圈的菌落，在耐受性試驗(yàn)初篩與抑菌活性測(cè)定復(fù)篩后，選擇最優(yōu)菌進(jìn)行乳酸菌專(zhuān)用生化管鑒定，再通過(guò)16S rRNA反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，出現(xiàn)正確條帶后送檢，得到核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)建立進(jìn)化樹(shù)，確定此菌株是約翰氏乳桿菌。

在動(dòng)物的胃腸道內(nèi)存活是乳酸菌在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生作用的基礎(chǔ)[16]，因此我們檢測(cè)了Tβ的耐酸能力、耐熱能力和耐膽鹽能力，證明了其具有優(yōu)良的在動(dòng)物消化道內(nèi)存活的能力?？紤]飼料的發(fā)酵以及環(huán)境保存不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)酸、高溫等惡劣環(huán)境，我們檢測(cè)了其在pH為2時(shí)的存活率，平均存活率為12.1%，付浩等[17]研究了乳酸菌于不同pH(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5)處理后的存活率，在pH為3.5時(shí)菌株存活明顯下降，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。同時(shí)本試驗(yàn)也檢測(cè)了Tβ在90 ℃時(shí)的存活率，其在90 ℃時(shí)也可存活并且生長(zhǎng)，平均存活率為14.02%。曹海鵬等[18]測(cè)定了乳酸菌在30～60 ℃時(shí)的存活率，在30～45 ℃時(shí)乳酸菌存活率基本無(wú)變化，45 ℃以上隨著溫度升高存活率逐漸降低，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。以上結(jié)果證明了Tβ具有優(yōu)異的抗逆能力。

乳酸菌具有優(yōu)秀的抑菌能力，是因?yàn)槠淇梢援a(chǎn)生乳酸以及一些抑菌物質(zhì)[19]?？紫辂惖萚20]證實(shí)了乳酸對(duì)致病菌有抑制作用；顧彬濤[13]也證實(shí)了乳酸菌對(duì)腸毒素性大腸桿菌ETEC 10和金黃色葡萄球菌A65具有體外抗菌能力，以上研究成果與本研究結(jié)果相符。Tβ具有十分優(yōu)異的產(chǎn)酸能力，由此我們可以將兩者聯(lián)系起來(lái)，測(cè)定Tβ的抑菌能力，得到結(jié)果證明Tβ對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌具有優(yōu)秀的抑菌能力，Tβ上清液與菌懸液結(jié)果差異不顯著；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力，Tβ上清液與菌懸液結(jié)果相差較大，Tβ菌懸液的抑菌效果更優(yōu)秀。針對(duì)以上結(jié)果我們可以得出結(jié)論，Tβ具有良好的抑菌效果，其菌懸液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌均有一定抑菌效果。

益生菌的益生效果與其黏附能力息息相關(guān)，在消化道內(nèi)黏附時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)揮作用越大[21]。孫笑非等[22]通過(guò)禽類(lèi)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)了乳酸菌可以通過(guò)提高腸絨毛高度、改善黏膜結(jié)構(gòu)來(lái)提高營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收、增強(qiáng)上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能、防御病原菌和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等。想要消滅病原菌，與病原菌共凝集也是十分重要的一環(huán)[23]。通過(guò)本試驗(yàn)結(jié)果可知，Tβ具有一定的自凝集能力和較高的疏水能力，在病原菌共凝集試驗(yàn)中結(jié)果較為優(yōu)異。龔虹等[24]測(cè)定了不同乳酸菌的黏附能力，結(jié)果顯示德氏乳桿菌與羅伊乳桿菌具有良好的疏水能力和自凝集能力，而戊糖片球菌則疏水能力與自凝集能力較弱。本試驗(yàn)選用菌株為約翰氏乳桿菌，試驗(yàn)結(jié)果顯示具有較優(yōu)秀的黏附能力，推測(cè)乳酸桿菌的黏附能力會(huì)較優(yōu)于乳酸球菌。

石水琴[25]通過(guò)FITC標(biāo)記乳酸菌，成功觀測(cè)到了被FITC標(biāo)記的乳酸菌。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂菌液組小鼠腸道組織于熒光顯微鏡下可觀察到大量熒光，證明Tβ腸道黏附能力十分優(yōu)秀。飼喂菌液組的小鼠臟器指數(shù)高于對(duì)照組，且飼喂菌液組的小鼠無(wú)任何異常，解剖腔也無(wú)肉眼可觀察到的病變，說(shuō)明Tβ在一定程度上可以提高機(jī)體免疫能力。

4 結(jié) 論

從安慶六白豬糞便中純化而來(lái)的Tβ經(jīng)過(guò)16S rDNA核酸同源性分析、生化管鑒定、細(xì)菌形態(tài)及菌落特征綜合分析，確定其為約翰氏乳桿菌。Tβ是一株優(yōu)異的微生態(tài)制劑備用菌，具有耐熱和耐酸能力強(qiáng)、產(chǎn)酸豐富、抑菌譜廣、生長(zhǎng)迅速、黏附能力優(yōu)秀等特點(diǎn)。動(dòng)物試驗(yàn)顯示，Tβ具有優(yōu)良的腸道益生功能。