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        前列腺癌細胞核內雄激素受體靶基因的篩選

        2022-09-01 03:47:54程玥夏旭芬陶志華
        浙江醫(yī)學 2022年15期
        關鍵詞:染色質依賴性雄激素

        程玥 夏旭芬 陶志華

        前列腺癌(prostate cancer,PC)是男性常見的一種惡性腫瘤[1]。近年來隨著診斷技術的不斷提高和生活方式的改變,PC發(fā)病率逐年升高[2-3]。早期PC表現為雄激素依賴性,因此通過手術或藥物進行雄激素剝奪治療是PC的標準治療手段[4]。PC患者經雄激素剝奪治療后會有一段緩解期,但是多數患者最終發(fā)展為雄激素非依賴性PC,且預后極差[5]。雄激素受體是核受體超家族的一員,通過與配體的結合誘導調節(jié)靶基因的表達,對PC的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用[6]。在PC從雄激素依賴性發(fā)展為雄激素非依賴性的過程中,雄激素受體的靶基因也隨之發(fā)生變化[7-8]。因此,本研究采用染色質免疫共沉淀技術聯合高通量測序技術對雄激素依賴性PC和雄激素非依賴性PC的雄激素受體靶基因進行篩選,初步探索關鍵的雄激素受體靶基因。

        1 材料和方法

        1.1 細胞株 雄激素依賴性PC細胞株LNCaP購自中國科學院上海細胞庫。依據慢性雄激素剝奪建立雄激素非依賴性PC細胞株,即將LNCaP細胞置于去雄激素的小牛血清培養(yǎng)液中長期傳代培養(yǎng),建立雄激素非依賴性PC細胞株LNCaP-AI[9-10]。

        1.2 試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、小牛血清均購自美國GIBCO公司;染色質免疫共沉淀試劑盒(含蛋白酶抑制劑、EZ-ZymeTMLysis Buffer、EZ-ZymeTMEnzymatic Cocktail、洗脫緩沖液)購自美國Millipore公司;RTPCR試劑盒SYBR Green Master Mix購自瑞士Roche公司。CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;RT-PCR儀購自美國ABI公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 細胞培養(yǎng) LNCaP細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,LNCaP-AI細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清無酚紅DMEM培養(yǎng)基中;均置于含5% CO2的37℃恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        1.3.2 細胞染色質免疫共沉淀 LNCaP細胞培養(yǎng)瓶和LNCaP-AI細胞培養(yǎng)瓶中分別加入1%甲醛5 min,使DNA-蛋白的相互結合作用被交聯固定。交聯后的細胞用PBS清洗3次,再加入含蛋白酶抑制劑的PBS,使用細胞刮刀將LNCaP、LNCaP-AI細胞分別收集于不同EP管中,離心,去上清液,留細胞團。使用EZ-ZymeTMLysis Buffer 400 μl重懸收集的細胞團,將重懸液置于冰上反應0.5 h。將EP管放入液氮中,待完全結冰后置于37℃水浴箱內直到解凍,此過程重復4~5次,以充分裂解LNCaP、LNCaP-AI細胞。在EP管中加入15 μl EZ-ZymeTMEnzymatic Cocktail,37 ℃反應0.5 h;打斷基因組DNA至100~500 bp大小。分別在LNCaP、LN‐CaP-AI細胞裂解液中加入10 μl抗AR抗體和50 μl磁珠輕輕混勻,4℃振蕩孵育過夜。將獲得的免疫沉淀復合物用洗脫緩沖液洗脫并解交聯,得到染色質免疫共沉淀下的DNA。

        1.3.3 高通量測序 將染色質免疫共沉淀下的DNA片段進行末端修復,3'端加A堿基,連接測序接頭,使用Illumina進行測序。測序完成后的原始數據進行去測序接頭等處理,去除掉不合格的序列,最終獲得可用的數據。將此測序數據與人類基因組19進行比對,其中比對到人類基因組19上唯一位置且不超過2個堿基錯配的序列用于后續(xù)分析。分析其在參考基因組上的覆蓋分布,統計基因組位點的深度信息,得到基因組上測序深度統計結果。

        1.3.4 基因表達水平檢測 采用RT-PCR法。使用Trizol法提取細胞總RNA,通過OD260/OD280比值鑒定RNA質量和純度,選擇比值為1.8~2.0的樣品并計算其濃度。按RT-PCR試劑盒說明書進行反應,合成cDNA模板并進行PCR擴增,PCR條件:95℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,共50個循環(huán)?;蛞镄蛄幸姳?。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehy‐drogenase,GAPDH)為內參,采用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

        表1 引物序列

        1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

        2 結果

        2.1 高通量測序結果 LNCaP細胞中發(fā)現9 021個基因組測序數據富集區(qū)域,其中4 143個落在雄激素受體結合位點,將這些位點定位到基因組后得到2 796個雄激素受體相關基因。LNCaP-AI細胞中發(fā)現4 949個基因組測序數據富集區(qū)域,其中2 380個落在雄激素受體結合位點,將這些位點定位到基因組后得到1 854個雄激素受體相關基因(與LNCaP細胞中得到的雄激素受體相關基因相同的有789個)。對兩種細胞株的2 796、1 854個雄激素受體相關基因分別進行生物學信號通路分析,結果顯示多數靶基因集中在肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、緊密連接、血管平滑肌收縮信號通路;LNCaP與LNCaP-AI細胞的差異靶細胞通路為黏著斑,見表2~3。

        表2 2 796個LNCaP細胞雄激素受體相關基因主要信號通路的基因量[個(%)]

        表3 1 854個LNCaP-AI細胞雄激素受體相關基因主要信號通路的基因量[個(%)]

        2.2 雄激素受體差異靶基因表達情況 從LNCaP與LNCaP-AI細胞測序得到的雄激素受體差異靶基因中篩選出富集程度較高的雄激素受體差異靶基因2個,即LIFR、PSMA6。與LNCaP細胞比較,LNCaP-AI細胞中LIFR、PSMA6 mRNA表達水平均明顯升高,差異均有統計學意義(均P<0.05),見圖1。

        圖1 LNCaP與LNCaP-AI細胞中LIFR、PSMA6 mRNA表達水平比較(a:LIFR;b:PSMA6)

        3 討論

        雄激素受體作為核受體,在PC從雄激素依賴性發(fā)展為雄激素非依賴性的過程中起著重要作用,但是具體機制尚未完全明確。本實驗采用染色質免疫共沉淀技術聯合高通量測序技術對LNCaP、LNCaP-AI細胞中雄激素受體靶基因進行篩選,結果發(fā)現在雄激素依賴性PC與雄激素非依賴性PC的雄激素受體靶基因存在差異。在LNCaP細胞中發(fā)現2 796個雄激素受體相關基因,LNCaP-AI細胞中發(fā)現1 854個雄激素受體相關基因,其中有789個是相同的。分別對2 796、1 854個雄激素受體相關基因進行生物學信號通路分析,結果發(fā)現LNCaP與LNCaP-AI細胞的差異靶細胞通路為黏著斑。本研究進一步從LNCaP與LNCaP-AI細胞測序得到的雄激素受體差異靶基因中篩選出富集程度較高的雄激素受體差異靶基因2個,即LIFR、PSMA6;同時對LNCaP、LNCaP-AI細胞中LIFR、PSMA6 mRNA表達水平進行檢測與比較,結果發(fā)現LNCaP-AI細胞中LIFR、PSMA6 mRNA表達水平均明顯高于LNCaP細胞。Chen等[11]發(fā)現LIFR在乳腺癌組織中表達失調,可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Wu等[12]認為LI‐FR表達可能為惡性腫瘤的診斷與治療提供參考。Kakumu等[13]認為PSMA6沉默可以誘導肺癌細胞凋亡。Zhang等[14]發(fā)現PSMA6表達升高在肺腺癌的發(fā)生發(fā)、展中起一定作用。Yang等[15]研究表明,PSMA6在晚期轉移性胃癌患者中呈高表達。

        綜上所示,LIFR、PSMA6為PC細胞核內雄激素受體靶基因,這為進一步探索PC雄激素受體靶基因的功能提供了理論基礎,為PC治療提供新的靶點。

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