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        難治性Graves病患者外周血免疫學(xué)特征分析

        2022-09-01 03:48:08胡詩倩何明倩陳子怡王悅
        浙江醫(yī)學(xué) 2022年15期
        關(guān)鍵詞:難治性孵育外周血

        胡詩倩 何明倩 陳子怡 王悅

        Graves?。℅raves'disease,GD)是常見的器官特異性自身免疫性疾病,在遺傳、環(huán)境和表觀遺傳等多種因素作用下,機(jī)體產(chǎn)生促甲狀腺素受體自身抗體(thyrotropin receptor antibody,TRAb),CD4+T細(xì)胞在此過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。GD主要表現(xiàn)為甲狀腺毒癥,可引起全身各系統(tǒng)的損害。目前抗甲狀腺藥物是GD患者的一線治療方案。但是正規(guī)藥物治療后,僅有40%~50%的患者可獲得長(zhǎng)期緩解[1-2],部分難治性GD患者盡管規(guī)律治療5年以上,但TRAb持續(xù)陽性或甲狀腺功能指標(biāo)持續(xù)異常。目前,難治性GD的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此,本研究通過比較難治性及緩解期GD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)基因表達(dá)的差異,外周血CD4+T細(xì)胞亞群[Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)]比例,以及下游相關(guān)細(xì)胞因子水平,探討難治性GD可能的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制,為難治性GD的治療提供新靶點(diǎn),現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 對(duì)象和方法

        1.1 對(duì)象 選擇2018年12月至2021年2月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科門診就診的難治性GD患者27例(難治性GD組),其中男4例,女23例,年齡20~52(37.7±9.1)歲;TRAb水平(33.1±8.6)U/L;甲狀腺功能亢進(jìn)1例(3.7%),亞臨床甲狀腺功能亢進(jìn)26例(96.3%)。選擇同期年齡、性別相匹配的緩解期GD患者25例(緩解期GD組),其中男2例,女23例,年齡20~65(38.6±12.0)歲;TRAb水平(4.7±1.5)U/L;甲狀腺功能均正常。兩組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),TRAb水平及甲狀腺功能比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)難治性GD患者[3-5]:根據(jù)臨床表現(xiàn)及相關(guān)輔助檢查確診為GD,抗甲狀腺藥物治療5年以上,TRAb持續(xù)陽性,或甲狀腺功能指標(biāo)持續(xù)異常的患者;(2)緩解期GD患者:根據(jù)臨床表現(xiàn)及相關(guān)輔助檢查確診為GD,抗甲狀腺藥物停藥1年以上,甲狀腺功能正常且TRAb陰性的GD患者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有其他自身免疫性疾病,感染性疾病,嚴(yán)重心、肝、腎疾病,或惡性腫瘤的患者;(2)正在使用免疫調(diào)節(jié)劑的患者。本研究已通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批準(zhǔn)文號(hào):XJTU1AF2016LSK-35),所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

        1.2 方法

        1.2.1 標(biāo)本采集及主要試劑、儀器 所有患者抽取空腹靜脈血,用無菌EDTA抗凝管收集,部分血樣用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及流式細(xì)胞分析,其余血樣離心取血漿分裝后-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。淋巴?xì)胞分離液為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品,Trizol RNA分離試劑、SuperScript dscDNA合成試劑盒均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品,Cell stimulation cocktail為美國eBioscienc公司產(chǎn)品,F(xiàn)ITC小鼠抗人CD3抗體、FITC小鼠抗人CD4抗體、APC小鼠抗人CD8抗體、Fixation/Permeabilization試劑盒、Stain‐ing Buffer均為美國BD Pharmingen公司產(chǎn)品,APC小鼠抗人CD25抗體、PE小鼠抗人Foxp3抗體、PE小鼠抗人IL-17A抗體、PE小鼠IgG1均為美國eBioscience公司產(chǎn)品;人TRAb放射受體分析試劑盒為天津市協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;Luminex液相懸浮芯片為上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;人TGF-β1 ELISA試劑盒為美國Raybiotech公司產(chǎn)品;FACS Calibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品;Luminex 200檢測(cè)儀為美國Luminex Corporation公司產(chǎn)品;Illumina HiSeq 3000測(cè)序儀為美國Illumina公司產(chǎn)品。

        1.2.2 TRAb檢測(cè) 采用放射受體分析法。根據(jù)人TRAb放射受體分析試劑盒說明書步驟進(jìn)行,檢測(cè)范圍為0~405 U/L,正常參考范圍為<9 U/L。

        1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 采用密度梯度離心法提取外周血PBMC,加入Trizol溶解后抽提mRNA。mRNA擴(kuò)增后用片段緩沖液將其裂解為300 bp的片段。然后,將這些片段作為模板,根據(jù)說明書步驟使用SuperScript dscDNA合成試劑盒合成dscDNA。制備的dscDNA文庫經(jīng)純化、富集、評(píng)估后,用Illumina HiSeq 3000測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。原始測(cè)序數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量堿基和適配器序列,用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片(FPKM)值計(jì)算基因表達(dá)量。采用DE‐Seq2包鑒定文庫之間的差異表達(dá)基因,差異倍數(shù)(fold change,FC)≥2,即|log2FC|≥1和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false dis‐covery rate,FDR)<0.05的基因被認(rèn)為具有顯著性。使用ggplot2包繪制火山圖。使用“clusterProfiler”R包進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and ge‐nomes,KEGG)富集分析,判定其主要影響的生物學(xué)功能及信號(hào)通路,設(shè)定P<0.05為閾值。

        1.2.4 Th17細(xì)胞比例檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。調(diào)節(jié)PBMC 濃度至 2×106/ml,取 500 μl置于 EP管中;加入2 μl cell stimulation cocktail,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h;用staining buffer洗滌2次;重懸后取100 μl,加入10 μl CD3 FITC 和 10 μl CD8 APC,室溫避光孵育30 min;洗滌2次后加入1 ml 1×Fix/Perm液,4℃避光孵育 45 min;洗滌 2次、用 100 μl 1×Perm/wash buffer重懸后加入5 μl IL-17A PE,室溫避光孵育45 min;洗滌、重懸、上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果以CD3+CD8-IL-17A+的T細(xì)胞數(shù)占CD4+T細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

        1.2.5 Treg細(xì)胞比例檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù),密度梯度離心法提取PBMC,重懸后計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106/ml,取 100 μl置于 EP 管中,加入 10 μl CD4 FITC 和 5 μl CD25 APC,室溫避光孵育 30 min;用staining buffer洗滌2次;加入1 ml 1×Fix/Perm破膜固定液,4℃避光孵育45 min;用1×Perm/wash buffer洗滌2次;重懸加入5 μl Foxp3 PE,室溫避光孵育45 min;再次洗滌、重懸、上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果以CD4+CD25+Foxp3+的T細(xì)胞數(shù)占CD4+T細(xì)胞數(shù)的百分比表示。Th17/Treg比值為CD3+CD8-IL-17A+的T細(xì)胞數(shù)和CD4+CD25+Foxp3+的T細(xì)胞數(shù)的比值。

        1.2.6 細(xì)胞因子檢測(cè) 采用Luminex液相懸浮芯片技術(shù)。按說明書要求準(zhǔn)備好血漿樣品、Serum Matrix、標(biāo)準(zhǔn)品、參照品,按照既定順序上樣;96孔板中每孔加入25 μl微珠、25 μl樣品和 25 μl Assay Buffer;取 50 μl準(zhǔn)備好的稀釋標(biāo)曲、Blank和參照品Control加入對(duì)應(yīng)孔中,將96孔板貼上封口膜,850 r/min振蕩、4℃避光過夜孵育;棄去每孔中的樣品,洗滌3次;每孔中加入50 μl Detection Antibody,貼上封口膜,850 r/min振蕩、室溫避光孵育1 h;每孔加入50 μl Streptavidin-PE,貼上封口膜,850 r/min振蕩、室溫避光孵育30 min;洗滌3次;每孔中加入150 μl Sheath Fluid重懸微珠,貼上封口膜,850 r/min室溫避光振蕩5 min;將96孔板放入校正好的Luminex 200檢測(cè)儀中讀值。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件、FlowJo軟件和GraphPad Prism 8軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組患者PBMC轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 相較于緩解期GD組患者,難治性組GD患者PBMC中共篩選出265個(gè)顯著性差異表達(dá)基因,其中45個(gè)基因表達(dá)下調(diào),211個(gè)基因表達(dá)上調(diào),見圖1a(插頁)。KEGG富集分析顯示,難治性GD組患者PBMC中上調(diào)的差異基因主要在cytokine-cytokine receptor interaction、IL-17 signaling、NF-κB signaling、MAPK signaling、Th17 cell differentiation等與Th17細(xì)胞分化及下游效應(yīng)細(xì)胞因子作用相關(guān)的信號(hào)通路富集,見圖1b(插頁)。GO分析顯示,上調(diào)的差異基因參與了cell chemotaxis、positive regulation of acute inflammatory response、leukocyte che‐motaxis等與炎癥和趨化相關(guān)的生物學(xué)過程,主要影響cytokine activity、cytokine receptor binding、receptor li‐gand activity、chemokine activity、chemokine receptor binding等分子功能,見圖1c、d(插頁)。

        圖1 兩組患者PBMC轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

        2.2 兩組患者外周血Th17、Treg細(xì)胞比例分析 難治性GD組外周血中Th17細(xì)胞比例高于緩解期GD組,而Treg細(xì)胞比例低于緩解期GD組,Th17/Treg比值也高于緩解期GD組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖2-4。

        圖2 兩組患者外周血Th17細(xì)胞流式分析圖比較

        圖3 兩組患者外周血Treg細(xì)胞流式分析圖比較

        圖4 兩組患者外周血Th17、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比值比較

        2.3 兩組GD患者血漿相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 相較于緩解期GD組患者,難治性GD組患者外周血中IL-17A、IL-6、TGF-β1、IL-1β 及 IL-10的表達(dá)水平均增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);但I(xiàn)L-23和TNF-α表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表1。

        表1 兩組GD患者血漿相關(guān)細(xì)胞因子水平比較(pg/ml)

        3 討論

        目前難治性GD的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選了難治性和緩解期GD患者PBMC中顯著性變化的差異表達(dá)基因。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),難治性GD患者PBMC中表達(dá)顯著上調(diào)的基因,主要在與Th17細(xì)胞分化及其效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17作用相關(guān)的信號(hào)通路富集。GO分析顯示,難治性GD患者表達(dá)上調(diào)的基因主要通過影響細(xì)胞因子、趨化因子的分子功能,參與了炎癥和趨化相關(guān)的生物學(xué)過程。以上結(jié)果提示,Th17細(xì)胞的過度分化及其下游效應(yīng)因子的功能紊亂可能與GD的難治性密切相關(guān)。

        既往研究表明,T淋巴細(xì)胞是自身免疫性甲狀腺疾病發(fā)病的重要參與因素[1]。Th17是CD4+T細(xì)胞的一種,其主要效應(yīng)因子IL-17與受體結(jié)合后可以激活下游MAPK和NF-κB等炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)炎癥因子、趨化因子以及黏附分子的大量分泌,參與多種炎癥反應(yīng)和自身免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展。相反,Treg細(xì)胞是維持外周免疫耐受和機(jī)體免疫平衡的關(guān)鍵性CD4+T細(xì)胞亞群[6]。事實(shí)上,Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化都需要TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路來起始,在IL-6或IL-21同時(shí)存在的條件下,原始CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞;而在缺乏促炎細(xì)胞因子的情況下,TGF-β則促使其分化成Treg細(xì)胞[7]。現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明Th17、Treg細(xì)胞失衡在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化和炎癥性腸病等多種自身免疫性疾病中起著至關(guān)重要的作用[8-10]。但是,目前Th17、Treg細(xì)胞平衡與難治性GD關(guān)系的研究甚少。因此,本研究進(jìn)一步檢測(cè)了難治性和緩解期GD患者外周血中Th17和Treg細(xì)胞比例。結(jié)果顯示,相較于緩解期GD組,難治性GD組患者外周血中Th17細(xì)胞比例升高,而Treg細(xì)胞比例降低,Th17/Treg比值也增高,說明Th17、Treg的平衡失調(diào)與GD的難治性密切相關(guān)。

        本研究進(jìn)一步檢測(cè)了難治性和緩解期GD患者血漿中相關(guān)下游效應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,難治性GD組血漿中IL-17A、IL-6、TGF-β1、IL-1β及IL-10的表達(dá)水平高于緩解期GD組。IL-17A是Th17細(xì)胞最主要的效應(yīng)因子,之前的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甲狀腺組織中存在功能性IL-17受體的表達(dá),IL-17A與其結(jié)合可以促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞合成和分泌IL-6以及其他趨化因子、細(xì)胞間黏附因子[5]。此外,IL-17A還可以促進(jìn)前體樹突狀細(xì)胞的分化和成熟,從而持續(xù)刺激T細(xì)胞活化增殖,產(chǎn)生IL-4、IL-10等細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞成熟并分泌自身抗體。同時(shí)在對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥疾病的研究中發(fā)現(xiàn),IL-17A可以促進(jìn)炎性細(xì)胞的活化,并誘導(dǎo)IL-1β等炎性細(xì)胞因子的釋放。IL-6具有刺激B細(xì)胞活化產(chǎn)生自身抗體、促進(jìn)T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活化等多重免疫調(diào)節(jié)功能。之前的研究發(fā)現(xiàn),IL-17和TRAb均可促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞合成分泌IL-6,而IL-6可以進(jìn)一步刺激B細(xì)胞分化成熟,增加甲狀腺自身抗體的產(chǎn)生[5,11]。此外,IL-6還能與TGF-β一起誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化,從而形成正反饋調(diào)節(jié),加劇甲狀腺局部的自身免疫炎癥反應(yīng)。早期有研究發(fā)現(xiàn),難治性GD患者血清中IL-10的表達(dá)水平顯著增高[12]。IL-10可以刺激IgG向IgG3亞型的轉(zhuǎn)換[13],而多因素logistic回歸分析顯示,血清IgG3/IgG比值是難治性GD的獨(dú)立影響因素[14]。基因研究發(fā)現(xiàn),難治性GD患者IL-1β基因-31位點(diǎn)的T等位基因攜帶頻率顯著高于緩解期GD患者,該等位基因攜帶者IL-1β合成增加[15],而IL-1β又可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和增殖,形成正反饋調(diào)節(jié)。

        綜上所述,增高的IL-17A可以促進(jìn)IL-6、IL-1β以及IL-10等細(xì)胞因子的表達(dá),筆者推測(cè)這些因子之間可能通過相互作用,形成一個(gè)多效性的功能網(wǎng)絡(luò),或通過刺激B細(xì)胞分化成熟,進(jìn)一步增加甲狀腺內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生;或增強(qiáng)其他炎性細(xì)胞因子的功能,誘導(dǎo)持續(xù)的自身免疫反應(yīng);或能反過來促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和增殖,形成正反饋調(diào)節(jié),誘導(dǎo)甲狀腺局部持續(xù)的自身免疫炎性反應(yīng),從而導(dǎo)致難治性GD的發(fā)生。因此,Th17、Treg平衡失調(diào)以及下游相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞因子的免疫紊亂與GD的難治性密切相關(guān),Th17、Treg細(xì)胞平衡可能是難治性GD免疫治療的新型有效靶點(diǎn)。

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