胡詩倩 何明倩 陳子怡 王悅

Graves病（Graves'disease,GD）是常見的器官特異性自身免疫性疾病，在遺傳、環(huán)境和表觀遺傳等多種因素作用下，機體產(chǎn)生促甲狀腺素受體自身抗體（thyrotropin receptor antibody,TRAb），CD4+T細胞在此過程中發(fā)揮了關鍵作用。GD主要表現(xiàn)為甲狀腺毒癥，可引起全身各系統(tǒng)的損害。目前抗甲狀腺藥物是GD患者的一線治療方案。但是正規(guī)藥物治療后，僅有40%～50%的患者可獲得長期緩解[1-2]，部分難治性GD患者盡管規(guī)律治療5年以上，但TRAb持續(xù)陽性或甲狀腺功能指標持續(xù)異常。目前，難治性GD的確切發(fā)病機制尚未完全闡明。因此，本研究通過比較難治性及緩解期GD患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）基因表達的差異，外周血CD4+T細胞亞群[Th17和調節(jié)性T細胞（regulatory T cell,Treg）]比例，以及下游相關細胞因子水平，探討難治性GD可能的免疫學發(fā)病機制，為難治性GD的治療提供新靶點，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2018年12月至2021年2月于西安交通大學第一附屬醫(yī)院內分泌科門診就診的難治性GD患者27例（難治性GD組），其中男4例，女23例，年齡20～52（37.7±9.1）歲；TRAb水平（33.1±8.6）U/L；甲狀腺功能亢進1例（3.7%），亞臨床甲狀腺功能亢進26例（96.3%）。選擇同期年齡、性別相匹配的緩解期GD患者25例（緩解期GD組），其中男2例，女23例，年齡20～65（38.6±12.0）歲；TRAb水平（4.7±1.5）U/L；甲狀腺功能均正常。兩組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），TRAb水平及甲狀腺功能比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。納入標準：（1）難治性GD患者[3-5]：根據(jù)臨床表現(xiàn)及相關輔助檢查確診為GD，抗甲狀腺藥物治療5年以上，TRAb持續(xù)陽性，或甲狀腺功能指標持續(xù)異常的患者；（2）緩解期GD患者：根據(jù)臨床表現(xiàn)及相關輔助檢查確診為GD，抗甲狀腺藥物停藥1年以上，甲狀腺功能正常且TRAb陰性的GD患者。排除標準：（1）有其他自身免疫性疾病，感染性疾病，嚴重心、肝、腎疾病，或惡性腫瘤的患者；（2）正在使用免疫調節(jié)劑的患者。本研究已通過西安交通大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批（批準文號：XJTU1AF2016LSK-35），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及主要試劑、儀器 所有患者抽取空腹靜脈血，用無菌EDTA抗凝管收集，部分血樣用于轉錄組測序及流式細胞分析，其余血樣離心取血漿分裝后-80℃儲存?zhèn)溆?。淋巴細胞分離液為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，Trizol RNA分離試劑、SuperScript dscDNA合成試劑盒均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，Cell stimulation cocktail為美國eBioscienc公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC小鼠抗人CD3抗體、FITC小鼠抗人CD4抗體、APC小鼠抗人CD8抗體、Fixation/Permeabilization試劑盒、Stain‐ing Buffer均為美國BD Pharmingen公司產(chǎn)品，APC小鼠抗人CD25抗體、PE小鼠抗人Foxp3抗體、PE小鼠抗人IL-17A抗體、PE小鼠IgG1均為美國eBioscience公司產(chǎn)品；人TRAb放射受體分析試劑盒為天津市協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；Luminex液相懸浮芯片為上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；人TGF-β1 ELISA試劑盒為美國Raybiotech公司產(chǎn)品；FACS Calibur流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；Luminex 200檢測儀為美國Luminex Corporation公司產(chǎn)品；Illumina HiSeq 3000測序儀為美國Illumina公司產(chǎn)品。

1.2.2 TRAb檢測 采用放射受體分析法。根據(jù)人TRAb放射受體分析試劑盒說明書步驟進行，檢測范圍為0～405 U/L，正常參考范圍為＜9 U/L。

1.2.3 轉錄組測序及數(shù)據(jù)分析 采用密度梯度離心法提取外周血PBMC，加入Trizol溶解后抽提mRNA。mRNA擴增后用片段緩沖液將其裂解為300 bp的片段。然后，將這些片段作為模板，根據(jù)說明書步驟使用SuperScript dscDNA合成試劑盒合成dscDNA。制備的dscDNA文庫經(jīng)純化、富集、評估后，用Illumina HiSeq 3000測序儀進行測序。原始測序數(shù)據(jù)去除低質量堿基和適配器序列，用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片（FPKM）值計算基因表達量。采用DE‐Seq2包鑒定文庫之間的差異表達基因，差異倍數(shù)（fold change,FC）≥2，即|log2FC|≥1和錯誤發(fā)現(xiàn)率（false dis‐covery rate,FDR）＜0.05的基因被認為具有顯著性。使用ggplot2包繪制火山圖。使用“clusterProfiler”R包進行基因本體論（gene ontology,GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and ge‐nomes,KEGG）富集分析，判定其主要影響的生物學功能及信號通路，設定P＜0.05為閾值。

1.2.4 Th17細胞比例檢測 采用流式細胞術。調節(jié)PBMC 濃度至 2×106/ml，取 500 μl置于 EP管中；加入2 μl cell stimulation cocktail，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h；用staining buffer洗滌2次；重懸后取100 μl，加入10 μl CD3 FITC 和 10 μl CD8 APC，室溫避光孵育30 min；洗滌2次后加入1 ml 1×Fix/Perm液，4℃避光孵育 45 min；洗滌 2次、用 100 μl 1×Perm/wash buffer重懸后加入5 μl IL-17A PE，室溫避光孵育45 min；洗滌、重懸、上機檢測。結果以CD3+CD8-IL-17A+的T細胞數(shù)占CD4+T細胞數(shù)的百分比表示。

1.2.5 Treg細胞比例檢測 采用流式細胞術，密度梯度離心法提取PBMC，重懸后計數(shù)，調節(jié)細胞濃度至1×106/ml，取 100 μl置于 EP 管中，加入 10 μl CD4 FITC 和 5 μl CD25 APC，室溫避光孵育 30 min；用staining buffer洗滌2次；加入1 ml 1×Fix/Perm破膜固定液，4℃避光孵育45 min；用1×Perm/wash buffer洗滌2次；重懸加入5 μl Foxp3 PE，室溫避光孵育45 min；再次洗滌、重懸、上機檢測。結果以CD4+CD25+Foxp3+的T細胞數(shù)占CD4+T細胞數(shù)的百分比表示。Th17/Treg比值為CD3+CD8-IL-17A+的T細胞數(shù)和CD4+CD25+Foxp3+的T細胞數(shù)的比值。

1.2.6 細胞因子檢測 采用Luminex液相懸浮芯片技術。按說明書要求準備好血漿樣品、Serum Matrix、標準品、參照品，按照既定順序上樣；96孔板中每孔加入25 μl微珠、25 μl樣品和 25 μl Assay Buffer；取 50 μl準備好的稀釋標曲、Blank和參照品Control加入對應孔中，將96孔板貼上封口膜，850 r/min振蕩、4℃避光過夜孵育；棄去每孔中的樣品，洗滌3次；每孔中加入50 μl Detection Antibody，貼上封口膜，850 r/min振蕩、室溫避光孵育1 h；每孔加入50 μl Streptavidin-PE，貼上封口膜，850 r/min振蕩、室溫避光孵育30 min；洗滌3次；每孔中加入150 μl Sheath Fluid重懸微珠，貼上封口膜，850 r/min室溫避光振蕩5 min；將96孔板放入校正好的Luminex 200檢測儀中讀值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件、FlowJo軟件和GraphPad Prism 8軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者PBMC轉錄組測序分析 相較于緩解期GD組患者，難治性組GD患者PBMC中共篩選出265個顯著性差異表達基因，其中45個基因表達下調，211個基因表達上調，見圖1a（插頁）。KEGG富集分析顯示，難治性GD組患者PBMC中上調的差異基因主要在cytokine-cytokine receptor interaction、IL-17 signaling、NF-κB signaling、MAPK signaling、Th17 cell differentiation等與Th17細胞分化及下游效應細胞因子作用相關的信號通路富集，見圖1b（插頁）。GO分析顯示，上調的差異基因參與了cell chemotaxis、positive regulation of acute inflammatory response、leukocyte che‐motaxis等與炎癥和趨化相關的生物學過程，主要影響cytokine activity、cytokine receptor binding、receptor li‐gand activity、chemokine activity、chemokine receptor binding等分子功能，見圖1c、d（插頁）。

圖1 兩組患者PBMC轉錄組測序分析

2.2 兩組患者外周血Th17、Treg細胞比例分析 難治性GD組外周血中Th17細胞比例高于緩解期GD組，而Treg細胞比例低于緩解期GD組，Th17/Treg比值也高于緩解期GD組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2-4。

圖2 兩組患者外周血Th17細胞流式分析圖比較

圖3 兩組患者外周血Treg細胞流式分析圖比較

圖4 兩組患者外周血Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值比較

2.3 兩組GD患者血漿相關細胞因子水平比較 相較于緩解期GD組患者，難治性GD組患者外周血中IL-17A、IL-6、TGF-β1、IL-1β 及 IL-10的表達水平均增高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；但IL-23和TNF-α表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組GD患者血漿相關細胞因子水平比較（pg/ml）

3 討論

目前難治性GD的確切發(fā)病機制尚未完全闡明。本研究通過轉錄組測序技術篩選了難治性和緩解期GD患者PBMC中顯著性變化的差異表達基因。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，難治性GD患者PBMC中表達顯著上調的基因,主要在與Th17細胞分化及其效應細胞因子IL-17作用相關的信號通路富集。GO分析顯示，難治性GD患者表達上調的基因主要通過影響細胞因子、趨化因子的分子功能，參與了炎癥和趨化相關的生物學過程。以上結果提示，Th17細胞的過度分化及其下游效應因子的功能紊亂可能與GD的難治性密切相關。

既往研究表明，T淋巴細胞是自身免疫性甲狀腺疾病發(fā)病的重要參與因素[1]。Th17是CD4+T細胞的一種，其主要效應因子IL-17與受體結合后可以激活下游MAPK和NF-κB等炎癥信號轉導通路，促進炎癥因子、趨化因子以及黏附分子的大量分泌，參與多種炎癥反應和自身免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展。相反，Treg細胞是維持外周免疫耐受和機體免疫平衡的關鍵性CD4+T細胞亞群[6]。事實上，Th17細胞和Treg細胞分化都需要TGF-β介導的信號通路來起始，在IL-6或IL-21同時存在的條件下，原始CD4+T細胞分化為Th17細胞；而在缺乏促炎細胞因子的情況下，TGF-β則促使其分化成Treg細胞[7]。現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明Th17、Treg細胞失衡在類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化和炎癥性腸病等多種自身免疫性疾病中起著至關重要的作用[8-10]。但是，目前Th17、Treg細胞平衡與難治性GD關系的研究甚少。因此，本研究進一步檢測了難治性和緩解期GD患者外周血中Th17和Treg細胞比例。結果顯示，相較于緩解期GD組，難治性GD組患者外周血中Th17細胞比例升高，而Treg細胞比例降低，Th17/Treg比值也增高，說明Th17、Treg的平衡失調與GD的難治性密切相關。

本研究進一步檢測了難治性和緩解期GD患者血漿中相關下游效應細胞因子的表達水平。結果顯示，難治性GD組血漿中IL-17A、IL-6、TGF-β1、IL-1β及IL-10的表達水平高于緩解期GD組。IL-17A是Th17細胞最主要的效應因子，之前的細胞實驗發(fā)現(xiàn)，甲狀腺組織中存在功能性IL-17受體的表達，IL-17A與其結合可以促進甲狀腺細胞合成和分泌IL-6以及其他趨化因子、細胞間黏附因子[5]。此外，IL-17A還可以促進前體樹突狀細胞的分化和成熟，從而持續(xù)刺激T細胞活化增殖，產(chǎn)生IL-4、IL-10等細胞因子促進B細胞成熟并分泌自身抗體。同時在對類風濕性關節(jié)炎等慢性炎癥疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17A可以促進炎性細胞的活化，并誘導IL-1β等炎性細胞因子的釋放。IL-6具有刺激B細胞活化產(chǎn)生自身抗體、促進T細胞增殖以及細胞毒性T淋巴細胞活化等多重免疫調節(jié)功能。之前的研究發(fā)現(xiàn)，IL-17和TRAb均可促進甲狀腺細胞合成分泌IL-6，而IL-6可以進一步刺激B細胞分化成熟,增加甲狀腺自身抗體的產(chǎn)生[5,11]。此外，IL-6還能與TGF-β一起誘導Th17細胞的分化，從而形成正反饋調節(jié)，加劇甲狀腺局部的自身免疫炎癥反應。早期有研究發(fā)現(xiàn)，難治性GD患者血清中IL-10的表達水平顯著增高[12]。IL-10可以刺激IgG向IgG3亞型的轉換[13]，而多因素logistic回歸分析顯示，血清IgG3/IgG比值是難治性GD的獨立影響因素[14]。基因研究發(fā)現(xiàn)，難治性GD患者IL-1β基因-31位點的T等位基因攜帶頻率顯著高于緩解期GD患者，該等位基因攜帶者IL-1β合成增加[15]，而IL-1β又可以促進Th17細胞的分化和增殖，形成正反饋調節(jié)。

綜上所述，增高的IL-17A可以促進IL-6、IL-1β以及IL-10等細胞因子的表達，筆者推測這些因子之間可能通過相互作用，形成一個多效性的功能網(wǎng)絡，或通過刺激B細胞分化成熟,進一步增加甲狀腺內自身抗體的產(chǎn)生；或增強其他炎性細胞因子的功能，誘導持續(xù)的自身免疫反應；或能反過來促進Th17細胞的分化和增殖，形成正反饋調節(jié)，誘導甲狀腺局部持續(xù)的自身免疫炎性反應，從而導致難治性GD的發(fā)生。因此，Th17、Treg平衡失調以及下游相關效應細胞因子的免疫紊亂與GD的難治性密切相關，Th17、Treg細胞平衡可能是難治性GD免疫治療的新型有效靶點。