朱玉嬌，原 媛，王佳琪，張存莉，2

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西五丁生物科技有限公司 漢中市食用植物酵素研發(fā)與監(jiān)測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 724400）

苦瓜（Momordica charantia）又稱涼瓜、癩葡萄、錦荔枝，屬于葫蘆科草本植物[1-2]。苦瓜作為一種藥食同源品，營養(yǎng)豐富，除了含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素[3-4]外，還有一些特殊的化學(xué)成分，如苦瓜多糖、苦瓜皂苷、苦瓜蛋白、胰島素多肽、類黃酮化合物、生物堿等功能性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗病毒、抗菌、增強(qiáng)免疫力等生物活性功能[5-7]，是公認(rèn)的功能保健品，受到消費(fèi)者的青睞。

食醋是經(jīng)酵母菌、醋酸菌發(fā)酵制得的一種酸性調(diào)味品，除了含有乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸以及蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸等有機(jī)酸，還含有氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分。此外，食醋還具有多種保健功能，如軟化血管、促進(jìn)消化、解酒護(hù)肝、抗氧化、抗菌、降膽固醇、降糖等，在現(xiàn)代社會得到廣泛的應(yīng)用[8-10]。目前，已開發(fā)出多種醋飲料，如蘋果醋、山楂醋、茶醋、棗醋、燕麥醋、苦蕎醋等，成為一種新興的集風(fēng)味與營養(yǎng)并存的保健飲品。卜智斌等[11]利用醋酸桿菌（Acetobacter aceti）發(fā)酵駿棗果酒制備駿棗果醋，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵后乙酸和琥珀酸含量顯著增加，乳酸、草酸及總酚含量顯著降低，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率和總抗氧化能力顯著升高。劉杰超等[12]利用巴氏醋酸桿菌半液態(tài)深層發(fā)酵紅棗酒制備紅棗醋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后總酚和總黃酮含量以及DPPH和2,2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS+）自由基清除能力、Fe3+還原能力分別提高16.59%、42.98%、24.66%、38.07%和27.87%。趙鑫等[13]研究發(fā)現(xiàn)桑葚經(jīng)酵母菌和醋酸菌發(fā)酵后對羥基自由基和DPPH自由基具有較好的清除能力，清除率分別達(dá)到92.63%和94.48%。陳樹俊等[14]采用傳統(tǒng)制醋工藝制備苦蕎功能醋粉，研究發(fā)現(xiàn)其可顯著降低大鼠血壓和有效緩解大鼠體質(zhì)量、心率、肝質(zhì)量的非正常增長以及肝臟的過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）的非正常變化，并能夠顯著穩(wěn)定大鼠血清一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素（endothelin，ET）-1及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的含量。

然而，單純的醋制品還存在嗅味刺激性大、回味不長久及調(diào)味差等問題。研究表明，在食醋酵母菌發(fā)酵階段加入乳酸菌，可發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸，其可與酵母菌代謝產(chǎn)生的乙醇合成酯類物質(zhì)，起到緩和酸味，增加酯香氣味，使食醋口感柔和、醋味綿長的作用。此外，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶等，可分解蛋白產(chǎn)生氨基酸和短肽，使食醋口感更加醇厚，發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素，可抑制雜菌及多種致病菌的生長，提高食醋的穩(wěn)定性[15-17]。張盟等[18]采用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和巴氏醋酸桿菌協(xié)同發(fā)酵蘋果汁生產(chǎn)蘋果醋，發(fā)現(xiàn)其與單菌發(fā)酵蘋果醋相比，總多酚、總黃酮、維生素C及游離氨基酸含量顯著增多，并可顯著提高對DPPH、ABTS+和羥基自由基的清除能力。丁玉峰等[19]利用植物乳桿菌、釀酒酵母和巴氏醋酸桿菌協(xié)同發(fā)酵葡萄果汁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與葡萄果汁相比，總酚和總黃酮含量增加，對DPPH和ABTS+自由基的清除能力分別提高了51.45%和82.23%。

本研究擬采用乳酸菌、酵母菌、醋酸菌多菌種協(xié)同發(fā)酵苦瓜的方式，制備苦瓜醋，并對其發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)、有效成分及抗氧化活性和對膽酸鹽的結(jié)合能力進(jìn)行初步的探究，觀察苦瓜發(fā)酵前后的成分及活性變化情況，以期為苦瓜發(fā)酵產(chǎn)品的研發(fā)提供參考依據(jù)，也為更好地開發(fā)和利用苦瓜資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜：市售；乳酸菌（植物乳桿菌）：臺灣亞芯生物科技有限公司；葡萄酒高活性干酵母：安琪酵母有限公司；醋酸菌（滬釀1.01號醋酸菌）：上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司；DPPH（分析純）：酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；水楊酸、七水合硫酸亞鐵、30%過氧化氫（均為分析純）：廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；Tris-HCl緩沖液、焦性沒食子酸（分析純）、牛磺膽酸鈉（分析純）、甘氨膽酸鈉（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；MRS液體培養(yǎng)基：凱瑞生物科技有限公司。

醋酸菌活化培養(yǎng)基：葡萄糖1%、酵母浸粉1%、乙醇4%，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600B型紫外分光光度計(jì)：陜西科儀實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)維護(hù)工程有限公司；DHP-9052B型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Trace 1300氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、U3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：賽默飛世爾儀器有限公司；pH計(jì)、ME204E/02型精密分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦瓜醋的制備

乳酸菌活化：取適量植物乳桿菌菌粉接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)8～12 h，得乳酸菌活化液[20]。

酵母菌活化：將葡萄酒高活性干酵母按0.4 g/L接種至5%的糖水中，于37 ℃恒溫活化10～15 min，至液面有均勻的氣泡產(chǎn)生，即活化成功[9]。

醋酸菌活化：按1 g/L的接種量取適量醋酸菌接種至已滅菌醋酸菌活化培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，至發(fā)酵液pH≤4.5，總酸含量≥10 g/L（以醋酸計(jì)），即醋酸菌活化成功[9]。

苦瓜原液制備：稱取質(zhì)地完好的苦瓜干品200 g，加適量水煎煮90 min后，過濾，濾液濃縮至1 L，制得苦瓜原液。

苦瓜醋的制備：用白砂糖調(diào)苦瓜原液的可溶性固形物至17°Bx，然后將活化好的乳酸菌活化液按3%（V/V）的接種量接入已調(diào)糖苦瓜未發(fā)酵液中，于37 ℃無氧發(fā)酵24 h，之后再接入活化好的酵母菌，于28 ℃無氧共發(fā)酵10 d左右，60 ℃滅菌30 min后，再接入活化好的醋酸菌，于30 ℃有氧發(fā)酵50 d左右，制得苦瓜醋。

1.3.2 理化指標(biāo)檢測

總酸測定：參照GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》[21]；pH 測定：參照GB/T 10468—1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》[22]；乙醇測定：參照GB/T5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》[23]中的氣相色譜法進(jìn)行；總糖測定：按照參考文獻(xiàn)[9]采用蒽酮-硫酸法進(jìn)行測定。粗多糖：參照SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法》[24]測定；多酚：參照GB/T 31740.2—2015《茶制品第2部分：茶多酚》[25]測定；總黃酮：參照SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測定》[26]測定；有機(jī)酸：參考GB 5009.157—2016《食品中有機(jī)酸的測定》[27]測定；短鏈脂肪酸：參考文獻(xiàn)[28]的方法測定。

1.3.3 體外抗氧化活性研究

DPPH自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[29]進(jìn)行檢測；超氧陰離子自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[30]采用鄰苯三酚法進(jìn)行測定；羥基自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[31]采用水楊酸法進(jìn)行測定。

1.3.4 結(jié)合膽酸鹽能力研究[32-36]

人工胃液、人工腸液：按中國藥典2020版配制[32]。

取樣品液1 mL于具塞試管中，加入1 mL人工胃液，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h。然后用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.8，隨后加入4 mL人工腸液，37 ℃恒溫振蕩消化1 h。每個(gè)樣品中加入4 mL膽酸鹽溶液（甘氨膽酸鹽、?；悄懰猁}），37 ℃恒溫振蕩1 h，4 000 r/min離心20 min。精密量取2.5 mL上清液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的硫酸溶液7.5 mL，混勻，70 ℃水浴加熱20 min，取出，迅速冰浴5 min后，在波長387 nm處測定吸光度值。加樣品加膽酸鹽組記為Ai，加樣品不加膽酸鹽組記為Aj，不加樣品加膽酸鹽組記為A01，不加樣品不加膽酸鹽組記為A02，每個(gè)樣品平行測定3次。

采用相同質(zhì)量的檢測樣及考來烯胺，同法測定。對膽酸鹽吸附率進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算公式：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2021、SPSS 22.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)測定結(jié)果

微生物在發(fā)酵過程中pH和總酸的變化在一定程度上顯示了發(fā)酵的情況[37]。由圖1（a）可知，在發(fā)酵的前10天，主要進(jìn)行乳酸菌和酵母菌發(fā)酵，乳酸菌無氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，酵母菌無氧發(fā)酵產(chǎn)生乙醇和CO2，pH值迅速下降隨之平穩(wěn)，總酸緩慢上升。在發(fā)酵的第10天，加入醋酸桿菌，醋酸桿菌在有氧條件下利用乙醇生成乙酸和水[29]，總酸含量迅速上升，在第40天達(dá)到最高為（53.06±0.56）g/L，pH值降低隨之趨于平穩(wěn)。

圖1 苦瓜發(fā)酵過程中總酸含量和pH（a）、乙醇（b）及總糖（c）含量的變化Fig. 1 Changes of total acid contents and pH (a),contents of ethanol (b) and total sugar (c) during Momordica charantia fermentation

酵母菌發(fā)酵利用糖產(chǎn)生乙醇等代謝產(chǎn)物，乙醇含量的高低直接影響后期醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)乙酸等代謝產(chǎn)物含量的高低，也是判定發(fā)酵液是否正常的重要指標(biāo)之一[35]。由圖1（b）可知，在無氧條件下，酵母菌不斷消耗糖等產(chǎn)生乙醇，乙醇含量穩(wěn)步上升至無顯著變化，在發(fā)酵的第10天，乙醇含量達(dá)到（7.47±0.27）%。在發(fā)酵的第10～40天，醋酸菌主要通過消耗乙醇產(chǎn)生乙酸等，乙醇含量逐漸降低。在發(fā)酵的第40～60天內(nèi)，乙醇減少緩慢至無顯著變化，第60天乙醇含量為（0.01±0.001）%，醋酸菌發(fā)酵基本結(jié)束。

糖是微生物生長重要的營養(yǎng)物質(zhì)，糖含量的變化也是判定發(fā)酵是否正常的重要指標(biāo)之一[38]。由圖1（c）可知，在發(fā)酵的前5 d，酵母菌利用糖轉(zhuǎn)化生成乙醇，乙醇含量逐漸升高，總糖含量不斷減少，在發(fā)酵的第5～10天，總糖含量減少緩慢至無顯著變化，酵母菌發(fā)酵基本結(jié)束，在第10天，總糖含量為（8.12±0.57）mg/mL。在發(fā)酵的第10～60天內(nèi)，主要進(jìn)行醋酸菌發(fā)酵，總糖含量無明顯變化，在第60天醋酸菌發(fā)酵基本結(jié)束，總糖含量為（7.07±0.76）mg/mL。

2.2 苦瓜發(fā)酵前后有效成分含量的變化

2.2.1 苦瓜發(fā)酵前后粗多糖、多酚及黃酮含量的變化

本實(shí)驗(yàn)對苦瓜發(fā)酵前后的粗多糖、多酚、黃酮含量進(jìn)行測定，探究苦瓜發(fā)酵前后有效成分含量的變化情況，結(jié)果見圖2。

圖2 苦瓜發(fā)酵前后粗多糖、多酚及黃酮含量的變化Fig. 2 Changes of contents of crude polysaccharides,polyphenols and flavonoids before and after Momordica charantia fermentation

由圖2可知，苦瓜發(fā)酵后粗多糖含量顯著下降，由發(fā)酵前的（24.81±0.38）mg/mL下降至（6.55±0.47）mg/mL，表明粗多糖在發(fā)酵過程中被微生物分解利用。多酚和黃酮含量相比發(fā)酵前有所上升，分別由發(fā)酵前的（0.712±0.026）mg/mL和（0.238±0.045）mg/mL上升至（1.039±0.086）mg/mL和（0.516±0.080）mg/mL，可能是由于發(fā)酵過程中微生物作用有助于多酚類物質(zhì)的溶出和單體酚類物質(zhì)的合成[39]，從而提高了多酚、黃酮含量。

2.2.2 苦瓜發(fā)酵前后有機(jī)酸及短鏈脂肪酸含量的變化

對苦瓜發(fā)酵前后有機(jī)酸及短鏈脂肪酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。由表1可知，以相同質(zhì)量濃度的苦瓜原液為對照，苦瓜醋中草酸含量顯著下降（P＜0.01），乳酸、琥珀酸含量顯著增加（P＜0.01），此外發(fā)酵還產(chǎn)生了乙酸和丙酸；酒石酸、富馬酸含量有所下降（P＜0.05）；檸檬酸含量無顯著變化（P＞0.05）。不同物質(zhì)含量的變化與微生物發(fā)酵過程中物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

表1 苦瓜發(fā)酵前后有機(jī)酸及短鏈脂肪酸含量的變化Table 1 Changes of contents of organic acids and short-chain fatty acids before and after Momordica charantia fermentationmg/mL

2.3 抗氧化活性結(jié)果分析

將不同體積分?jǐn)?shù)的苦瓜原液和苦瓜醋進(jìn)行清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基能力對比，結(jié)果見圖3。

圖3 苦瓜發(fā)酵前后對DPPH自由基（a）、超氧陰離子自由基（b）、羥基自由基（c）的清除能力Fig. 3 Scavenging ability of DPPH radicals (a),superoxide radicals (b)and hydroxyl radicals (c) before and after Momordica charantia fermentation

由圖3（a）可知，在體積分?jǐn)?shù)為10%～50%范圍內(nèi)，苦瓜原液和苦瓜醋對DPPH自由基的清除能力都在緩慢增加。在體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，苦瓜原液的DPPH自由基的清除率為（41.69±1.90）%，苦瓜醋為（74.79±2.19）%。總體上，苦瓜醋清除DPPH自由基的能力明顯強(qiáng)于苦瓜原液，推測苦瓜發(fā)酵過程中釋放的酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性[40]，使得苦瓜醋表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

由圖3（b）可知，在體積分?jǐn)?shù)為5%～25%范圍內(nèi)，苦瓜發(fā)酵前后對超氧自由基都有一定的清除能力。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，苦瓜原液的超氧陰離子自由基的清除率為（62.74±0.47）%，苦瓜醋為（95.42±2.05）%。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，苦瓜經(jīng)過發(fā)酵之后對超氧陰離子自由基的清除能力顯著提升，推測發(fā)酵產(chǎn)生的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化物質(zhì)使苦瓜醋具有較強(qiáng)的清除活性氧的作用[41]。

由圖3（c）可知，在體積分?jǐn)?shù)為5%～20%區(qū)間內(nèi)，苦瓜原液對羥基自由基的清除能力始終低于苦瓜醋，在20%～25%區(qū)間內(nèi)，兩者逐漸趨于平穩(wěn)。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，苦瓜原液的羥自由基的清除率為（94.53±1.14）%，苦瓜醋為（96.77±1.57）%，結(jié)果顯示，苦瓜醋對羥自由基的清除能力是略強(qiáng)于苦瓜原液的。

2.4 苦瓜發(fā)酵前后結(jié)合膽酸鹽能力的研究

在體外條件下，模擬人體胃腸道環(huán)境進(jìn)行膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)，分析不同樣品對膽酸鹽的吸附能力，結(jié)果見表2。

表2 苦瓜發(fā)酵前后結(jié)合甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c的能力Table 2 Combining ability of sodium glycinecholate and sodium taurine before and after Momordica charantia fermentation

本試驗(yàn)以考來烯胺作為參照品可直觀的看出降脂的效果[42]。由表2可知，以1 mg/mL的考來烯胺作對照，相同質(zhì)量的苦瓜原液和苦瓜醋對甘氨膽酸鈉的結(jié)合能力依次為考來烯胺＞苦瓜原液＞苦瓜醋，苦瓜原液和苦瓜醋的甘氨膽酸鈉結(jié)合率與陽性對照均有極顯著差異（P＜0.01）；對牛磺膽酸鈉的結(jié)合能力依次為考來烯胺＞苦瓜原液＞苦瓜醋，苦瓜原液和苦瓜醋的牛磺膽酸鈉結(jié)合率與陽性對照均有極顯著差異（P＜0.01）。

由表2亦可知，苦瓜醋結(jié)合甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c的能力是高于苦瓜原液的，說明苦瓜經(jīng)過多菌種發(fā)酵后，代謝產(chǎn)生的成分變化在一定程度上能夠提高苦瓜結(jié)合膽酸鹽的能力，提高降脂能力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將苦瓜水提液經(jīng)乳酸菌、酵母菌、醋酸菌發(fā)酵，結(jié)果顯示多酚、黃酮含量分別比發(fā)酵前提高了45%、117%。此外，乳酸、琥珀酸含量顯著增加，并發(fā)酵產(chǎn)生了乙酸和丙酸，說明發(fā)酵有利于增加有機(jī)酸及短鏈脂肪酸的種類及含量。抗氧化試驗(yàn)表明，苦瓜醋對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除能力強(qiáng)于苦瓜原液，表明苦瓜醋具有較好的抗氧化活性。從體外結(jié)合膽酸鹽的能力分析，苦瓜醋結(jié)合膽酸鹽的能力強(qiáng)于苦瓜原液，且差異顯著（P＜0.01），具有較好的體外降脂能力。但人體的胃腸道是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，存在多種酶促反應(yīng)，體外結(jié)合膽酸鹽試驗(yàn)只是在模擬人體的腸道環(huán)境，因此苦瓜醋在人體胃腸道內(nèi)是否能取得同樣的效果，還需要進(jìn)一步探究。