蔣小鋒，李 云，王彥平*，焦 鐳，錢志偉，孔令明

（1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院 食品工程學院，河南 鄭州 451450；2.新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高和物流業(yè)的高速發(fā)展，馬肉也逐漸進入普通百姓的餐桌。馬肉具有蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低、膽固醇含量低等特點，含有較高的鐵元素和水溶性維生素，營養(yǎng)極其豐富[1]。但是，由于馬肉肉質(zhì)較粗，口感略差，因此，為了改善馬肉的加工特性和食品品質(zhì)，通常會采用一些加工手段來改善其嫩度。目前，利用外源酶對肉進行嫩化的研究已經(jīng)很多，而且大部分蛋白酶對肉都有較好的嫩化效果，可以顯著改善肉的口感，但外源蛋白酶是否對肉的揮發(fā)性風味物質(zhì)有影響的研究還不是很多。李文杰等[2]研究了酸性蛋白酶對酸肉發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)和風味品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)酸性蛋白酶可以顯著提高成熟酸肉中醇類、酸類、酯類、酮類和醛類物質(zhì)的種類和含量?？讜匝┑萚3]利用風味蛋白酶對臘肉進行處理后發(fā)現(xiàn)，添加適量的風味蛋白酶可以改善臘肉的風味，過量的蛋白酶則會降低臘肉的風味特征。杜慧穎等[4]分析了風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶酶解牡蠣肉的酶解產(chǎn)物的風味特征。發(fā)現(xiàn)酶解后醛類物質(zhì)的相對含量降低。而甘春生等[5]研究了添加外源蛋白酶對金華火腿成熟指標以及香氣成分的影響，發(fā)現(xiàn)添加外源蛋白酶對火腿的風味強度有輕微的削弱作用，但變化不大。羅珺等[6-7]分別研究了添加木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對臘肉揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)添加木瓜蛋白酶有利于臘肉中蛋白質(zhì)的降解，可以促進臘肉風味的形成，但對臘肉香味的整體影響不大，添加胰蛋白酶也有利于肉中蛋白質(zhì)的降解，游離氨基酸及揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量有所提高，會在一定程度上促進臘肉風味的形成。由此可見，外源蛋白酶對肉品風味的影響說法不一，有待做進一步的探索研究。

揮發(fā)性風味物質(zhì)分析一般采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技術(shù)，二者互相結(jié)合可以實現(xiàn)復雜有機化合物的分離和定性，是分析揮發(fā)性物質(zhì)的有效工具，具有操作簡單、效率高、靈敏度高等特點，目前廣泛應用于食品中揮發(fā)性物質(zhì)的檢測。因此，本試驗中采用固相微萃?。╯olid-phase micro extraction，SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，結(jié)合相對氣味活度值（relative odor activity values，ROAV）對馬肉主體揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析，研究在馬肉中添加木瓜蛋白酶后對其揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響，為在馬肉中合理利用外源蛋白酶提供一定的實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，以期進一步提高馬肉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬肉（馬后腿部半腱肌）：新疆昭蘇縣綠源食品有限責任公司；食品級木瓜蛋白酶（800 000 U/g）：南寧龐博生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

PL203電子分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DZ-260P臺式真空包裝機：上海青葩食品包裝機械有限公司；GR-20真空滾揉機：諸城市美邦機械有限公司；HR2003攪拌機：珠海經(jīng)濟特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司；Fiber 75 μm CAR/PDMS型萃取頭、7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將分割好的馬肉去除筋腱，分成等量多份，木瓜蛋白酶的添加量按照前期的優(yōu)化實驗結(jié)果（添加量15 U/g）進行添加[8]，采用注射法將木瓜蛋白酶液注入馬肉中，空白組注入等量水，注射完成后置于滾揉機中滾揉30 min，然后用真空包裝機真空包裝并置于4 ℃冰箱，放置1 d后取出待測。

1.3.2 風味物質(zhì)的測定

稱取適量的待測肉樣，加入6%的NaCl，混勻后置于打漿機將肉打碎，稱取3 g打碎后的馬肉放在15 mL頂空瓶中，快速用聚四氟乙烯隔墊封口。在60 ℃水浴中加熱30 min，然后將固相微萃取頭推出，頂空吸附15 min。萃取結(jié)束后將固相微萃取頭插入氣相色譜進樣口解吸，解吸溫度250 ℃，解吸時間5 min。

GC條件：TR-5MS毛細管色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm），載氣為氮氣（N2），進樣口溫度250 ℃，流速0.9 mL/min；起始溫度40℃，保持3min，以4℃/min升到120℃，最后以25℃/min升到250 ℃，保持10 min；進樣方式為分流進樣，分流比為5∶1。

MS條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI），電子能量70 eV，燈絲發(fā)射電流200 μA，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍30～450 m/z。質(zhì)譜譜庫為美國國家標準與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）05和Wiley質(zhì)譜庫。

定性定量：經(jīng)檢索出來的化合物與NIST 05譜庫和Wiley譜庫進行匹配。采用相似度＞80（最大值為100）的鑒定結(jié)果。圖譜中出現(xiàn)少量的硅氧烷為雜質(zhì)峰，這些峰是由萃取頭帶來的，所以在檢索樣品時需要扣除這些雜質(zhì)峰。各化合物峰面積由軟件系統(tǒng)計算，采用面積歸一法計算各揮發(fā)性成分在馬肉風味物質(zhì)中的相對含量。

參考劉登勇等[9]的方法，計算各成分的ROAV，據(jù)此確定主體揮發(fā)性成分。一般認為ROAV≥1的組分為所分析樣品的關(guān)鍵風味化合物，而0.1≤ROAV＜1的組分對樣品的總體風味具有重要的修飾作用。ROAV計算公式如下：

式中：ROAVi為組分i的相對氣味活度值；Ci為組分i的相對百分含量；Ti為組分i在水中的香味閾值；Cmax與Tmax為對樣品總體風味貢獻最大的組分的相對百分含量和香味閾值。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 19軟件中的單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）法對數(shù)據(jù)進行處理分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，每個實驗獨立重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶處理后馬肉的GC-MS檢測結(jié)果

采用SPME結(jié)合GC-MS測定馬肉中的揮發(fā)性風味物質(zhì)，結(jié)果見表1。由表1可知，在空白組馬肉中共檢出30種風味物質(zhì)，包括醇類化合物11種、醛類化合物7種、酮類化合物4種、酯類化合物3種、碳氫化合物5種。在木瓜蛋白酶處理組中共檢出25種風味物質(zhì)，包括醇類化合物5種、醛類化合物10種、酮類化合物2種、酯類化合物3種、碳氫化合物5種?？瞻捉M和木瓜蛋白酶處理組中相對含量最高的均是醛類化合物，分別是47.75%和68.56%，空白組醇類化合物的種類和相對含量是木瓜蛋白酶處理組的2倍多，空白組酮類化合物的相對含量是木瓜蛋白酶處理組的4倍多。酯類化合物和碳氫化合物的種類和相對含量均相當?？瞻捉M中，相對含量較高的是己醛（37.10%）、3-羥基-2-丁酮（14.83%）和己醇（14.10%），木瓜蛋白酶處理組中相對含量較高的是己醛（29.75%）和戊醛（25.56%）。

表1 木瓜蛋白酶處理馬肉揮發(fā)性風味成分GC-MS分析結(jié)果Table 1 Volatile flavor components results of horse meat treated with papain analyzed by GC-MS

由此可見，馬肉經(jīng)過木瓜蛋白酶處理后，揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類有所減少，醛類物質(zhì)的相對含量明顯變大。木瓜蛋白酶作為一種巰基蛋白酶，水解蛋白質(zhì)的能力很強，它可以將肌纖維蛋白和膠原蛋白等大分子物質(zhì)水解成多肽和氨基酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)在加熱的過程中，可能會和馬肉中的化合物發(fā)生反應，促進醛類化合物的生成，進而使醛類物質(zhì)的種類和相對含量明顯增加。醛類物質(zhì)是肉的主要風味成分，氣味閾值一般較低，醛類物質(zhì)含量越高，肉香味就越濃，這也說明馬肉經(jīng)過木瓜蛋白酶處理后，馬肉風味得到提高。

2.2 關(guān)鍵性風味物質(zhì)的分析

風味成分相對含量的高低并不能決定其對風味貢獻度的大小[10]，一般情況下，揮發(fā)性風味成分對風味的貢獻是由該成分的氣味閾值和相對含量共同決定的，有些物質(zhì)雖然相對含量很低，但氣味閾值也很低，所以，可能也會對整體風味起到重要的作用。因此，為進一步確定馬肉的關(guān)鍵風味物質(zhì)，采用ROAV法對檢出的各個揮發(fā)性風味物質(zhì)結(jié)合其氣味閾值進行更深入的分析，進而確定關(guān)鍵性風味物質(zhì)。一般認為，ROAV≥1的組分為所測樣品的主體揮發(fā)性成分，0.1≤ROAV＜1的組分對所測樣品的總體風味起重要修飾作用[11]。其中，飽和烷烴類物質(zhì)由于其氣味閾值很高[12]，幾乎不會產(chǎn)生明顯嗅感；對于含有16個碳原子以上的醇類、醛類和酯類等物質(zhì)，在正常的食品濃度范圍內(nèi)也幾乎沒有氣味[11]，因此，也不對該類物質(zhì)做詳細分析。各組關(guān)鍵性風味物質(zhì)及對應ROAV見表2。

表2 各組關(guān)鍵性風味物質(zhì)及對應相對氣味活度值Table 2 Key flavor substances in each group and corresponding relative odor

由表2可知，盡管在馬肉中檢出多種揮發(fā)性風味成分，但其實只有一小部分風味成分對馬肉的風味具有較大貢獻，大部分成分都為修飾性風味成分?？瞻捉M共檢出己醛、辛醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、癸醛、庚醛、戊醛、3-羥基-2-丁酮8種關(guān)鍵性風味成分；木瓜蛋白酶組共檢出己醛、辛醛、3-甲基丁醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醛、戊醛、3-羥基-2-丁酮、癸醛9種關(guān)鍵性風味成分；其中，己醛、辛醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醛、戊醛、癸醛為共有的關(guān)鍵性風味物質(zhì)。

2.3 討論

肉類風味物質(zhì)的前體物質(zhì)一般為氨基酸、肽、核酸、糖類、脂質(zhì)等，通過美拉德反應、脂質(zhì)氧化、斯特勒克降解反應以及降解產(chǎn)物之間相互反應等產(chǎn)生各種呈香物質(zhì)。肉的主要特征風味主要是醛類物質(zhì)，比較具有代表性的醛類物質(zhì)有戊醛、己醛、辛醛和壬醛等，具有脂肪香味。

在揮發(fā)性風味成分中，醇類物質(zhì)一般是由脂質(zhì)氧化形成的[15]，通常具有芳香、植物香和土氣香。己醇及其羧酸酯具有特殊的果香味和糖果味，主要存在于柑橘類和漿果中，目前，茶葉、薰衣草葉油、香蕉、蘋果、草莓、紫羅蘭葉油中均含有己醇，在空白組中的相對含量很高（14.10%），但由于其味覺閾值較高，為250 μg/kg，所以它在空白組中只是起到了一定的修飾作用（ROAV為0.68）。1-辛烯-3-醇的氣味閾值較低，為1 μg/kg，其是亞油酸或者其他多不飽和脂肪酸自動氧化的產(chǎn)物[16]，呈現(xiàn)蘑菇味、柑橘味、泥土味和玫瑰氣味[17-18]，同時還可加強肉中的脂肪香味[11]。在兩個處理組中均有檢出，雖然相對含量較低，但由于其味覺閾值很低，ROAV分別為16.37和40.08，所以它對馬肉風味的貢獻很大。

低分子質(zhì)量的醛類物質(zhì)（C3～C4）一般具有強烈的刺激性氣味，而相對分子質(zhì)量較大的醛類化合物（C5～C9）一般具有清香、油香和酯香，分子質(zhì)量更大的醛類物質(zhì)則具有柑橘的香味[19-20]。醛類物質(zhì)一般由不飽和脂肪酸在60 ℃氧化產(chǎn)生，其味覺閾值一般很低[21]，具有較強的揮發(fā)性，是一種比醇類物質(zhì)更重要的化合物[22]。從表2中可以看出，己醛、辛醛、壬醛、庚醛等低碳原子直鏈飽和脂肪醛的ROAV均＞1，由此可看出它們在兩個處理組的香氣成分中起到了非常重要的作用。其中，己醛和庚醛主要由亞油酸和花生四烯酸的氧化產(chǎn)生[23]，而辛醛和壬醛是由油酸氧化產(chǎn)生[24]。由此也可推測出馬肉中含有較多的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，因此具有較好的風味，而且營養(yǎng)價值很高。己醛的味覺閾值較低，為4 μg/kg，具有蘋果香、果香味和脂肪味，能夠賦予馬肉清新的果香味[25]，從表2中可以看出，其在兩組中ROAV都是最高的，因此，它對馬肉的風味貢獻最大。辛醛在各組的相對含量不高，但其味覺閾值僅為0.7 μg/kg，ROAV在兩組中分別達到了51.81和65.26。壬醛具有玫瑰味、橘皮味和脂肪味，在各組中均有較高的相對含量，ROAV分別為25.96和50.07。癸醛的味覺閾值更低，僅為0.1 μg/kg，具有橘皮味和甜瓜味，在兩組樣品的ROAV分別是6.06和49.91。戊醛具有果香和面包香[26]，在兩組的相對含量較高，其ROAV分別為1.82和32.22。因此，辛醛、壬醛、癸醛和戊醛對馬肉的風味均有較大貢獻。3-甲基丁醛具有巧克力味和堅果香味，在木瓜蛋白酶組的相對含量僅為1.23%，但由于其味覺閾值僅為0.2 μg/kg，所以其ROAV達到了93.03，因此，它對木瓜蛋白酶處理組的風味貢獻很大。但在空白組中未檢出該成分，原因可能是由于其相對含量過低，峰面積不明顯，導致未檢出該物質(zhì)。苯甲醛具有輕微的苦杏仁味，在木瓜蛋白酶處理組起到了一定的修飾作用（ROAV為0.26）。通過以上分析也可看出，醛類物質(zhì)對馬肉風味的貢獻率是最大的。

酮類揮發(fā)性風味物質(zhì)一般是由脂肪氧化和美拉德反應生成的[27]。3-羥基-2-丁酮具有令人愉悅的奶香味[27]，從表2可以看出，3-羥基-2-丁酮對空白組和木瓜蛋白酶處理組的風味貢獻均較大（ROAV≥1）。

此外，實驗中還檢出有一定量的酯類和碳氫化合物，但由于其味覺閾值較高，相對含量較低，因此，未做詳細分析，此類物質(zhì)可能對馬肉特有風味的形成具有一定協(xié)調(diào)和平衡作用。

3 結(jié)論

本實驗采用SPME結(jié)合GC-MS法，基于ROAV法對木瓜蛋白酶處理后的馬肉揮發(fā)性成分進行測定。在空白組馬肉中共檢出30種風味物質(zhì)，在木瓜蛋白酶處理組中共檢出25種風味物質(zhì)，己醛、辛醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、癸醛、庚醛、戊醛、3-羥基-2-丁酮為空白組馬肉的關(guān)鍵性風味成分；己醛、辛醛、3-甲基丁醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醛、戊醛、3-羥基-2-丁酮、癸醛為木瓜蛋白酶組的關(guān)鍵性風味成分；木瓜蛋白酶處理后馬肉風味中的醇類物質(zhì)種類明顯減少，醛類物質(zhì)種類增多。研究結(jié)果為木瓜蛋白酶在馬肉中的應用及其風味制品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。