黃小蘭，何旭峰，周祥德，周 濃，郭冬琴，楊 勤

（1.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404100；2.重慶三峽學院 生物與食品工程學院，重慶 404100；3.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學校中醫(yī)學院，重慶 404120）

地參（Lycopus lucidus）為唇形科地筍屬植物毛葉地筍（Lycopus lucidusvar.hirtusRegel.）的干燥根莖，又名蟲草參、地筍等[1]。地參營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量約5%，包含17種氨基酸成分[2]；總糖含量高達46%，包括可溶性多糖和還原糖[3]；除此之外，還富含多種礦物元素和維生素[4-5]，其飽滿脆嫩的根莖可作為蔬菜食用，享有“蔬菜珍品”、“山中之王”等美譽[6]?，F(xiàn)代研究證明，地參中含有多種活性成分，酚酸類物質(zhì)總量約7.4 mg/g[7]，白樺脂酸、熊果酸和齊墩果酸類三萜酸物質(zhì)含量約2.4 mg/g[8]，多糖含量約16%[3，9-10]，具有抗氧化、降血糖血脂、增強免疫力和抗腫瘤等作用[11-13]，保健價值突出。

地筍的地上部分為中藥材澤蘭，是其主要入藥部位[14]，地下部分地參一直被認為是非藥用部位而未被重視，造成資源浪費。地參除了直接當蔬菜食用外，初級加工品有干地參[15]和油酥地參[16]，產(chǎn)業(yè)延伸不長、附加值低。近年來，有學者利用微生物發(fā)酵技術(shù)，向牛奶中加入少量地參汁進行發(fā)酵制得地參復配凝固型酸奶[17]，采用地參酸辣發(fā)酵液制備地參酸辣發(fā)酵羊蹄[18]，但該類產(chǎn)品中地參均作為輔料參與，利用率低，且消費群體略顯狹窄，受眾面有限。因此，如何深度開發(fā)地參，提高利用率，產(chǎn)生經(jīng)濟價值顯得尤為必要。目前，以藥食同源類植物[19]、水果[20]等生產(chǎn)的發(fā)酵酒因其酒度低、營養(yǎng)豐富、清爽適口、風味典型等諸多優(yōu)勢，深受大眾喜愛，發(fā)展迅猛，而目前國內(nèi)外尚鮮見地參發(fā)酵酒的研究報道。

本研究以地參和糯米為原料制備地參發(fā)酵酒，采用單因素試驗和響應面法優(yōu)化其發(fā)酵工藝，并進行品質(zhì)分析。不僅能充分利用地參資源，提高其綜合利用價值，順應當前人們對養(yǎng)生保健的追求，還能帶動地參種植業(yè)的發(fā)展，促進農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展，助力鄉(xiāng)村振興。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮地參：采挖自重慶市萬州區(qū)恒合鄉(xiāng)石桶寨村；糯米：重慶巴子國農(nóng)業(yè)有限公司；釀酒曲（含釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、根霉（Rhizopus）、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和植酸酶）：安琪酵母股份有限公司；丹參素（純度＞98.8%）：上海安譜璀世標準技術(shù)服務有限公司；咖啡酸（純度＞99.8%）：壇墨質(zhì)檢標準物質(zhì)中心；迷迭香酸（純度＞90.5%）：中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設備

RetschGM200型刀式研磨儀：德國萊馳公司；WXT-A40型多功能電蒸籠：潮州市潮安區(qū)東鳳鎮(zhèn)沃喜同電器廠；30×30 cm溫控發(fā)酵桶：釀哥釀酒設備有限公司；精密酒精計（量程：0～100%，分度值：0.1%）：河間市振巖儀器儀表廠；LC-20AT型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；PL602E型百分之一天平：瑞士梅特勒·托利多儀器有限公司；MSE225S-CE-DU型十萬分之一電子天平：德國Sartorius公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 地參發(fā)酵酒加工工藝流程及操作要點

操作要點：

鮮地參、糯米預處理：取鮮地參洗凈泥沙，自然晾干水分至50%左右，然后用刀式研磨儀將其打碎成米粒大小。糯米去雜洗凈，加入50 ℃左右的溫熱水在室溫下浸泡過夜，使米粒充分吸水膨脹達到用手捻米粒時能呈粉狀，米粒浸透無白心。

蒸熟、攤涼：將地參與糯米（干質(zhì)量）按7∶3比例混合均勻，放入電蒸籠中蒸制45 min至物料無硬心，然后燜20 min左右。取出置于潔凈的紗布上，攤涼至30 ℃左右。

拌曲：將攤涼的物料置于發(fā)酵桶內(nèi)，按照一定的料液比添加純凈水，再按物料干質(zhì)量的0.5%稱取釀酒曲并加入其中，攪拌均勻，蓋蓋水封。

發(fā)酵：在26 ℃下發(fā)酵一定時間，待產(chǎn)氣量顯著下降后終止發(fā)酵。

過濾：待發(fā)酵完全后，取出用5層紗布擠壓過濾。

澄清、滅菌：取過濾后的地參發(fā)酵酒置于廣口瓶中，密封，70 ℃水浴熱處理20 min。

陳釀：取熱處理后的地參發(fā)酵酒于室溫下陳釀15 d。

1.3.2 發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

以得酒率、酒精度、總酸、殘?zhí)橇俊⒚缘闼?、感官評分等為評價指標，以鮮地參質(zhì)量為基準，糯米添加量分別為20%、25%、30%、35%、40%，蒸制45 min，混合料按照料液比1.0∶1.8（g∶mL）加入純凈水，接種0.5%的釀酒曲，在26 ℃條件下發(fā)酵8 d，考察不同的糯米添加量對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響。在此基礎上，依次考察料液比（1.0∶0.6、1.0∶1.0、1.0∶1.4、1.0∶1.8、1.0∶2.2（g∶mL））、釀酒曲接種量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、發(fā)酵溫度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃）、發(fā)酵時間（4 d、6 d、8 d、10 d、12 d）對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響。

1.3.3 地參發(fā)酵酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗基礎上，固定糯米添加量30%和料液比1.0∶1.8（g∶mL），選擇酒曲接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）3個因素為自變量，以酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為評價指標，設計3因素3水平Box-Benhnken試驗設計方案[21-22]，確定地參發(fā)酵酒的最佳發(fā)酵工藝條件，響應面試驗因素及水平見表1。

表1 地參發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design for fermentation process optimization of fermented Lycopus lucidus wine

1.3.4 得酒率計算

1.3.5 分析檢測

酒精度：按照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中酒精計法；總酸：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中指示劑法；殘?zhí)牵喊凑誈B/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法；甲醇：按照GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》；鉛：按照GB 5009.12—2017《食品安全國家標準食品中鉛的測定》。丹參素、咖啡酸、迷迭香酸含量測定：參照黃小蘭等[7]HPLC法。

1.3.6 感官評價

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中感官分析方法，選擇10位具有一定品酒知識和能力的人員組成感官評價小組，分別對地參發(fā)酵酒的外觀、香氣、口感和典型性4個方面按照表2的評分標準進行打分，滿分100分，結(jié)果取平均值。

表2 地參發(fā)酵酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented Lycopus lucidus wine

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件對測定數(shù)據(jù)進行處理和繪制試驗結(jié)果圖，結(jié)果以3次平均值表示，采用Design-Expert 8.0.6進行響應面試驗設計和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地參發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 糯米添加量的確定

不同糯米添加量對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響見圖1。由圖1可知，隨著糯米添加量在20%～40%范圍內(nèi)的增大，酒精度和殘?zhí)呛侩S之升高，但迷迭香酸呈現(xiàn)大幅下降趨勢。這是由于糯米的淀粉含量較高，同時迷迭香酸屬于地參的特征成分[7]。從感官評分上看，隨著糯米添加量在20%～40%范圍的增大，酒色逐漸從深棕色向橘紅色轉(zhuǎn)變，香氣也從較重的地參藥材味向米酒香氣變化，感官評分逐漸升高；并在糯米添加量為30%時，感官評分最高，為84.41分；但當糯米添加量為40%時，米酒香氣過濃，導致地參風格不明顯，感官評分略有下降。從得酒率和總酸指標來看，沒有明顯的變化規(guī)律，當糯米添加量為30%時，得酒率最高，為46.67%，總酸含量為3.45 g/L。因此，選擇最適糯米添加量為30%。

圖1 糯米添加量對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Fig. 1 Effect of glutinous rice addition on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.1.2 料液比的確定

不同料液比對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響見圖2。由圖2可知，隨著料液比在1.0∶0.6～1.0∶2.2（g∶mL）范圍內(nèi)的增加，酒精度、總酸、殘?zhí)呛兔缘闼犭S之降低。當料液比為1.0∶0.6～1.0∶1.4（g∶mL）時，地參酒理化品質(zhì)（酒精度、總酸、迷迭香酸）較高，但酒體顏色較深、光澤度較差，感官評分、得酒率較低，生產(chǎn)成本高；當料液比為1.0∶1.8（g∶mL）時，感官評分最高，為83.47分，酒精度為10.07%vol，得酒率為60.08%，總酸含量3.09 g/L，殘?zhí)呛?.10 g/L，迷迭香酸含量為27.28 g/L；而當料液比為1.0∶2.2（g∶mL）時，酒體顏色變得較淡，酒香味不足，味道寡淡，感官評分降低且得酒率也略微下降。因此，選擇最適料液比為1.0∶1.8（g∶mL）。

圖2 料液比對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of solid-liquid ratio on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.1.3 釀酒曲接種量的確定

不同釀酒曲添加量對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響見圖3。由圖3可知，隨著接種量在0.1%～0.9%范圍內(nèi)的增大，迷迭香酸含量變化不明顯。殘?zhí)呛侩S著接種量在0.1%～0.9%范圍內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢，因為釀酒曲越多，更有利于酵母將糖類物質(zhì)充分分解轉(zhuǎn)化為酒精，酒精度升高。酒曲接種量為0.5%時，感官評分為82.47分，酒精度為10.36%vol，總酸含量3.01 g/L，殘?zhí)呛?.48 g/L，迷迭香酸含量為27.89 g/L。但當酒曲接種量＞0.7%時，酒精度反而略有降低，可能是因為酒曲量過多，發(fā)酵初期酵母基數(shù)大，繁殖迅速，消耗大量糖分物質(zhì)，快速積累的代謝物過早抑制了酵母的活性[23]，且此時總酸的增量不明顯，同時，大量的酵母菌殘留對地參發(fā)酵酒的風味和口感產(chǎn)生了不良影響[24]，感官評分下降，僅為76.20分。接種量為0.1%時，殘?zhí)橇孔罡邽?.86 g/L，酒精度也最低為9.58%vol，底物未被充分利用。因此，選擇最適釀酒曲接種量為0.5%。

圖3 釀酒曲接種量對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of Jiuqu inoculum on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度影響根霉、酵母的生長和繁殖，從而影響發(fā)酵能力的大小[25]。本試驗結(jié)合根霉、釀酒酵母的最適生長溫度22～30 ℃。不同發(fā)酵溫度對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響見圖4。由圖4可知，當發(fā)酵溫度為22～26 ℃時，根霉和淀粉酶的活力不足，不能迅速將淀粉類物質(zhì)分解為單糖，積累足夠的糖類物質(zhì)供酵母發(fā)酵，造成酒精度不高。發(fā)酵溫度為26 ℃時，根霉、酵母菌生長速率適宜，所得地參發(fā)酵酒酒精度最高為10.54%vol，感官評分最高為83.00分，同時浸出的迷迭香酸含量隨著溫度的升高緩慢增加，為27.80 g/L，總酸含量為2.80 g/L，殘?zhí)呛?.69 g/L。當發(fā)酵溫度＞26 ℃之后，根霉、酵母菌的生長繁殖快，新陳代謝旺盛，產(chǎn)酒能力強，但同時較高的溫度易引起酒精、揮發(fā)性風味物質(zhì)損失[26]，造成酒精度下降，酸味較重，香氣口感較差，感官評分降低。因此，選擇最適發(fā)酵溫度為26 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of fermented temperature on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.1.5 發(fā)酵時間的確定

不同發(fā)酵時間對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響見圖5。由圖5可知，當發(fā)酵時間為4～8 d時，隨發(fā)酵時間的延長，酒精度、總酸、迷迭香酸含量升高，殘?zhí)橇拷档?。當發(fā)酵時間為8 d時，感官評分最高，為83.12分，酒精度為10.21%vol，總酸含量2.80 g/L，殘?zhí)呛?.42 g/L，迷迭香酸含量為27.56 g/L。發(fā)酵時間＞8 d后，酒精度出現(xiàn)下降趨勢，酒體酸味加重，可能是隨著發(fā)酵時間的延長，乙醇向乙酸發(fā)生了轉(zhuǎn)變，此時口感也略差。因此，選擇最適發(fā)酵時間為8 d。

圖5 發(fā)酵時間對地參發(fā)酵酒品質(zhì)的影響Fig. 5 Effect of fermentation time on the quality of fermented Lycopus lucidus wine

2.2 地參發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 地參發(fā)酵酒響應面試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗基礎上，固定糯米添加量30%和料液比1.0∶1.8（g∶mL），選擇酒曲接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）3個因素為自變量，以酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為評價指標，進行3因素3水平Box-Benhnken試驗設計，結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 地參發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Benhnken experiments for fermentation process optimization of fermented Lycopus lucidus wine

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6軟件，對表3結(jié)果進行回歸擬合分析，建立二次回歸方程如下：Y1=10.29+0.051A+0.48B+0.48C+0.11AB-0.033AC-0.18BC+0.040A2-0.45B2-0.12C2；Y2=87.31+0.68A+3.00B+3.37C+0.66AB-0.86AC-1.15BC-3.09A2-4.38B2-2.38C2。

由表4可知，酒精度模型中F值=20.92，P值=0.000 3（P＜0.01），表明地參發(fā)酵酒酒精度與3因素之間回歸效果極顯著，失擬項P值=0.139 9（P＞0.05），即失擬項相對于純誤差不顯著，表明該模型能夠較顯著擬合地參發(fā)酵酒酒曲接種量、發(fā)酵溫度和時間對酒精度的影響。模型的決定系數(shù)R2=0.964 1，校正決定系數(shù)R2Adj=0.918 0，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=1.60%，說明該模型96.41%的數(shù)據(jù)的可變性可用此模型解釋，只有1.60%的變異不能由該模型解釋。感官評分模型中F值=26.27，P值=0.000 1（P＜0.01），表現(xiàn)為極顯著，失擬項P值=0.981 2（P＞0.05），模型的決定系數(shù)R2=0.971 2，校正決定系數(shù)R2Adj=0.934 3，變異系數(shù)CV=1.44%。由此表明所建的酒精度和感官評分模型擬合成功。

由P值可知，在各因素中，一次項B、C和二次項B2對酒精度和感官評分均表現(xiàn)為極顯著的影響（P＜0.01），交互項BC對酒精度表現(xiàn)為顯著影響（P＜0.05），二次項A2、C2對感官評分影響極顯著（P＜0.01），其余均表現(xiàn)為不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可知，影響地參發(fā)酵酒酒精度的因素順序為：發(fā)酵溫度（B）＞發(fā)酵時間（C）＞釀酒曲接種量（A）；影響感官評分的因素順序為：發(fā)酵時間（C）＞發(fā)酵溫度（B）＞釀酒曲接種量（A）。

2.2.2 響應面分析

利用Design-Expert 8.0.6得到二次回歸方程的響應面，其曲面圖代表兩個試驗的交互作用，坡度大小判斷因素對響應值的影響程度，各因素交互作用對感官評分和酒精度影響的響應面及等高線見圖6。

圖6 各因素間交互作用對感官評分和酒精度影響的響應面及等高線Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory score and alcohol content

由圖6可知，發(fā)酵溫度對酒精度和感官評分的影響強于接種量。當發(fā)酵溫度不變時，隨著接種量的提高，酒精度緩慢升高，當接種量達到0.7%時，酒精度達到最高，感官評分呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在接種量為0.5%時，評分最高；當接種量不變時，隨著發(fā)酵溫度的上升，酒精度和感官評分均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當發(fā)酵溫度為27 ℃時，酒精度達到最高，當發(fā)酵溫度為26 ℃時，感官評分達到最高。由圖6可知，發(fā)酵時間對酒精度和感官評分的影響強于接種量。當接種量不變時，隨著發(fā)酵時間的增長，酒精度和感官評分均呈上升趨勢，當發(fā)酵時間達到10 d時，酒精度到達最高，當發(fā)酵時間達到9 d時，感官評分到達最高；當發(fā)酵時間不變時，隨著接種量的上升，酒精度呈緩慢上升趨勢，當接種量為0.7%時，酒精度達到最高，感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當接種量為0.5%時，感官評分到達最高。

由圖6亦可知，發(fā)酵溫度對酒精度和感官評分的影響強于發(fā)酵時間。當發(fā)酵時間不變時，隨著發(fā)酵溫度的升高，酒精度和感官評分呈先上升后下降的趨勢，當發(fā)酵溫度達到27 ℃時，酒精度到達最高，當發(fā)酵溫度達到26 ℃時，感官評分到達最高；當發(fā)酵溫度不變時，隨著發(fā)酵時間的增長，酒精度呈上升趨勢，當發(fā)酵時間達到10 d時，酒精度達到最高，感官評分呈先上升后下降的趨勢，當發(fā)酵時間達到9 d時，感官評分達到最高。

總的來看，發(fā)酵溫度對酒精度和感官評分的影響最強，其次為發(fā)酵時間，最后為接種量。

2.3 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到其最佳發(fā)酵工藝為釀酒曲接種量0.46%，發(fā)酵溫度26.89 ℃，發(fā)酵時間8.78 d。在此優(yōu)化條件下，酒精度預測值為10.42%vol，感官評分預測值為87.37分。為檢驗模型的準確性，結(jié)合生產(chǎn)實際，修正最佳發(fā)酵工藝為釀酒曲接種量0.50%，發(fā)酵溫度27 ℃，發(fā)酵時間9 d。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，得到酒精度實際值為10.37%vol，感官評分實際值為87.69分，與預測值接近。因此，響應面法對地參發(fā)酵酒發(fā)酵條件的優(yōu)化是可行的。

2.4 地參發(fā)酵酒理化指標分析

取地參發(fā)酵酒進行理化指標測定，結(jié)果表明，總糖含量（以葡萄糖計）為13.12 g/L；總酸含量（以乙酸計）為3.24 g/L；丹參素含量為26.06 mg/L，迷迭香酸含量為32.18 mg/L，咖啡酸含量為36.84 mg/L。甲醇和鉛均未檢出。

3 結(jié)論

本研究利用地參和糯米為原料進行地參酒發(fā)酵。在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優(yōu)化得到地參發(fā)酵酒的最優(yōu)發(fā)酵工藝為釀酒曲接種量0.50%，發(fā)酵溫度27 ℃，發(fā)酵時間9 d時。在此條件下，地參發(fā)酵酒酒色呈橘紅色，透明度好，有地參特有的香氣和米酒的清香，無異味，口感清甜純正，和諧爽口，富含酚酸類功能性成分，保健價值突出，開發(fā)前景廣闊。