劉俐彤，王 超，陶 亮，3，4，盛 軍，3，4，趙存朝，田 洋，3，4

（1.云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201；2.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201；3.食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；4.云南省藥食同源功能食品工程研究中心，云南 昆明 650201）

核桃又稱胡桃（Juglans regia），胡桃科胡桃屬植物，世界四大堅果之一，其種植面積和產(chǎn)量均呈快速增長趨勢，有良好的市場開發(fā)前景。核桃富含多種對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)：蛋白質(zhì)、維生素、多酚、不飽和脂肪酸[1-4]等，具有降血脂[5]、抗疲勞[6]、抗癌[7]等功效。其中，核桃仁含有61%～74%的油脂、15%～19%的蛋白質(zhì)、8%～13%的碳水化合物[8]，具有較高的開發(fā)利用價值及營養(yǎng)價值。常溫酸奶，又稱“滅菌型酸奶”，與其他酸奶的制作工藝相比多一次殺菌[9]，這使其可在4～25 ℃條件下保存4～6個月左右，大大延長了貨架期，減少運輸成本，拓寬了消費者的酸奶選擇范圍。2020年，中國衛(wèi)生監(jiān)督協(xié)會發(fā)布團體標準T/WSJD 12—2020《植物蛋白飲料植物酸奶》，并給出了關(guān)于植物酸奶的定義，即植物酸奶是以含有一定蛋白質(zhì)的植物和（或）其制品為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后pH 值降低，發(fā)酵前或發(fā)酵后添加或不添加非動物來源配料，加工制成的植物蛋白飲料產(chǎn)品[10]。植物基酸奶將酸奶中的“動物原料”換成“植物原料”，利用植物原料低脂肪[11]、低熱量、可降低膽固醇[12]等特點，有效避免乳糖不耐癥[13]人群，減少了動物飼養(yǎng)成本[14]，提高了酸奶的營養(yǎng)價值以及功能特性。目前，市場上的植物基酸奶種類單一且存在很多問題：大豆植物基酸奶，較難解決大豆自帶的豆腥味以及過敏反應(yīng)[15]；燕麥植物基酸奶中燕麥谷物類自帶的粘度以及不溶解性，使其口感及質(zhì)構(gòu)不佳[16]；純椰漿植物基酸奶蛋白質(zhì)含量較低，色澤偏暗，導(dǎo)致其口感及風味欠佳[17]。

綜合考慮核桃仁的健康益處和消費者需求，本研究以核桃仁為主要原料制備核桃仁酸奶，利用單因素試驗考察菌種添加量、核桃漿料液比、穩(wěn)定劑添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度因素對常溫植物基核桃酸奶感官評分的影響，并在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化其發(fā)酵工藝。旨在開發(fā)一款方便、營養(yǎng)、美味的常溫植物基核桃酸奶，為國內(nèi)常溫植物基核桃酸奶的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃仁：大理漾濞核桃有限責任公司；白砂糖：市售；穩(wěn)定劑（代號HBT-A3168、HBT-A1402、HBT-A5370、HBTA8750）：江蘇豪蓓特食品化學有限公司；直投式菌種[乳酸菌Mild 1.0、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）kT-A8、乳酸菌R704（包含乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）和乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris））]：科漢森菌種生物科技公司；奶酪香精：河南萬邦實業(yè)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JMS60膠體磨：常州華奧儀器制造有限公司；150磨漿機：廣西南寧旭昆機電設(shè)備有限公司；HJJ-6水浴恒溫電動攪拌器：常州華奧儀器制造有限公司；RW-20攪拌器：日本IKA公司；SVJ-358智能商用型酸奶機：北京世紀陽光有限公司；VL-7F落地式低速冷凍離心機：長沙市百諾克離心機儀器有限公司；SRH高壓均質(zhì)機：上海申鹿均質(zhì)機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 常溫植物基核桃酸奶的加工工藝流程及操作要點

去皮核桃仁→粗磨→細磨→過濾去渣→預(yù)熱→混料→均質(zhì)→滅菌→發(fā)酵→破乳→調(diào)香→殺菌→無菌灌裝→常溫植物基核桃酸奶成品

操作要點：新鮮的去皮核桃仁用水清洗5次以上并浸泡一夜，將核桃仁加適量純凈水勻速倒入磨漿機，得均一漿液，倒入膠體磨，經(jīng)過濾除渣得到細膩順滑的核桃漿。向核桃漿內(nèi)加入適量的穩(wěn)定劑和8%白砂糖，溫度控制在45～60 ℃，在壓力為20 MPa下均質(zhì)5 min，均質(zhì)后將核桃漿放入高壓滅菌鍋中，在90 ℃的條件下滅菌15 min，然后冷卻至42 ℃。在無菌操作的條件下，將其放入酸奶機中，接種一定量的發(fā)酵劑，發(fā)酵溫度為42 ℃，發(fā)酵時間7 h。發(fā)酵完成后的核桃酸乳于攪拌器中1 000 r/min攪拌3 min，添加0.01%奶酪香精進行調(diào)香，充分混勻并封口。在75 ℃條件下殺菌25 s后冷卻至12 ℃，即得常溫植物基核桃酸奶成品。

1.3.2 常溫植物基核桃酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

以感官評分及酸度為指標，發(fā)酵溫度為42 ℃，發(fā)酵時間為7 h，發(fā)酵劑菌種總添加量為0.4%時，對直投式乳酸菌種Mild1.0、kT-A8、R704、Mild1.0 ∶kT-A8=1 ∶1、Mild1.0 ∶R704=1∶1、kT-A8∶R704=1∶1進行篩選及菌種復(fù)配比例的確定。

在此基礎(chǔ)上，以酸度及感官評分為評價指標，依次考察發(fā)酵劑添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）、核桃仁與水料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（kg∶L））；穩(wěn)定劑種類（HBT-A3168、HBT-A1402、HBT-A5370、HBT-A8750）及添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、發(fā)酵時間（5 h、7 h、9 h、11 h、13 h）、發(fā)酵溫度（36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃）對常溫植物基核桃酸奶產(chǎn)品品質(zhì)的影響。

1.3.3 常溫植物基核桃酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

以感官評分（Y）為響應(yīng)值，考察發(fā)酵時間（X1）、發(fā)酵劑添加量（X2）、核桃仁與水料液比（X3）3個因素對結(jié)果的影響，利用Box-Behnken[18]試驗設(shè)計3因素3水平試驗，優(yōu)化常溫植物基核桃酸奶發(fā)酵工藝。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation technology optimization

1.3.4 感官評價

常溫植物基核桃酸奶的感官評價參考國標GB 19302—2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》的規(guī)定進行。由20名有一定品評經(jīng)驗的專業(yè)人員組成評定小組，分別從色澤（20分）、組織狀態(tài)（20分）、氣味（30分）、滋味（30分）4項指標對常溫植物基核桃酸奶采用百分制打分，具體感官評分標準見表2。

表2 常溫植物基核桃酸奶的感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standards of plant-based walnut yogurt at room temperature

1.3.5 分析檢測

酸度：根據(jù)GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》中的酚酞指示劑法[19]；蛋白質(zhì)含量：根據(jù)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法[20]；脂肪含量：根據(jù)GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的蓋勃氏法進行測定[21]；凝乳時間：酸奶瓶傾斜30 °，以酸奶無流動時刻作為酸奶凝乳時間；霉菌和酵母：參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)》[22]；乳酸菌：參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[23]；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》[24]；致病菌：參照GB 29921.3—2021《食品安全國家標準預(yù)包裝食品中致病菌限量》[25]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013、SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，利用Design-Expert 8.0.6進行響應(yīng)面分析，每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫植物基核桃酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同發(fā)酵菌種種類及添加量對常溫植物基核桃酸奶的影響

不同乳酸菌種類（添加量均為0.4%）對常溫植物基核桃酸奶感官評分、酸度、活菌數(shù)及凝乳時間的影響結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵菌種篩選試驗結(jié)果Table 3 Screening tests results of fermentation strains

由表3可知，當發(fā)酵菌種為Mild1.0∶R704=1∶1時，其感官評分最高，為（87.84±0.43）分，使核桃風味完全釋放，又保留了酸奶獨特風味。采用單一發(fā)酵菌種發(fā)酵凝乳時間過長，酸度較低，活菌數(shù)量較少，甚至產(chǎn)生刺激性氣味。采用乳酸菌kT-A8作為發(fā)酵劑，酸度僅達28°T，活菌數(shù)量僅為0.7×107CFU/mL。采用復(fù)配菌種進行發(fā)酵，可增加活菌數(shù)量、提高酸度。采用Mild1.0∶R704=1∶1作為發(fā)酵劑后，酸度和活菌數(shù)量有了明顯提高，分別為43°T、4.5×109CFU/mL。不同的菌種發(fā)酵后會產(chǎn)生不同的揮發(fā)性風味物質(zhì)，揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的多少及其相互作用都會影響最終產(chǎn)品的風味[26]，復(fù)配菌種所產(chǎn)生的協(xié)同作用香味物質(zhì)使得常溫植物基核桃酸奶風味醇厚。因此，最佳發(fā)酵菌種為Mild1.0∶R704=1∶1。

以乳酸菌Mild1.0∶R704=1∶1混合為發(fā)酵劑，不同發(fā)酵劑添加量對常溫植物基酸奶的感官評分及酸度的影響見表4。由表4可知，當發(fā)酵劑添加量為0.2%～0.6%時，活菌數(shù)量在發(fā)酵劑添加量0.4%時最高，為5.9×109CFU/mL；酸度在發(fā)酵劑添加量為0.5%時出現(xiàn)最低值39°T，凝乳時間在發(fā)酵劑添加量為0.3%時出現(xiàn)最高值12 h；當發(fā)酵劑添加量為0.6%時，其感官評分最高，為（89.20±0.56）分，酸度、凝乳時間、乳酸菌數(shù)分別為53°T、4.5 h、6.7×107CFU/mL；當發(fā)酵劑添加量為0.6%～0.7%時，酸度無明顯變化、凝乳時間增長、乳酸菌數(shù)減少及感官評分也隨著下降。因此，混合發(fā)酵劑最適添加量為0.6%。

表4 發(fā)酵劑添加量篩選試驗結(jié)果Table 4 Screening tests results of starter addition

2.1.2 不同核桃仁與水料液比對常溫植物基核桃酸奶的影響

不同核桃仁與水料液比對常溫植物基核桃酸奶的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，當料液比為1∶1～1∶3（kg∶L）時，感官評分持續(xù)增加，而酸度出現(xiàn)稍許降低后增加的趨勢；當料液比達到1∶3（kg∶L）時，感官評分達最大值，為（85±2.40）分，酸度為（47±0.98）°T；當料液比為1∶3～1∶5（kg∶L）時，感官評分和酸度均逐步下降。這是由于料液比過大時，核桃仁的酮類香味[27]不突出，口感偏淡；當料液比過小時，核桃漿濃度過大，導(dǎo)致核桃香氣過重，無法均勻呈現(xiàn)香味，口感下降，引發(fā)不適。因此，最適料液比為1∶3（kg∶L）。

圖1 料液比對常溫植物基核桃酸奶品質(zhì)的影響Fig. 1 Effect of material-liquid ratio on quality of plant-based walnut yogurt at room temperature

2.1.3 不同穩(wěn)定劑種類及添加量對常溫植物基核桃酸奶的影響

不同穩(wěn)定劑種類（添加量均為5%）對常溫植物基核桃酸奶品質(zhì)的影響見表5。由表5可知，當采用穩(wěn)定劑HBT-A3168時，感官評分達最大值，為（89.92±0.57）分，且凝乳時間較短，為5.0 h，有利于提高生產(chǎn)效率，酸度達46 °T，能均勻地呈現(xiàn)常溫植物基核桃酸奶的風味。因此，最適穩(wěn)定劑為HBT-A3168。

表5 穩(wěn)定劑種類篩選試驗結(jié)果Table 5 Test screening tests results of stabilizer types

穩(wěn)定劑HBT-A3168添加量對常溫植物基核桃酸奶品質(zhì)的影響見圖2。由圖2可知，當穩(wěn)定劑HBT-A3168添加量在2%～8%時，感官評分、酸度隨之增加；當穩(wěn)定劑HBTA3168添加量為6%時，感官評分達最大值，為（86±0.98）分，酸度為42°T；當穩(wěn)定劑HBT-A3168添加量＞6%之后，感官評分下降、酸度下降后緩慢回升。這是因為適量添加的穩(wěn)定劑降低了常溫植物基酸奶乳清的析出率，穩(wěn)定了植物基蛋白。因此，最適穩(wěn)定劑HBT-A3168的添加量為6%。

圖2 穩(wěn)定劑HBT-A3168添加量對常溫植物基核桃酸奶品質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of stabilizer HBT-A3168 addition on the quality of plant-based walnut yogurt at room temperature

2.1.4 不同發(fā)酵時間對常溫植物基核桃酸奶的影響

不同發(fā)酵時間對常溫植物基核桃酸奶品質(zhì)的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，當發(fā)酵時間為5～7 h時，感官評分及酸度隨發(fā)酵時間增加而增加；當發(fā)酵時間為7 h時，感官評分達最高，為（87.86±0.68）分，酸度為39°T；當發(fā)酵時間＞7 h 時，感官評分持續(xù)下降、酸度持續(xù)上升。發(fā)酵時間過短導(dǎo)致其發(fā)酵不完全，酸奶風味及口感未完全體現(xiàn)；發(fā)酵時間過長，乳清析出過多，酸奶過酸影響口感。其次，由于乳酸菌的減少，酸奶容易受雜菌污染而影響酸奶的品質(zhì)[28]。因此，最適發(fā)酵時間為7 h。

圖3 發(fā)酵時間對常溫植物基核桃酸奶品質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on the quality of plant-based walnut yogurt at room temperature

2.1.5 不同發(fā)酵溫度對常溫植物基核桃酸奶的影響

不同發(fā)酵溫度對常溫植物基核桃酸奶品質(zhì)的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，當發(fā)酵溫度為36～42 ℃時，感官評分及酸度均隨之增高；當發(fā)酵溫度為42 ℃時，感官評分達到最高，為（82±1.2）分，酸度為42°T；當發(fā)酵溫度＞42 ℃之后，感官評分出現(xiàn)下降、酸度呈上升趨勢。發(fā)酵溫度過低，導(dǎo)致有益菌不夠活躍，導(dǎo)致酸奶口感較差；發(fā)酵溫度過高，抑制其益生菌生長，影響酸奶發(fā)酵。適宜的發(fā)酵溫度可縮短凝乳時間，提高生產(chǎn)效率，賦予常溫植物基核桃酸奶細膩飽滿的口感。因此，最適發(fā)酵溫度為42 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對常溫植物基核桃酸奶品質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on the quality of plantbased walnut yogurt at room normal temperature

2.2 常溫植物基核桃酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

基于Box-Behnken 設(shè)計，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6軟件進行分析，選取發(fā)酵時間（X1）、發(fā)酵劑添加量（X2）、料液比（X3）3個因素，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗對常溫植物基核桃酸奶加工工藝進行優(yōu)化，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6，方差分析見表7。

將所得試驗數(shù)據(jù)利用Design Expert 8.0.6軟件對表6數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=88.84+1.33X1+2.91X2+1.51X3-0.8X1X2-0.87X1X3-2.44X2X3-7.20X12-5.95X22-3.44X32

表6 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments for optimization of fermentation technology

由表7可知，該回歸模型的P值＜0.000 1，說明回歸模型的影響達到極顯著水平（P＜0.01）；回歸模型失擬項P=0.227 5＞0.05，表明二次回歸模型與實際試驗擬合性充分，模型失擬不顯著，表明此模型可用于試驗擬合。模型的決定系數(shù)R2=0.985 1，表明該模型能解析98.51%的響應(yīng)值變化，存在1.49%的總變異，說明該模型擬合程度相對較好，試驗誤差較小。校正決定系數(shù)R2adj=0.965 9，說明該模型響應(yīng)值的變化有96.59%來源于所選變量。響應(yīng)值Y的變異系數(shù)（coefficient ofvariation，CV）與試驗精確度和重復(fù)性成反比，其CV=1.39%＜5%，說明試驗的精確度和重復(fù)性較高，且可信度較高。由P值可知，一次項X2和X3、二次項X12和X22對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；一次項X1、交互項X2X3、二次項X32對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，各因素對感官評分的影響順序為：X2（發(fā)酵劑添加量）＞X3（料液比）＞X1（發(fā)酵時間）。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

2.2.2 各因素間交互作用的影響

如圖5所示，交互項X2X3的曲面傾斜度較大，坡度較陡，且等高線呈橢圓形，較密集，說明其交互作用影響顯著（P＜0.05），反之，X1X2、X1X3交互作用影響不顯著（P＞0.05），各因素間交互作用對常溫植物基核桃酸奶的感官評分的影響大小依次為X2X3＞X1X3＞X1X2，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素間交互作用對常溫植物基核桃酸奶感官評分影響的響應(yīng)面及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of plant-based walnut yogurt at normal temperature

2.2.3 常溫植物基核桃酸奶最佳條件的確定和驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6分析得到常溫植物基核桃酸奶的最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵劑添加量6.14%，料液比1.00∶3.21（kg∶L），發(fā)酵時間7.28 h，在此優(yōu)化條件下，常溫植物基核桃酸奶感官評分理論值為（89.23±0.45）分。為了驗證模型的精準性，考慮到實際操作的可行性，將發(fā)酵工藝參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵劑添加量0.6%，料液比1∶3（kg∶L），發(fā)酵時間7 h，在上述最佳條件下進行3次平行驗證試驗，得到常溫植物基核桃酸奶感官評分實際值為（90.00±0.32）分，與理論值接近，具有一定的實際應(yīng)用價值。

2.3 常溫植物基核桃酸奶理化及微生物指標分析

由表9可知，常溫植物基核桃酸奶的蛋白質(zhì)含量為5.05 g/100 g，脂肪含量為3.00 g/100 g，酸度為52°T，酵母菌和霉菌為10 CFU/g，大腸桿菌和致病菌未檢出，相關(guān)理化及衛(wèi)生指標符合中國衛(wèi)生監(jiān)督協(xié)會發(fā)布團體標準T/WSJD 12—2020《植物蛋白飲料植物酸奶》標準。

表9 常溫植物基核桃酸奶的理化指標和微生物指標Table 9 Physicochemical and microbiological indexes of plant-based walnut yogurt at room temperature

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化常溫植物基核桃酸奶發(fā)酵工藝條件為混合發(fā)酵劑添加量0.6%，核桃漿料液比1∶3（kg∶L），穩(wěn)定劑HBT-A3168添加量6%，發(fā)酵時間7 h，發(fā)酵溫度42 ℃。此優(yōu)化條件下，其感官評分為（90±0.32）分，穩(wěn)定性良好，蛋白質(zhì)含量（5.05 g/100 g）較高，相關(guān)理化及衛(wèi)生指標符合相關(guān)標準要求，是一款健康、方便、新穎的酸奶，符合當下的消費趨勢，具有較好的市場前景。