路暢,郭玉龍,郭艷博,劉婷,高鵬飛,李步高,郭曉紅
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,山西 晉中 030801)
哺乳動(dòng)物胃腸道是一個(gè)多功能器官,擁有復(fù)雜的動(dòng)態(tài)微生物群落,是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和代謝的主要場(chǎng)所,同時(shí)在生理、免疫等方面發(fā)揮重要作用[1-2]。腸道微生物的早期定殖是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育及后期生產(chǎn)性能充分發(fā)揮保障的基礎(chǔ)[3]。豬腸道菌群定殖過(guò)程受諸多因素影響,斷奶、飼料更換以及環(huán)境的改變均會(huì)導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,很容易影響腸道發(fā)育及黏膜免疫系統(tǒng)的形成[4-6]。預(yù)先了解仔豬腸道群落形成特點(diǎn),分析影響腸道健康發(fā)育的菌群,有助于制定促進(jìn)早期腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)展的策略,及時(shí)對(duì)仔豬腸道菌群進(jìn)行有效干預(yù),改善仔豬腸道健康,提高生長(zhǎng)速度和后期生產(chǎn)性能。
動(dòng)物在出生前腸道屬于無(wú)菌狀態(tài),出生后受到母體及周?chē)h(huán)境影響,各種微生物快速在腸道定殖[7]。仔豬階段是腸道微生物早期定殖的關(guān)鍵時(shí)期,由于仔豬各腸段功能不同,微生物菌群結(jié)構(gòu)具有顯著差異,小腸和大腸之間以及管腔和粘膜之間微生物分布都不相同,而且糞便與腸道菌群組成也存在差異[8-10]。研究發(fā)現(xiàn),梭菌屬、乳酸菌、幽門(mén)螺桿菌等作為厚壁菌門(mén)的主要成員在回腸中大量富集,擬桿菌在盲腸及結(jié)腸的腔內(nèi)和黏膜中豐度顯著增加,在不同發(fā)育階段菌群豐度及多樣性隨年齡增長(zhǎng)而增加[11-14]。此外,腸道微生物能夠通過(guò)其代謝產(chǎn)物促進(jìn)腸干細(xì)胞增殖,如乳酸菌可促進(jìn)仔豬早期腸黏膜結(jié)構(gòu)發(fā)育,同時(shí)能使Wnt/βcatenin 通路活化導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞再生,最終維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[15-16]。
目前雖然圍繞腸道菌群對(duì)宿主的影響開(kāi)展了許多研究,但仔豬階段微生物對(duì)腸道結(jié)構(gòu)發(fā)育的作用還未明確。馬身豬作為山西地方豬種,具有產(chǎn)仔多、肉品質(zhì)好、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但其生長(zhǎng)速度較慢,脂肪沉積嚴(yán)重且瘦肉率低;晉汾白豬是以馬身豬、二花臉豬、長(zhǎng)白豬和大白豬為親本選育而成的新品種,具有生長(zhǎng)發(fā)育速度快、肉質(zhì)好等特點(diǎn)[17]。本研究將馬身豬(地方品種)和晉汾白豬(培育品種)仔豬作為研究對(duì)象,對(duì)初生(1 日齡)、哺育末期(28 日齡)、保育末期(70 日齡)3 個(gè)關(guān)鍵時(shí)期空腸和回腸微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,探究不同豬種腸道微生物特點(diǎn)及小腸結(jié)構(gòu)發(fā)育與微生物多樣性的關(guān)系,以期發(fā)現(xiàn)仔豬腸道發(fā)育過(guò)程中重要的微生物,旨在為后期仔豬健康飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。
本研究于2018 年8-11 月在山西省大同市種豬場(chǎng)進(jìn)行,每個(gè)品種各選擇3 頭健康母豬,圍產(chǎn)期飼料中不添加抗生素或其它藥物以及益生菌等影響腸道微生物結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。選擇第4 胎次的仔豬,在喂養(yǎng)28 d 斷奶后單窩喂養(yǎng)。在出生第1 天、28 天(哺育結(jié)束)和70 天(保育結(jié)束)時(shí),分別在各窩隨機(jī)選擇3 頭公豬進(jìn)行屠宰,取空腸、回腸內(nèi)容物收集于1.5 mL 凍存管中,液氮保存。每頭豬分別采集1 cm 的空腸與回腸組織,去除內(nèi)容物并放入多聚甲醛固定液保存?zhèn)溆谩?/p>
按常規(guī)步驟將取樣組織制作成石蠟塊,在室溫下切出厚度為7 μm 的空腸、回腸組織石蠟切片(每頭豬各做2 張),并用伊紅-蘇木精(HE)試劑染色。后對(duì)切片中方向相同的5 根絨毛測(cè)量其絨毛長(zhǎng)度(Vlength)和隱窩深度(Cdepth),并計(jì)算絨隱比(V/C)[17]。
按照天根試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法與步驟,分別對(duì)200 mg 空腸與回腸內(nèi)容物提取DNA。利用引物 對(duì) 微 生 物 的V3-V4 區(qū) 進(jìn) 行 擴(kuò) 增(341F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和 806R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。具體步驟同郭曉紅等已發(fā)表論文方法與材料部分[17]?;厥赵噭┖袑?duì)微生物PCR 產(chǎn)物切膠回收,并用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)仔豬腸道微生物DNA 檢測(cè)。隨后將微生物樣品在Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行建庫(kù)并測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)得到Clean Data 使用FLASH 軟件組裝讀段(reads)。
使用UPARSE 軟件將高質(zhì)量的reads 從頭拼接并富集成OTU(operational taxonomic units)代表序列。將優(yōu)化序列與OTU 代表序列比對(duì),進(jìn)行序列分類(lèi),以相似度97%作為分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。
利用Mothur 軟件(v.1.34.0)計(jì)算α 多樣性指數(shù)[18],分析仔豬腸道菌群多樣性,并繪制OUT 稀疏曲線和Rank 豐度曲線。利用R(v.3.0.2)基于加權(quán)的UniFrac 距離進(jìn)行主成分分析(posterior cerebral artery,PCA)。
將步驟1.5 中得到的OTU 序列進(jìn)行分類(lèi)(比對(duì)SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)),分別在門(mén)(Phylum)和屬(Genus)水平統(tǒng)計(jì)馬身豬和晉汾白豬仔豬空腸與回腸微生物構(gòu)成,并繪制Venn 圖。
使用R 軟件中vegan 包對(duì)環(huán)境因子(包括腸道絨毛結(jié)構(gòu)和血清免疫指標(biāo))與腸道微生物在門(mén)和屬的相關(guān)性分析。計(jì)算菌群微生物與腸道絨毛結(jié)構(gòu)和血清免疫指標(biāo)的Spearman 相關(guān)性系數(shù),選擇前15 個(gè)相關(guān)性最高的微生物繪制相關(guān)性熱圖。
2.1.1 腸道組織切片結(jié)果分析
由圖1 組織切片可見(jiàn),隨著日齡增加,2 品種仔豬空腸與回腸絨毛長(zhǎng)度逐漸變短,但橫切面呈現(xiàn)逐漸變寬的趨勢(shì)。晉汾白豬仔豬初生(1 d)時(shí)小腸已經(jīng)出現(xiàn)腸道褶皺,而在馬身豬仔豬腸道中未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象;此外,馬身豬仔豬初生(1 d)時(shí)空腸與回腸絨毛較長(zhǎng),而在哺育與保育末期(28 d 和70 d)晉汾白豬的腸絨毛長(zhǎng)度大于馬身豬(圖1)。
圖1 馬身豬和晉汾白豬空腸與回腸組織切片(200×)Fig.1 Jejunum and ileum biopsy of Mashen and Jinfen White piglets(200×)
2.1.2 仔豬腸絨毛高度和隱窩深度比較
從初生到70 日齡,2 品種豬(除馬身豬回腸)空腸和回腸絨毛呈逐漸降低趨勢(shì),且初生時(shí)的回腸絨毛高度極顯著高于28 日齡和70 日齡(圖2A、圖2D,P<0.01)。此外,2 品種豬空腸隱窩深度隨仔豬生長(zhǎng)發(fā)育也不斷加深,70 日齡的小腸隱窩深度最高(圖2B、圖2E)??漳c和回腸的絨隱比(Villus/Crypt)隨日齡增加呈極顯著遞減趨勢(shì)(圖2C、圖2F)。
通過(guò)品種間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),馬身豬仔豬空腸絨毛長(zhǎng)度在1 日齡和28 日齡時(shí)極顯著高于晉汾白豬(圖2A,P<0.01)。2 品種仔豬回腸絨毛長(zhǎng)度在初生時(shí)沒(méi)有差異,但在28 日齡時(shí)馬身豬回腸絨毛高度極顯著高于晉汾白豬(P<0.01),在70 日齡時(shí)卻顯著低于晉汾白豬(圖2D,P<0.05)。比較隱窩深度發(fā)現(xiàn),馬身豬仔豬空腸隱窩深度極顯著高于晉汾白豬(除28 日齡回腸),但在保育末期(70 日齡)卻顯著低于晉汾白豬(圖2B,P<0.05)。與空腸不同,1 日齡和70 日齡馬身豬仔豬回腸隱窩深度顯著高于晉汾白豬(P<0.05),28 日齡卻無(wú)顯著差異(圖2E)。馬身豬在哺育末期空腸與回腸組織的絨隱比顯著高于晉汾白豬(圖2C、圖2F,P<0.05)。
圖2 馬身豬和晉汾白豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)Fig.2 The intestinal morphology of Mashen and Jinfen White piglets
對(duì)馬身豬和晉汾白豬仔豬腸道內(nèi)容物樣品進(jìn)行測(cè)序,共檢測(cè)到1 872 432 個(gè)高質(zhì)量序列,得到2032 個(gè)OUTs,其中2 個(gè)品種共有核心OTU 840個(gè),940 個(gè)為晉汾白豬所特有,252 個(gè)為馬身豬特有,核心OTUs 占晉汾白豬(馬身豬)總OTUs 的47.19%(76.92%)。將97%相似水平的OTU 代表序列匹配到已知細(xì)菌的序列,在晉汾白豬中檢測(cè) 到28 個(gè) 門(mén),55 個(gè) 綱,106 個(gè)目,205 個(gè) 科 和518 個(gè)屬,在馬身豬中檢測(cè)到19 個(gè)門(mén),35 個(gè)綱,66 個(gè)目,124 個(gè) 科 和325 個(gè) 屬。
對(duì)腸道微生物主成分分析,發(fā)現(xiàn)2 品種仔豬腸道整體菌群相似且區(qū)分不明顯(圖3A),與之前結(jié)腸中的研究結(jié)果一致[17]。馬身豬空腸、回腸3 個(gè)發(fā)育時(shí)期菌群結(jié)構(gòu)差異明顯能夠完全區(qū)分,而空腸與回腸菌群結(jié)構(gòu)相似不能完全區(qū)分,說(shuō)明晉汾白豬腸道菌群與馬身豬相似(圖3B)。通過(guò)對(duì)腸道微生 物α 多 樣 性分 析 發(fā) 現(xiàn),除Simpson 以 外,ACE、Chao、Shannon 變化趨勢(shì)較相似(圖3C)。晉汾白豬28 日齡時(shí)空腸菌群多樣性顯著減少,70 日齡時(shí)顯著增加,馬身豬仔豬3 個(gè)發(fā)育階段腸道菌群變化穩(wěn)定,無(wú)顯著差異。此外,晉汾白豬仔豬回腸菌群多樣性隨日齡逐漸增加,而馬身豬回腸菌群多樣性在70 日齡時(shí)顯著減少(P<0.05),并在保育結(jié)束(70 日齡)時(shí)微生物多樣性極顯著低于晉汾白豬(圖3C,P<0.01)。
圖3 馬身豬和晉汾白豬空腸、回腸微生物多樣性分析Fig.3 Microbial diversity in jejunum and ileum of Mashen and Jinfen White piglets
通過(guò)微生物組成分析,發(fā)現(xiàn)晉汾白豬和馬身豬仔豬腸道微生物主要包括厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)。其中,厚壁菌門(mén)隨仔豬發(fā)育豐度逐漸增加,保育結(jié)束(70 日齡)所占比例最大。2 品種仔豬回腸厚壁菌門(mén)豐度均高于空腸,而且晉汾白豬腸道該菌比例(32.29%~54.92%)顯著低于馬身豬(61.34%~87.67%)。變形菌門(mén)在哺育結(jié)束(28 日齡)時(shí)豐度達(dá)到最高,在70 日齡時(shí)急劇減少,初生時(shí)晉汾白豬該菌豐度(72.29%)顯著高于馬身豬(15.60%)。兩品種仔豬腸道中擬桿菌門(mén)豐度變化與厚壁菌門(mén)相反,空腸中擬桿菌門(mén)所占比例均高于回腸,晉汾白豬腸道中所占比例(0.70%~3.89%)高于馬身豬(0.11%~1.9%)(圖4A)。
晉汾白豬和馬身豬仔豬腸道微生物群中共鑒定出518 和325 個(gè)屬,晉汾白豬腸道菌屬多樣性顯著高于馬身豬(圖4B)。乳酸桿菌(Lactobacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)在2 品種仔豬腸道中所占比例較高。馬身豬仔豬腸道中的乳酸菌在初生和保育結(jié)束時(shí)豐度比較高,該菌在空腸這2 階段豐度平均占比分別為46.76%、95.25%,回腸中分別占37.37%、86.75%,且晉汾白豬乳酸桿菌含量均顯著低于馬身豬。假單胞菌作為變形菌門(mén)中的主要菌屬,晉汾白豬仔豬腸道中其豐度占比是馬身豬仔豬的2 倍,哺育結(jié)束時(shí)該菌含量顯著增加。分析發(fā)現(xiàn),狹義梭菌屬在馬身豬仔豬初生時(shí)豐度較高,隨后很快消失,1 日齡馬身豬仔豬該菌豐度是晉汾白豬的1.7 倍;晉汾白豬腸道中該菌在各個(gè)時(shí)期均存在且豐度較高。2 個(gè)品種保育結(jié)束(70 日齡)時(shí)鏈球菌屬(Streptococcus)出現(xiàn)較高豐度,在晉汾白豬中的含量是馬身豬的3~4 倍(圖4B)。
圖4 馬身豬和晉汾白豬小腸微生物組成Fig.4 The composition of intestinal microbes between Mashen and Jinfen White piglet
對(duì)2 個(gè)品種仔豬空腸和回腸特異菌屬進(jìn)行分析,在晉汾白豬空腸和回腸中分別檢測(cè)到453 種和373 種菌屬,而在馬身豬空腸和回腸中僅發(fā)現(xiàn)307種和183 種菌屬。其中,晉汾白豬特有菌屬221種,馬身豬特有菌屬僅25 種,說(shuō)明晉汾白豬腸道微生物多樣性顯著高于馬身豬(圖5)。
圖5 馬身豬和晉汾白豬仔豬空腸與回腸微生物數(shù)量(屬水平)Fig.5 The number of microbiota in the jejunum and ileum of two breeds at genus level
通過(guò)對(duì)小腸特有菌群分析,發(fā)現(xiàn)空腸與回腸特有菌屬所屬門(mén)類(lèi)差異較大。在門(mén)水平,晉汾白豬腸道特異菌群主要集中在放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、Parcubacteria、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)等8 個(gè)菌門(mén);而馬身豬腸道特有菌群主要分布于變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、綠菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)等9 個(gè)菌門(mén)(圖6)。在屬水平,Quinella、游動(dòng)放線菌(Actinoplanes)、氣微菌屬(Aeromicrobium)、動(dòng)膠菌屬(Zoogloea)等菌屬特異性富集于在晉汾白豬仔豬回腸與空腸中(圖6A);馬身豬仔豬空腸和回腸特有菌屬主要包括粘螺旋藻(Mucispirillum)、Thiopseudomonas、Sinibacillus、索 氏菌屬(Thauera)、氣斯氏菌屬(Aerisardovi)、Anaerofilum等(圖6B)。
圖6 晉汾白豬和馬身豬空腸、回腸特有微生物組成Fig.6 The component of peculiar microorganisms in jejunum and ileum of Jinfen White and Mashen piglets
通過(guò)對(duì)腸道微生物菌群與腸絨毛結(jié)構(gòu)和血清生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(圖7),發(fā)現(xiàn)馬身豬仔豬血清中脂多糖(LPS)、二胺氧化酶(DAO)、絨毛長(zhǎng)度(Vlength)關(guān)聯(lián)的菌群與D 乳酸(D-LA)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、隱窩深度(Cdepth)關(guān)聯(lián)的菌群相關(guān)性結(jié)果相反,但在晉汾白豬仔豬中區(qū)分度不明顯。其中,馬身豬仔豬的腸道絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度與15 個(gè)菌屬的相關(guān)性呈現(xiàn)相反的趨勢(shì),絨毛長(zhǎng)度與鏈球菌、unclassfied_o_Lactobacillales極顯著正相關(guān),但隱窩深度與二者極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)。D-LA 與4 種菌顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),但僅與乳酸桿菌顯著正相關(guān)(圖7A,P<0.01)。對(duì)于晉汾白豬而言,鏈球菌、北里孢菌(Kitasatospora)、羅氏菌(Rothia)、莫拉 氏 菌(Moraxella)和 魏 斯 氏 菌(Weissella)與TNF-α 和隱窩深度顯著正相關(guān),但與D-LA、IL-6以及LPS 顯著負(fù)相關(guān)(圖7B,P<0.05)。此外,鏈球菌在2 品種仔豬中均與DAO 和LPS 負(fù)相關(guān),與TNF-α 和Cdepth 顯著正相關(guān)(P<0.05)。乳酸桿菌與DAO 在馬身豬中極顯著正相關(guān)卻在晉汾白豬中極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001),但與LPS 在2 品種豬中顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。
圖7 馬身豬和晉汾白豬腸道微生物與指標(biāo)相關(guān)性分析(屬水平)Fig.7 Spearman correlation analysis between microbiota and environmental variables in two pig breeds at genus level
中國(guó)地方豬種在抵抗外界壓力和疾病的能力得到廣泛認(rèn)可[19-20],其中腸道微生態(tài)在維持健康和抵抗疾病方面發(fā)揮不容忽視的作用[21]。研究表明,仔豬腸道微生物多樣性會(huì)隨日齡增加發(fā)生顯著變化,此過(guò)程受飼料及遺傳等多種因素影響[6,22]。本研究發(fā)現(xiàn),晉汾白豬與馬身豬仔豬小腸微生物結(jié)構(gòu)相似,但3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道微生物多樣性差異顯著,說(shuō)明腸道微生物的形成受到飼料、環(huán)境等因素的影響較大。其中,日齡和飲食是引起菌群差異的重要驅(qū)動(dòng)因素,而馬身豬仔豬的腸道菌群分類(lèi)比晉汾白豬少,更穩(wěn)定,也可能是地方品種對(duì)環(huán)境改變有較強(qiáng)的適應(yīng)能力的原因。
有研究指出,豬腸道中有大量的厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)微生物,本研究結(jié)果與以上相符[23-24]。厚壁菌門(mén)具有獲取食物能量的潛力[25-26],馬身豬仔豬腸道厚壁菌門(mén)豐度顯著高于晉汾白豬,高豐度的厚壁菌門(mén)可能促進(jìn)了馬身豬脂肪積累。此外,乳酸桿菌是哺乳動(dòng)物腸道中的主要菌屬,在母乳及植物性食物的代謝中發(fā)揮著重要的作用[27]。在本研究中馬身豬仔豬腸道中的乳酸桿菌豐度較高,這對(duì)于維護(hù)腸道健康及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有重要作用。Romboutsia能夠降低血漿中促炎細(xì)胞因子水平,而假單胞菌屬、狹義梭菌屬等是腸道潛在致病菌[28]。本研究中這些菌屬在2品種仔豬各時(shí)期均有較高豐度,提示仔豬階段要注意環(huán)境和飼料等外界因素的影響,應(yīng)加強(qiáng)仔豬護(hù)理防止腸道疾病的發(fā)生。從整體來(lái)看,馬身豬有益菌群豐度占比高于晉汾白豬,說(shuō)明馬身豬腸道微生物在其抗逆性方面發(fā)揮重要作用。
本研究分析表明,腸道菌群與腸道發(fā)育以及機(jī)體免疫之間存在相關(guān)性,其中血清DAO、D-LA和LPS 含量可以改變腸道通透性腸黏膜功能[29-30]。乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物具有抑菌、屏障保護(hù)作用,可以競(jìng)爭(zhēng)致病菌的黏附位置并減少致病菌的黏附侵害,減少致病菌LPS 的產(chǎn)生[31-32]。此外,魏斯氏菌對(duì)腸黏膜具有抗炎和保護(hù)作用,在小鼠中可抑制脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO 和IL-6,而在人中主要抑制上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8[33]。本研究通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)狹義梭菌屬、假單胞菌屬等微生物與這些指標(biāo)顯著正相關(guān),而乳酸桿菌、魏斯氏菌等有益菌是負(fù)相關(guān),所以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)注意對(duì)仔豬腸道微生物調(diào)控,促進(jìn)有益菌大量富集,維護(hù)腸道健康。
本研究通過(guò)比較馬身豬和晉汾白豬仔階段小腸微生物多樣性,分析了仔豬關(guān)鍵生長(zhǎng)階段的菌屬變化情況,與晉汾白豬相比,馬身豬仔豬腸道菌群組成更加保守,微生物多樣性顯著小于晉汾白豬。乳酸桿菌、Ferruginibacter、Thiopseudomonas、索氏菌屬、粘螺旋藻等是馬身豬的特異菌群,可能對(duì)馬身豬抗逆性能具有影響。Quinella、Haliangium、動(dòng)膠菌屬、Anoxybacillus、毛螺菌科等為晉汾白豬特異菌屬,對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收代謝具有重要作用。微生物對(duì)仔豬健康及后期生產(chǎn)性能的發(fā)揮具有重要作用,本研究結(jié)果可為不同品種仔豬腸道微生態(tài)的調(diào)控研究及仔豬健康飼養(yǎng)提供參考。