張文雙，孟宇飛，胡申才

（武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430023）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是由黃曲霉、寄生曲霉等某些霉菌菌株在特定條件下產(chǎn)生的一類有毒性代謝產(chǎn)物[1]，常見于玉米、花生、大米和小麥等谷物及其副產(chǎn)品中。黃曲霉素包括黃曲霉毒素B1（AFB1）、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2等二十余種結(jié)構(gòu)類似物，其中AFB1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)最穩(wěn)定、毒性最強(qiáng)的真菌毒素，世界衛(wèi)生組織把其定為IA類致癌物質(zhì)[2-3]。黃曲霉毒素嚴(yán)重危害人體和動(dòng)物的健康安全，進(jìn)入人體后會(huì)被細(xì)胞色素P450酶代謝形成活性中間體，與肝細(xì)胞相互作用引起肝癌[4]，對(duì)免疫力也會(huì)產(chǎn)生不良影響[5]。奶牛攝入黃曲霉素會(huì)導(dǎo)致其采食量下降，免疫力降低，內(nèi)臟器官受損甚至癌變，產(chǎn)奶量減少；且飼喂黃曲霉毒素時(shí)間越長，危害越大[6]。同樣，黃曲霉毒素也嚴(yán)重影響雞鴨等禽類的健康和生產(chǎn)性能[7]。因此，探尋有效的方法來消除食品及飼料中黃曲霉毒素污染，降低黃曲霉毒素對(duì)畜禽和人類的威脅是個(gè)亟待解決的問題。

作為黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)、危害最大的一種毒素，AFB1的脫除方法主要包括物理、化學(xué)和生物脫除等三種方式。其中物理脫除法主要是通過高溫加熱和紫外照射等方式破壞AFB1的結(jié)構(gòu)，或通過吸附劑將AFB1吸附從而達(dá)到去除的效果[8-10]?；瘜W(xué)脫除法主要是通過強(qiáng)氧化劑或堿處理法來破壞某些化學(xué)鍵從而達(dá)到脫毒目的[11-12]。AFB1耐溫性強(qiáng)，在268 ℃以上高溫條件下才能被大量熱解[13]；且其在pH值中性條件下穩(wěn)定，在pH 1.0～3.0的強(qiáng)酸性溶液中也只有極少量分解，但在pH 9.0～10.0的強(qiáng)堿溶液中能夠快速分解并生成沒有毒性的鹽。但是，這個(gè)反應(yīng)是可逆的，一旦遇到酸性條件，其毒性便會(huì)恢復(fù)[14]。因此普通的物理和化學(xué)方法難以將其徹底脫除，而且反應(yīng)條件嚴(yán)格、成本高，同時(shí)會(huì)破壞飼料的風(fēng)味和營養(yǎng)成分，造成適口性的降低，也可能引入其他有毒物質(zhì)而危害畜禽的健康[15]。生物脫除法則是利用微生物或其產(chǎn)生的酶類來解毒，其反應(yīng)條件溫和，降解效率高，不會(huì)產(chǎn)生對(duì)人和動(dòng)物有害的物質(zhì)，甚至有的益生菌還能對(duì)飼料的營養(yǎng)價(jià)值有一定的提升，因此已成為當(dāng)前最有前景及最具應(yīng)用價(jià)值的黃曲霉毒素脫毒方法之一[16-17]。

盡管黃曲霉毒素種類繁多，但是它們均是二氫呋喃香豆素的衍生物，該類分子主要是由雙呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀┙M成，兩者是其基本毒性結(jié)構(gòu)[18-19]。就AFB1高效降解菌的分離而言，針對(duì)黃曲霉素分子中所含有的香豆素結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)出的香豆素篩選模型成本低廉，安全無毒，已得到較廣泛應(yīng)用，如孫糧等[20]利用香豆素為唯一碳源從奶牛糞便中篩選到了1株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），對(duì)質(zhì)量濃度為100 μg/L的AFB1的降解率達(dá)到91.86%；王威等[21]利用此方法從腐爛朽木中篩選到1株克雷伯氏菌（Klebsiellasp.），對(duì)質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的AFB1降解率為71.91%；王明清等[22]也以香豆素為唯一碳源從土壤中篩選到了1株能降解AFB1的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），對(duì)質(zhì)量濃度為100 μg/L的AFB1降解率為90.6%。

傳統(tǒng)釀造食品主要由多種微生物共酵而來，傳統(tǒng)發(fā)酵工藝歷經(jīng)了長久的生產(chǎn)實(shí)踐檢驗(yàn)，食品發(fā)酵過程中微生物交替繁衍，蘊(yùn)含著種類繁多、代謝類型多樣的微生物，它們也是公認(rèn)安全（general recognized as safe，GRAS）成分。本研究擬采用香豆素富集培養(yǎng)法從酒醅、大曲、榨菜、酸豆角等樣品中分離篩選可利用香豆素菌株；采用高效液相色譜（high performance liquid chroma-tography，HPLC）法復(fù)篩高效降解AFB1的優(yōu)良菌株，并采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化其發(fā)酵條件，以期應(yīng)用到食品或飼料工業(yè)中去降低黃曲霉素危害，減少經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

大曲樣品1份、不同發(fā)酵天數(shù)的酒醅樣品12份：黃鶴樓酒廠；大曲樣品1份：湖北襄陽石花酒廠；榨菜樣品、酸豆角樣品各1份：武漢市東西湖區(qū)常青花園菜市場(chǎng)；共計(jì)16份樣品。

1.1.2 化學(xué)試劑

香豆素（分析純）：上海山浦化工有限公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%）：以色列Fermentek公司；甲醇（色譜純）、二氯甲烷（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；菌體裂解液：寶生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

初篩液體培養(yǎng)基：KH2PO40.25g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，KNO30.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.005 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.003 g/L，pH 7.0，蒸餾水1 000 mL[23]。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，每100 mL培養(yǎng)基中加入經(jīng)細(xì)菌過濾器濾過的質(zhì)量濃度為100 mg/mL的香豆素液1 mL，在培養(yǎng)基中終質(zhì)量濃度為1 g/L[18]。

初篩固體培養(yǎng)基：初篩液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉18g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 8.5 g/L，KH2PO41 g/L，葡萄糖1 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[18]。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-3008SH-II生化培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；ZQLY300F振蕩培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-IBM超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣有限公司；5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；T-GRADIENT聚合酶聯(lián)式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；GBoXHR-E-M凝膠成像系統(tǒng)：英國Syngene公司；Agilent 1260 Ⅱ高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 AFB1降解菌的篩選

（1）初篩

取10 g樣品，將其加入至100 mL無菌水中，振蕩搖勻，吸取樣品稀釋液按10%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，得到微生物富集液。取微生物富集液以10%接種量轉(zhuǎn)接至以香豆素為唯一碳源的初篩液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，再以10%接種量轉(zhuǎn)接至新的初篩液體培養(yǎng)基中，共轉(zhuǎn)接3次，待培養(yǎng)基變渾濁，涂布在香豆素固體篩選培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)菌生長情況，選取生長良好的單菌株，連續(xù)3次劃線于初篩培養(yǎng)基上，純化后保存初篩菌株。

（2）復(fù)篩

將純化的篩選菌株單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，從中取975 μL菌液加入10 mL細(xì)菌培養(yǎng)瓶，再加入100 μg/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液25 μL，發(fā)酵液中AFB1終質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL，混勻，37 ℃、200 r/min避光孵育72 h，離心取上清液用二氯甲烷進(jìn)行等體積萃取2次，將萃取液置于氮吹儀中吹干，加入1 mL甲醇，超聲處理，復(fù)溶后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至色譜瓶中，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫瑱z測(cè)AFB1含量，計(jì)算降解率，復(fù)篩高效AFB1降解菌。

1.3.2 AFB1的檢測(cè)

采用HPLC法檢測(cè)AFB1含量，色譜條件為：C18色譜柱（4.6 mm×15 cm×5 μm），進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相為甲醇∶水=6∶4（V/V），等度洗脫，流速0.7 mL/min，檢測(cè)波長365 nm[13]。

AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確移取100 μg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加色譜級(jí)甲醇將其稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL、2.0 μg/mL、2.5 μg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC進(jìn)樣，將峰面積（y）作為縱坐標(biāo)，AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=105.38x-4.899 8，相關(guān)系數(shù)為R2=0.997 7，根據(jù)此回歸方程計(jì)算樣品中AFB1含量，并計(jì)算AFB1降解率，其計(jì)算公式如下：

1.3.3 篩選菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察

將AFB1降解率最高的菌株在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌落及細(xì)胞觀察。觀察菌落顏色及單菌落形態(tài)；并挑取少量菌作革蘭氏染色和芽孢染色，顯微觀察細(xì)胞和芽孢形態(tài)及染色結(jié)果。

（2）分子生物學(xué)鑒定

采用菌體裂解液裂解菌體，釋放其基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACGGCTACC TTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增16S rDNA基因。PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）：菌株DNA模板5 μL，上下游引物27 F與1492R各2 μL，TaqDNA聚合酶25 μL，雙蒸水（ddH2O）16 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物上樣于0.8%瓊脂糖凝膠，120 V電泳30 min后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)基因擴(kuò)增結(jié)果。將陽性PCR反應(yīng)液送至上海生工生物有限公司測(cè)序。

測(cè)序后的16S rDNA基因序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源搜索比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株對(duì)AFB1脫毒方式的探究

取2份振蕩培養(yǎng)至12 h的等體積菌株發(fā)酵菌液，培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min。一份經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min進(jìn)行滅活處理后，于4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清，收集菌體。將菌體復(fù)溶于同體積的發(fā)酵培養(yǎng)基中；另一份不做任何處理。二者分別裝于3個(gè)培養(yǎng)瓶中，設(shè)3重復(fù)，加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液使AFB1終質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL。以不加菌液但AFB1終濃度相同的發(fā)酵液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。在37 ℃、200 r/min條件下避光培養(yǎng)72 h，按照1.3.1的方法萃取上清液中AFB1進(jìn)行HPLC分析。

1.3.5 菌株降解AFB1發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

篩選菌株活化后挑一環(huán)菌于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h，得到種子液，將種子液按5%接種量接種至AFB1質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)基初始pH為6.5，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h。在此基礎(chǔ)上固定搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，分別考察接種量（4%、5%、6%、7%、8%）、培養(yǎng)基初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、培養(yǎng)溫度（25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃）、培養(yǎng)時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）、AFB1質(zhì)量濃度（2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL）對(duì)篩選菌株降解AFB1的影響。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)1.3.1中方法進(jìn)行萃取、氮吹、復(fù)溶、過濾等處理后，采用HPLC法檢測(cè)AFB1含量，另外取等量AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入等量無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中作為空白對(duì)照。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定AFB1質(zhì)量濃度為2.5μg/mL，初始pH值為7.2，選取培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）、接種量（C）為影響因素，以AFB1降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1降解菌株初篩

本研究利用香豆素篩選模型從酒醅、大曲、榨菜及酸豆角共16份樣品中共篩選到23株能夠以香豆素為唯一碳源生長的菌株，根據(jù)取樣天數(shù)及樣品類型分別編號(hào)為HB021～HB026、HB324～HB326、HB721～HB722、HBH2、SQ1～SQ8、SQ9～SQ12。其中黃鶴樓酒廠二茬酒醅發(fā)酵第0天6株，第3天3株，第7天2株，大曲中1株，石花酒廠大曲中11株。

2.2 AFB1降解菌株復(fù)篩

經(jīng)香豆素富集培養(yǎng)法初篩得到的23株菌，通過AFB1降解試驗(yàn)復(fù)篩，結(jié)果見圖1。由圖1可知，這23株菌都具有降解AFB1的能力，其中湖北武漢黃鶴樓酒廠酒醅中分離到的菌株HB022降解能力最強(qiáng)，AFB1降解率達(dá)到86.22%，同樣分離自黃鶴樓酒醅中的菌株HB721 AFB1降解能力次之，AFB1降解率為77.70%，此外分離自湖北襄陽石花酒廠大曲的菌株SQ9 AFB1降解率也較高，達(dá)到77.27%。結(jié)合菌株對(duì)AFB1的降解穩(wěn)定性情況，本研究選擇AFB1降解率最高的菌株HB022作進(jìn)一步研究。

圖1 AFB1降解菌株的復(fù)篩結(jié)果Fig. 1 Secondary screening results of AFB1 degrading strains

2.3 菌株HB022的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

由圖2a可知，菌株HB022在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落為白色、邊緣不整齊、表面粗糙皺褶，中心有輕微隆起；由圖2b可知，顯微鏡下細(xì)胞為桿狀，革蘭氏染色呈紫色；由圖2c可知，具有芽孢，呈橢圓形。綜上，菌株HB022是革蘭氏陽性芽孢桿菌。

圖2 菌株HB022的菌落（a）、細(xì)胞（b）及芽孢（c）形態(tài)Fig. 2 Colony (a),cell (b) and spore (c) morphology of strain HB022

2.3.2 分子生物鑒定

測(cè)序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，下載與菌株HB022同源性較高的菌株序列，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株HB022與地衣芽孢桿菌TS08和KW55P屬于同一分支，結(jié)合菌株HB022的形態(tài)學(xué)特征，最終鑒定菌株HB022為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株HB022的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain HB022 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 菌株HB022對(duì)AFB1脫毒方式的探究

迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)AFB1的脫毒作用主要分為菌體細(xì)胞壁吸附和菌株代謝分解轉(zhuǎn)化這2種方式[24]。某些芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、鐮刀菌（Fusariumsp.）等對(duì)AFB1也有一定的吸附作用[25]，但大多數(shù)微生物對(duì)AFB1的吸附是非特異性的，且有可逆性，不能從根本上去除毒性[26]。為了探究菌株HB022對(duì)AFB1的脫毒機(jī)理，將菌株HB022培養(yǎng)至24h的菌液采用滅菌處理后，其AFB1降解率僅有26.48%，而未經(jīng)滅菌處理的菌液的AFB1降解率則達(dá)到78.93%，這充分說明菌株HB022對(duì)AFB1的去除主要是通過生物降解作用而非菌體吸附作用來完成的。

2.5 菌株HB022降解AFB1發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.5.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌株HB022對(duì)AFB1的降解率在持續(xù)增長，其降解率在0～24 h提升較為緩慢，在發(fā)酵時(shí)間24～48 h，降解率隨之提升迅速，在48 h后又趨于緩慢，分析可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、有毒代謝產(chǎn)物的積累及pH的變化導(dǎo)致菌株HB022的生長和降解酶的活性受到影響。在72 h時(shí)，AFB1降解率達(dá)到84.61%，發(fā)酵時(shí)間＞72之后，AFB1降解率趨于平穩(wěn)，因此，最適培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on AFB1 degradation by strain HB022

2.5.2 接種量對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響

由圖5可知，菌株HB022在接種量為4%～5%時(shí)，AFB1降解率呈上升趨勢(shì)并在5%接種量時(shí)達(dá)到最大，為82.38%。當(dāng)接種量繼續(xù)升高，AFB1的降解率則呈下降趨勢(shì)，接種量太大，在發(fā)酵初期加速了營養(yǎng)物質(zhì)和溶氧的消耗，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，便不足以提供菌株發(fā)酵的營養(yǎng)需求，從而導(dǎo)致接種量為8%時(shí)的AFB1降解率只有76.04%。因此，最適接種量為5%。

圖5 接種量對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響Fig. 5 Effect of inoculum on AFB1 degradation by strain HB022

2.5.3 發(fā)酵溫度對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響

由圖6可知，發(fā)酵溫度在28～34 ℃時(shí)菌株HB022對(duì)AFB1的降解率較低，降解率在55%～70%之間，而在37 ℃時(shí)降解率達(dá)到最高，為85.24%，說明其最適發(fā)酵溫度為37 ℃。隨著發(fā)酵溫度升高達(dá)到40 ℃，其AFB1降解率則又下降到只有51.7%。分析其原因可能是發(fā)酵溫度已超過其菌體最適生長溫度或降解酶催化最適溫度，從而影響了菌體的增殖或AFB1降解酶的酶活。因此，最適發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響Fig. 6 Effect of fermentation temperature on AFB1 degradation by strain HB022

2.5.4 初始pH值對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響

AFB1在初始pH 9.0～10.0的強(qiáng)堿溶液中自身能夠快速分解且反應(yīng)可逆，另外參考相關(guān)文獻(xiàn)的研究方法，對(duì)pH值的研究只進(jìn)行到pH 8.5[14]。由圖7可知，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在5.0～6.5之間時(shí)對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響較小，降解率均在70%～75%之間，但當(dāng)pH值＞6.5之后，隨著pH的升高降解率也隨之升高，并在pH為8.5時(shí)，降解率達(dá)到90.28%。綜合考慮到AFB1在高于pH 9.0條件下堿性越強(qiáng)自身分解越大[27]，以及地衣芽孢桿菌菌體適宜生長pH值，避免pH過高對(duì)降解酶的活性造成影響[28-29]，因此，最適初始pH值為7.2。

圖7 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響Fig. 7 Effect of medium initial pH on AFB1 degradation by strain HB022

2.5.5 AFB1質(zhì)量濃度對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響

為了探究菌株HB022對(duì)高濃度AFB1的降解能力，在2.5 μg/mL的基礎(chǔ)上提升培養(yǎng)基中AFB1的質(zhì)量濃度后進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見圖8。由圖8可知，當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL時(shí)，AFB1降解率最高，達(dá)到83.46%，在質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，AFB1降解率為75.30%，但整體波動(dòng)不大，說明菌株HB022對(duì)于高濃度的黃曲霉毒素也具有良好的降解能力，說明其對(duì)黃曲霉毒素污染較為嚴(yán)重的飼料原料的脫毒中具有很大的應(yīng)用潛力。因此，最適AFB1質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL。

圖8 不同質(zhì)量濃度AFB1對(duì)菌株HB022降解AFB1的影響Fig. 8 Effect of different AFB1 concentration on AFB1 degradation by strain HB022

2.6 菌株HB022降解AFB1發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.2，選取發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、接種量（C）為影響因素，以質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的AFB1降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

續(xù)表

由表2可知，3個(gè)因素對(duì)菌株AFB1降解率的影響能力排序?yàn)锳＞B＞C，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量。正交試驗(yàn)最優(yōu)發(fā)酵條件組合為A2B2C2，即發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h，接種量5%。在此條件下進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，AFB1降解率平均值為91.13%。

3 結(jié)論

本研究利用香豆素篩選模型，從白酒大曲與酒醅，以及榨菜、酸豆角等不同傳統(tǒng)釀造食品中進(jìn)行了降解菌的初步篩選，獲得了23株生長良好的菌株。經(jīng)多輪復(fù)篩發(fā)現(xiàn)菌株HB022具高效降解AFB1的能力，降解率達(dá)86.22%。結(jié)合形態(tài)觀察與16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，鑒定菌株HB022為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)該菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.2情況下，菌株HB022降解AFB1的最優(yōu)發(fā)酵條件是發(fā)酵溫度37 ℃、接種量5%、發(fā)酵時(shí)間72 h。在此優(yōu)化條件下，菌株HB022對(duì)質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的AFB1降解率達(dá)到91.13%。綜合來看，該菌有著一定的應(yīng)用潛力，也為傳統(tǒng)釀造微生物應(yīng)用于食品、飼料或中藥材等生產(chǎn)領(lǐng)域的脫毒應(yīng)用提供了佐證，豐富了AFB1降解菌種資源庫。后續(xù)將繼續(xù)開展其作為益生菌劑改善花生粕等飼料原料品質(zhì)的相關(guān)研究。