黃 怡，張苗苗，鄧子文，董 蘊，扎西拉宗，郭 壯，王玉榮

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053）

醬豆又稱為豆豉，是一種傳統(tǒng)特色發(fā)酵調(diào)味品，其原料為黃豆或黑豆。醬豆不僅風(fēng)味獨特還含有較高的蛋白質(zhì)、纖維素、維生素等營養(yǎng)元素，且醬豆中的多種營養(yǎng)元素含量均高于大豆[1]。有研究指出，醬豆在預(yù)防癌癥、延緩衰老、幫助消化和增強免疫等方面具有一定的積極作用[2-4]。傳統(tǒng)發(fā)酵醬豆制作過程中的環(huán)境和工藝手法相對開放，致使其含有較為豐富且復(fù)雜的微生物菌群信息[5-6]。發(fā)酵過程中微生物在蛋白質(zhì)、淀粉及脂質(zhì)的水解代謝中起著重要作用，并影響產(chǎn)品的質(zhì)量和風(fēng)味。湯啟成等[7]研究發(fā)現(xiàn)，毛霉型豆豉與曲霉型豆豉生成的揮發(fā)性化合物不一樣。聶黔麗等[8]采用高通量測序技術(shù)分析遵義干豆豉，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌為其主要貢獻(xiàn)菌株，其次是乳酸菌，風(fēng)味成分中酸類含量占比最高。通過對甘肅隴南和慶陽兩地傳統(tǒng)細(xì)菌型豆豉微生物進(jìn)行研究，ZHANG W B等[9]研究發(fā)現(xiàn)，微生物在不同來源樣品中存在較大差異，地理因素可能影響豆豉樣本微生物組成及豐度。研究人員對不同地區(qū)豆豉開展了較為廣泛的研究，但對恩施利川豆豉研究較少。

利川市位于湖北西南端，與蜀渝相接，當(dāng)?shù)蒯u豆是以黃豆為原料，經(jīng)選料、浸泡、蒸煮、自然發(fā)酵后，密封于陶罐中發(fā)酵而成的，制作及食用較為普遍[10]。但目前其微生物組成及風(fēng)味特征尚不明晰。Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)有通量高、方便易操作、檢測結(jié)果準(zhǔn)確且成本低等特點[11-12]，在食品[13-15]及醫(yī)學(xué)[16]等方面應(yīng)用比較廣泛。電子鼻能夠檢測并分析樣品的整體揮發(fā)性成分，其特點是檢測的速度快、測定評估的范圍廣且響應(yīng)的時間短[17]。目前電子鼻在發(fā)酵食品[18]、中藥材及農(nóng)產(chǎn)品[19]和腸道疾病[20]等領(lǐng)域均有應(yīng)用。這些技術(shù)的應(yīng)用為本研究的開展提供了良好的支撐。

本研究采用MiSeq高通量測序技術(shù)對采集自湖北省恩施土家族苗族自治州利川市的自然發(fā)酵醬豆樣品的細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時采用電子鼻系統(tǒng)測定其揮發(fā)物質(zhì)的響應(yīng)差異，并分析醬豆樣品中細(xì)菌多樣性與其風(fēng)味品質(zhì)的相關(guān)性，以期為后續(xù)改良醬豆風(fēng)味以及篩選有益工藝生產(chǎn)優(yōu)良菌株提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

利川醬豆：采集自湖北省恩施土家族苗族自治州利川市，屬細(xì)菌型豆豉且均為自然發(fā)酵而成，每份樣品采取200g，共采取10 份醬豆樣品，分別編號為JD1～JD10。將采集后的樣品裝入無菌采樣管后置于采樣箱中快速運回實驗室，在-80 ℃冷凍保藏備用；DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；DNA聚合酶（5 U/μL）、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）Mix：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物338F/806R：天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；Axygen清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)吳江有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920機架式服務(wù)器：美國DELL公司；Vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；PEN3電子鼻（配置10個金屬氧化物半導(dǎo)體型化學(xué)傳感元件：W1W、W1C、W1S、W5S、W3C、W5S、W6S、W2W、W2S和W3S）：德國Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 宏基因組DNA提取

取利川醬豆樣品2.0 g，使用DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒對醬豆樣品的微生物總DNA進(jìn)行提取后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶是否符合試驗要求，并將提取的DNA樣品置于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR擴增及MiSeq高通量測序

對醬豆樣品的DNA提取并檢測后，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對DNA樣品進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)的PCR擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司用MiSeq高通量測序平臺進(jìn)行測序。擴增體系和擴增條件參照王玉榮等[21]的方法。

1.3.3 序列拼接質(zhì)控及基因功能預(yù)測

高質(zhì)量序列的獲得：對測序的序列進(jìn)行拼接并質(zhì)控，同時在拼接過程中剔除重疊區(qū)堿基數(shù)＜10 bp的序列、最大錯配比率＞0.2的序列、存在barcode堿基錯配或引物堿基錯配數(shù)＞2 bp的序列，并切掉barcode和引物后的序列堿基數(shù)＜50 bp的序列。將得到的高質(zhì)量序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

用QIIME（v1.70）平臺在建立的腳本程序上對獲取的高質(zhì)量序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析[22]。使用PyNAST[23]對序列進(jìn)行校準(zhǔn)排齊后，應(yīng)用UCLUST進(jìn)行序列歸并，從而在建立16S rRNA V3-V4區(qū)序列集的基礎(chǔ)上劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[24]。最后使用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）Release 11.5[25]和Greengenes（Release 13.8）[26]數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行同源性比對并確定其分類學(xué)地位。用PICRUSt軟件對利川醬豆進(jìn)行基因功能預(yù)測[27]，并基于蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫（clusters of orthologous groups of proteins，COG）進(jìn)行功能注釋[28]。

1.3.4 基于電子鼻技術(shù)利川醬豆風(fēng)味品質(zhì)的評價

準(zhǔn)確稱取5.0 g醬豆樣品置于電子鼻樣品瓶中，在室溫下將電子鼻探頭插入樣品瓶中進(jìn)行檢測。本研究中每個樣品測定時間為90 s，測試數(shù)據(jù)選49 s、50 s和51 s時的平均值，每個樣品測3個平行。

1.3.5 多元統(tǒng)計學(xué)分析

使用SAS9.0軟件進(jìn)行利川醬豆樣品中優(yōu)勢細(xì)菌菌屬和電子鼻各傳感器響應(yīng)值之間的相關(guān)性數(shù)據(jù)分析，選取相關(guān)性系數(shù)絕對值＞0.6為指標(biāo)，采用Cytoscape軟件（v3.5.1）繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖；使用R軟件（v4.0.3）繪制瀑布圖和熱圖；使用Origin 8.5軟件繪制柱狀堆積圖及OTU出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計圖。樣本細(xì)菌序列已上傳至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，獲取編號為mgp100938（https：//www.mg-rast.org/mgmain.html?mgpage=metazen2&project=mgp100938）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于門和屬水平的細(xì)菌群落組成分析

采用高通量測序?qū)︶u豆樣品的細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行分析，將樣品中相對含量＜1.0%的細(xì)菌門或?qū)贇w為其他類，平均相對含量≥1.0%的細(xì)菌門或?qū)贋閮?yōu)勢細(xì)菌門或?qū)?。首先對醬豆細(xì)菌門水平的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，利川醬豆樣品中的細(xì)菌門有硬壁菌門（Firmicutes）（99.27%）、變形菌門（Proteobacteria）（0.31%）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）（0.20%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（0.04%）和放線菌門（Actinobacteria）（0.03%），其中有0.15%的門序列未被鑒定到。由此可知利川醬豆樣品中的細(xì)菌微生物主要隸屬于Firmicutes。利川醬豆中細(xì)菌屬水平分析結(jié)果見圖2。

圖1 基于門水平利川醬豆樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Fig. 1 Bacterial community structure of Lichuan Jiangdou samples based on phylum level

圖2 基于屬水平利川醬豆樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Fig. 2 Bacterial community structure of Lichuan Jiangdou samples based on genus level

由圖2可知，芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為利川醬豆樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌屬，其平均相對含量分別為85.52%、4.03%和2.83%，且這3個菌屬均屬于Firmicutes。部分樣品的優(yōu)勢菌同其他樣品存在一定的差異，如樣品JD1、JD2和JD5未被鑒定的菌屬和魏斯氏菌屬相對含量較高，其中樣品JD2和JD5的葡萄球菌屬的相對含量亦比較高。利川醬豆樣品的優(yōu)勢細(xì)菌屬之間存在差異的原因可能與手工開放式制作外界環(huán)境及原輔料比例差異有一定的關(guān)系。

有研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus有耐高溫、易培養(yǎng)且在動物消化道內(nèi)能夠分泌多種促進(jìn)消化吸收的酶，從而維持身體健康，促進(jìn)生長等特點[29]。隸屬于乳桿菌目（Lactobacillales）中的魏斯氏菌屬（Weissella）作為乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強免疫和協(xié)助消化等[30]。Staphylococcus為革蘭氏陽性球菌，其多數(shù)為非致病菌，但是也有少數(shù)可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生[31]。利川醬豆主要是在密封的陶罐中厭氧發(fā)酵而成，但是其前期制作環(huán)境比較開放，原料多數(shù)未經(jīng)過殺菌，所以參與發(fā)酵過程的微生物種類較多，其中既有Bacillus和Weissella等有益菌的存在，同時也有少量Staphylococcus等致病菌或腐敗菌。因此，在利川醬豆發(fā)酵時可以適當(dāng)?shù)母纳瓢l(fā)酵環(huán)境，從而減少雜菌污染。

2.2 基于OTU水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

本研究在門和屬水平對利川醬豆細(xì)菌種類及相對含量進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在OTU水平上對其細(xì)菌群落特征進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 利川醬豆樣品中OTU出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計圖（A）和核心OTU相對含量瀑布圖（B）Fig. 3 Statistical chart of OTU occurrence times (A) and waterfall chart of core OTU relative content (B) in Lichuan Jiangdou samples

由圖3A可知，本研究的利川醬豆樣品共包含5 441個OTU，而在10個樣品中均出現(xiàn)的OTU有422個，占OTU總數(shù)的7.77%，其包含了454 108 條序列，占總序列的84.70%。由圖3B可知，平均相對含量＞1.0%的OTU有15 個，占OTU總數(shù)的0.28%，其包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的36.35%，且這15個OTU均隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），由此可進(jìn)一步說明Bacillus是利川醬豆樣品中均存在且相對含量＞1%的細(xì)菌屬，即核心優(yōu)勢細(xì)菌。

2.3 基因功能預(yù)測

發(fā)酵過程中微生物種類及含量對醬豆品質(zhì)與風(fēng)味有一定的影響，但目前對利川醬豆細(xì)菌潛在功能相關(guān)研究較少。本研究進(jìn)一步對利川醬豆中細(xì)菌序列進(jìn)行了功能預(yù)測，結(jié)果見圖4。

圖4 基因功能預(yù)測熱圖Fig. 4 Heat map of gene function prediction

由圖4可知，本研究的10個利川醬豆樣品分別注釋到了23個功能大類。其中醬豆細(xì)菌類群在“氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝”、“碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝”、“轉(zhuǎn)錄”和“復(fù)制、重組和修復(fù)”功能上相對含量較高。利川醬豆在自身代謝功能上表達(dá)較高可能與其原料中含有較為豐富的氨基酸態(tài)氮、總糖和蛋白質(zhì)等基本營養(yǎng)成分有關(guān)[32]。由圖4亦可知，醬豆細(xì)菌類群序列中具有“核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的加工與修飾”、“染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)”和“細(xì)胞骨架”等功能的序列占比則相對低。

2.4 基于電子鼻技術(shù)利川醬豆風(fēng)味品質(zhì)的評價

采用電子鼻技術(shù)對利川醬豆樣品的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行評價，結(jié)果見表1。

表1 電子鼻各傳感器對利川醬豆樣品的響應(yīng)值Table 1 Response value of each sensor of electronic nose to Lichuan Jiangdou samples

由表1可知，電子鼻傳感器W6S和W3S的變異系數(shù)分別為4.40%和4.85%，均＜10%；而其他8個傳感器的變異系數(shù)均＞10%。即10 個醬豆樣品的風(fēng)味在氫氣和烷烴類的差異小，而在芳香成分、甲烷、氮氧化合物、乙醇、有機硫化物和萜烯類的差異大。由此可知，采用傳統(tǒng)方法制作的利川醬豆品質(zhì)不穩(wěn)定，樣品間的風(fēng)味物質(zhì)存在較大的差異，可能與樣品中不同微生物的影響有關(guān)。

2.5 利川醬豆優(yōu)勢細(xì)菌屬與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

進(jìn)一步對利川醬豆樣品的優(yōu)勢細(xì)菌屬和風(fēng)味物質(zhì)間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。

圖5 利川醬豆樣品中優(yōu)勢細(xì)菌屬與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 Correlation network diagram of dominant bacteria genus and flavor substances in Lichuan Jiangdou samples

由圖5可知，與有機硫化物等風(fēng)味物質(zhì)的生成呈現(xiàn)正相關(guān)的菌屬為Weissella，Staphylococcus與乙醇、烷烴和甲烷等物質(zhì)的形成呈現(xiàn)正相關(guān)，與芳香型化合物、氮氧化物和氫氣等物質(zhì)的形成呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；Bacillus與乙醇、烷烴、甲烷、氮氧化物、氫氣等物質(zhì)的形成呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而與烷烴芳香成分的形成呈現(xiàn)正相關(guān)。由此可知，Bacillus對利川醬豆樣品的風(fēng)味形成可能起到了比較積極的作用。

3 結(jié)論

結(jié)果顯示，利川醬豆樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌門為Firmicutes，優(yōu)勢細(xì)菌屬為Bacillus、Weissella和Staphylococcus，功能預(yù)測結(jié)果顯示樣本中細(xì)菌序列潛在功能占比較高的為“氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝”、“碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝”、“轉(zhuǎn)錄”與“復(fù)制、重組和修復(fù)”。醬豆樣品的風(fēng)味在氫氣和烷烴類的差異小，而在芳香成分、甲烷、氮氧化合物、乙醇、有機硫化物和萜烯類的差異大，且優(yōu)勢細(xì)菌屬中Bacillus與芳香類風(fēng)味指標(biāo)呈明顯正相關(guān)，對利川醬豆樣品的風(fēng)味形成起到了較為積極的作用。