張貴富，田 萌，于寒松，朱先明，朱世杰，任大勇

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.長春市朱老六食品股份有限公司，吉林 長春 130500）

腐乳至今已有上百年的歷史，為我國特有的發(fā)酵制品之一。腐乳通常分為青方、紅方、白方三大類。青方腐乳風味奇特，與眾不同，具有刺激性的臭味，顏色青色或豆青色，故而得名。青方腐乳采用優(yōu)質大豆為原料，利用毛霉菌發(fā)酵，自備優(yōu)質鹵湯汁作為輔料，經(jīng)過磨漿、成坯、培養(yǎng)、前期發(fā)酵、腌漬、裝壇、后期發(fā)酵等工藝制備[1]。青方腐乳因其分解較其他品種徹底，氨基酸的含量較為豐富，特別是青方腐乳中含有較多的丙氨酸以及谷氨酸、天門冬氨酸、烏苷酸、肌苷酸和醇類生成芳香酯類的化合物，這類物質賦予青方鮮美的滋味[2-3]。

乳酸菌，常被用作人體的益生菌[4]。相比于從其他傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出許多乳酸菌菌株，對青方腐乳中乳酸菌的研究仍然較少[5-6]。由于青方腐乳中含有大量的蛋白質和糖類，因此其特別適合乳酸菌的生長，有研究表明，青方腐乳中的乳酸菌具有多樣性[7]。由于青方腐乳自身的獨特性，其乳酸菌可能與酸奶、泡菜等食品中分離的菌株具有不同的特性。

本試驗從青方腐乳中分離乳酸菌，通過菌株形態(tài)學、生理生化試驗及16S rRNA序列分析相結合的方法對分離菌株進行鑒定。通過人工胃液、膽鹽的耐受性及其細胞表面特性測定對分離菌株進行初步篩選，并將篩選出的菌株進行清除亞硝酸鈉、降膽固醇、乳糖消耗、抑菌和抗氧化的益生特性功能試驗，旨在篩選出有效降亞硝酸鈉、膽固醇及乳糖并兼具抑菌、抗氧化的功能性乳酸菌，從而為加工生產(chǎn)高品質青方腐乳提供優(yōu)質種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

青方腐乳：長春市朱老六食品股份有限公司；福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）：吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院食品與安全毒理學實驗室。

1.1.2 化學試劑

磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：北京酷來搏科技有限公司；過氧化氫（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；氯化鈉、二甲苯、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵（均為分析純）：北京化工廠；乳糖（純度＞98%）：北京鴻潤寶順科技有限公司；硫代乙醇酸鈉（分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；牛膽鹽（生化試劑）：上海藍季科技發(fā)展有限公司；膽固醇、抗壞血酸（均為分析純）：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；胃蛋白酶（酶活力＞1 200 U/g）、氫氧化鈉、乙醇、蒽酮、溴甲酚紫（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸（分析純）：天津市光復精細化工研究所；1,10-菲啰啉（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD型凈化工作臺：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；WMW-02型電熱恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；UV-2600i型紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；5804R型離心機：德國Eppendorf公司；CX23LEDRFS1C型生物顯微鏡：奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司；QL-901型渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Delta320型pH計：梅特勒托利儀器。

1.3 方法

1.3.1 青方腐乳中潛在乳酸桿菌的分離及初步鑒定

將當?shù)爻胁少彽那喾礁樽鳛榉蛛x乳酸桿菌的來源。將1 mL腐乳湯汁加入到9 mL無菌水中，將其充分混勻后，吸取1 mL再加入到9 mL無菌水中，依次梯度稀釋至10-6，分別移取不同濃度的湯汁100 μL至無菌MRS固體培養(yǎng)基（含有0.15%溴甲酚紫），置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取黃色單菌落（乳酸菌代謝產(chǎn)酸會使指示劑溴甲酚紫由紫變黃）接種于MRS固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)48 h，選擇表面光滑的單菌落重復純化兩次。純化后的菌株進行形態(tài)特征、過氧化氫酶試驗和革蘭氏染色的初步鑒定。

1.3.2 菌株菌體細胞的制備

分離菌株在厭氧培養(yǎng)箱中，在MRS肉湯中37 ℃培養(yǎng)48 h，得到菌株培養(yǎng)液，將其在4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，得到的菌體細胞用于后續(xù)人工胃液和膽鹽耐受性及細胞表面疏水性試驗。

1.3.3 人工胃液和膽鹽的耐受性試驗

分離菌株菌體細胞后用PBS緩沖液（經(jīng)121℃滅菌15min，pH 7.2）洗滌2次，并將菌體細胞重懸于PBS溶液中使其濃度達到1×109CFU/mL，并將10%的菌懸液加入到MRS-人工胃液（MRS培養(yǎng)液中添加0.35%胃蛋白酶，0.2%氯化鈉，pH值為1.5，經(jīng)過0.22 μm濾網(wǎng)過濾）中，37 ℃厭氧培養(yǎng)3 h。以菌懸液加入到MRS中作為對照。培養(yǎng)結束后，在波長600 nm處測量其光密度（opticaldensity，OD）值。菌株人工胃液耐受性計算公式如下：

式中：P1和P0分別為接種于MRS-人工胃液和MRS中的菌體細胞的OD600nm值。

同樣，將菌懸液按2%的接種量接種于MRS-膽鹽培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基中含0.3%牛膽鹽，pH為7.2）中，以菌懸液加入到MRS中的作為對照。在37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，記錄在600 nm波長處的OD600nm值。菌株膽鹽耐受性計算公式如下：

式中：P1和P0分別為接種于MRS-膽鹽和MRS中的菌體細胞的OD600nm值。

1.3.4 細胞表面疏水性

參考文獻[8]對分離菌株進行烴類的黏附測試（bacterial adherence to hydrocarbons，BATH）。根據(jù)DEL R B等[9]的方法測定分離菌株的自聚合能力。

1.3.5 菌株分子生物學鑒定

以染色體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）為模板，利用引物A27F（5'-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）和A1495R（5'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）擴增篩選細菌的16S rRNA基因序列[5]（約1 470 bp）。將測序后得到的16S rRNA基因序列提交至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中，采用生物大分子序列基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對，進行序列一致性分析。

1.3.6 益生特性功能試驗

（1）亞硝酸鈉清除試驗

根據(jù)COLLINS-THOMPSON D L等[10]將100 μL的菌懸液（1×109CFU/mL）加入到1 mL無菌MRS肉湯培養(yǎng)基（亞硝酸鈉含量為1 500 μg/mL）中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，用亞硝酸鹽比色法測定殘留的亞硝酸鈉[11]。并計算亞硝酸鈉清除率，其計算公式如下：

式中：P0和P1分別表示0 h和48 h時MRS肉湯培養(yǎng)基中殘留的亞硝酸鈉含量，μg/mL。

（2）降膽固醇試驗

將100 μL 1×109CFU/mL的菌液接種于10 mL添加了硫代乙醇酸鈉（0.2%）、牛膽鹽（0.3%）和水溶性膽固醇（終質量濃度100 μg/mL）的MRS培養(yǎng)基中，以未接菌的MRS肉湯作為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h后，收集上清液，測定殘余膽固醇含量[12]。計算膽固醇降低率，其計算公式如下：

式中：P0和P1分別為0 h和24 h時MRS培養(yǎng)基中的膽固醇含量，μg/mL。

（3）乳糖分解試驗

將100 μL的1×109CFU/mL菌懸液接種到2.5 mL含有乳糖的無菌MRS肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用蒽酮比色法測定肉湯中剩余乳糖含量。計算乳糖消耗率，其計算公式如下：

式中：P0和P1分別是0 h和24 h時肉湯中殘留的乳糖，μg/mL。

1.3.7 抑菌試驗

本研究采用紙片瓊脂擴散法[13]檢測篩選出的菌株對病原菌的抑制作用，分別將20 μL的新鮮細菌培養(yǎng)液（將菌體細胞接種于無菌MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h）、菌細胞重懸液（將新鮮細菌培養(yǎng)液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，經(jīng)無菌PBS緩沖液洗滌后，重懸于PBS緩沖液中）和新鮮細菌培養(yǎng)液的上清液（新鮮菌體培養(yǎng)液去除菌體細胞后得到，pH值為6.5）加入到直徑為6 mm無菌濾紙上，將濾紙置于分別涂有6種病原菌的LB瓊脂平板上來測定各菌株的培養(yǎng)液、重懸液以及上清液對病原菌的抑制效果。以無菌PBS作為空白對照。所有培養(yǎng)皿在37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。根據(jù)抑菌圈的半徑來評估每個菌株的抑菌能力。

紙片半徑為3 mm，抑菌圈半徑=3 mm表示無拮抗作用；抑菌圈半徑3～8 mm表示拮抗活性弱；抑菌圈半徑＞8 mm表示拮抗活性強。

1.3.8 抗氧化能力試驗

本研究采用羥基自由基（·OH）[14]、DPPH自由基清除試驗[15]及亞鐵離子（Fe2+）螯合能力測定試驗[14]對菌株的抗氧化能力進行綜合評價。將新鮮細菌培養(yǎng)液離心后收集上清液，將菌體沉淀洗滌2次后重懸于PBS中（濃度為109CFU/mL），將PBS重懸液和上清液用于測試抗氧化特性。

將0.5 mL的1,10-菲啰啉（2.5 mmoL/L）、1 mL PBS和0.5 mL 硫酸亞鐵（2.5 mmoL/L）混合在試管中，然后將1 mL樣品和0.5 mL 過氧化氫（0.1%）依次加入其中。將混合物在37 ℃孵育1 h后，在波長536 nm處測定OD值（Ps）。用1 mL蒸餾水代替樣品測定OD536nm值（P1），用1.5 mL蒸餾水代替樣品和過氧化氫測定其OD536nm值（P0）?！H清除率計算公式如下：

將0.5 mL樣品添加到2 mL DPPH-乙醇（0.2 mmoL/L）溶液中，在黑暗環(huán)境中反應30 min，然后測定其在波長517 nm處的OD517nm值（Ps）。以0.5 mL蒸餾水代替樣品測定OD517nm值（P1）。DPPH自由基清除率計算公式如下：

將0.1 mL抗壞血酸（0.1%），0.1 mL 硫酸亞鐵（0.4%）和1 mL 氫氧化鈉（0.2 moL/mL）混合在試管中，然后加入0.5 mL樣品，37 ℃水浴加熱20 min，用三氯乙酸沉淀去除蛋白質，3000r/min離心10min，移取上清液0.2 mL至2 mL1,10-菲啰啉（0.4%）中。反應10 min后，測定其在波長510 nm處的OD510nm值（Ps）。用蒸餾水代替樣品測定OD510nm值（P0）。計算Fe2+螯合率，其計算公式如下：

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均是3次平行試驗得到的數(shù)據(jù)，以“平均值±標準差”并利用GraphPad Prism 6.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的特征

從青方腐乳中分離得到24株菌株（編號為S1～S24）。所有分離菌株均為桿狀，革蘭氏染色為陽性且過氧化氫酶試驗為陰性，由于這24株菌均能使指示劑溴甲酚紫由紫變黃，初步認定這些分離菌株屬于乳酸桿菌[16-17]。

2.2 菌株人工胃液和膽鹽的耐受性及細胞表面疏水性

人工胃液和膽鹽可用于評估細菌的相對存活率。乳酸菌的生理功能是基于這它們在胃腸道中的菌體數(shù)量，這意味著高耐受性菌株往往是更好的益生菌候選菌株[18-19]。因此，對人工胃液和膽鹽的耐受性是評價乳酸菌益生菌特性的重要指標之一。

通過胃腸道液體的極端環(huán)境，乳酸菌能夠到達胃腸道。然后，如果它們能夠粘附在胃腸道粘膜層上，就可以對寄主的健康做出長期的貢獻[20-21]，例如，乳酸菌與病原體爭奪在腸道內(nèi)的黏附位點，阻斷病原體對腸道上皮細胞的感染[22]。有研究表明，細菌的表面疏水性與粘附性能有關，疏水性越高，黏附力越強[9，23-24]。因此，本研究通過菌體疏水性來間接反映其黏附性。

由表1可知，不同菌株對人工胃液的耐受性不同。菌株S8的耐受性最強，為（96.32±2.42）%，而菌株S7在低pH環(huán)境下很難生長繁殖（耐受性低于45%的菌株未顯示耐受試驗結果）。菌株S21、S10、S23、S20、S24和S6均具有較好的耐受性（60.92%～80.53%）。

表1 乳酸桿菌菌株的耐酸性、膽鹽耐受性和細胞表面疏水性Table 1 Acid tolerance,bile tolerance and cell-surface hydrophobicity of Lactobacillus strains

由表1可知，這些菌株對膽鹽的耐受范圍為30.85%～58.33%。菌株S10、S11、S13的存活率最高，分別為58.33%、54.67%、56.72%，也就是說它們有更大的可能存活于腸道中。菌株S12在膽鹽耐受試驗中表現(xiàn)出存活率最差。篩選掉耐受性＜40%的菌株，根據(jù)耐受試驗結果初步篩選出S3、S5、S6、S8、S10、S11、S13、S17、S20、S21、S23、S24共12株乳酸菌進行進一步的研究。

由表1可知，菌體細胞的疏水性是通過其對烴類的黏附和自聚集來評價的。在BATH實驗中，菌株S6的粘附性優(yōu)于其他菌株，黏附率為（41.95±0.65）%。菌株S11、S17和S24彼此具有的疏水性相似（約14%）。菌株S6、S10、S11、S13、S17、S21、S23、S24的疏水性均高于10.00%。在自聚集試驗中，菌株S24、S23、S17和S6的自聚合率最高（＞42%），其次是菌株S21、S13、S20、S3和S11（26.0%～39.0%）。

綜上，選擇8株人工胃液和膽鹽的耐受性及細胞表面疏水性較好的菌株（S6、S10、S11、S13、S17、S21、S23、S24）進行進一步分子生物學鑒定。

2.3 篩選菌株的鑒定

篩選出的8株菌株的16S rRNA基因鑒定結果見表2。由表2可知，8株菌株分別屬于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（菌株S6、S17和S24，相似性99%～100%）、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）（菌株S10、S11和S21，相似性93%～94%）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）（菌株S13，相似性98%）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）（菌株S23，相似性99%）。值得注意的是，唾液乳桿菌的相似性值較低，可能是新物種，需要進一步鑒定[5]。

表2 篩選菌株16S rRNA基因序列分析結果Table 2 Analysis result of 16S rRNA gene sequence of screened strains

2.4 降亞硝酸鈉、膽固醇及乳糖試驗

亞硝酸鈉是食品中的一種重要添加劑，但它會產(chǎn)生致癌化合物，對肝臟、腎臟和其他器官造成損害[25]。據(jù)報道，乳酸桿菌具有清除亞硝酸鈉的能力，從而保護機體免受N-亞硝基化合物的侵害[26]。從表3中可以看出，這8株菌大多都表現(xiàn)出了降低亞硝酸鈉水平的能力，其中菌株S6和S21的亞硝酸鈉清除率分別為（86.84±1.74）%和（82.79±2.17）%，其次為菌株S13、S23和S24，均為75%左右。菌株S10和S11的清除能力較弱（約為36%）。綜上所述，本研究篩選到的乳桿菌是一種很好的清除亞硝酸鈉（N-亞硝基化合物）的生物資源。過高的膽固醇會導致高膽固醇血癥，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化、膽結石以及靜脈血栓的形成均與高膽固醇血癥有很大關系。研究表明，食用乳酸菌有助于降低血液中膽固醇水平[27]。從表3中可以看出，菌株S6和S10具有最強的降低膽固醇水平能力，分別達到61.22%和57.50%，菌株S11、S13、S21和S24降低膽固醇水平的能力均達到29%以上。S17和S23降低膽固醇水平的能力最弱，分別為27.09%和19.73%。顯然，乳酸菌在降低膽固醇水平的能力方面存在顯著差異?？梢詫⒔档湍懝檀寄芰^好的乳酸菌菌株應用于食物的加工生產(chǎn)中，以降低膽固醇對機體可能導致的潛在風險。乳糖不耐受癥是指某些人群由于缺乏相應的乳糖酶，導致機體無法對乳糖消化吸收，同時還會使胃腸道不適，甚至會出現(xiàn)腹瀉、腹脹和腹部絞痛等癥狀，而乳酸桿菌被證實能夠減緩乳糖不耐受癥[28]。從表3中可以看出，分離的8株乳酸桿菌的乳糖消耗能力均為24.91%～33.07%。

表3 篩選菌株降低亞硝酸鈉、膽固醇和乳糖的能力Table 3 Ability of reducing nitrite,cholesterol and lactose of screened strains

2.5 抑菌試驗

本試驗以新鮮的乳酸菌培養(yǎng)液、菌株細胞重懸液和上清液來檢測其對6種病原菌的拮抗能力，結果見表4。

表4 篩選菌株抑菌試驗結果Table 4 Results of antibacterial tests of screened strains

由表4可知，大多數(shù)乳酸桿菌菌株對腸炎沙門氏菌及肺炎克雷伯菌具有較強的抗菌活性（菌株S6、S10的菌懸液對腸炎沙門氏菌的抑菌半徑＞8.6 mm，菌株S6、S10、S13、S17的上清液對腸炎沙門氏菌的抑菌半徑＞8.3 mm；除菌株S23、S24外，其余6株細菌的菌懸液對肺炎克雷伯菌的抑菌半徑均＞8.0 mm，菌株S6、S11、S13、S17的重懸液的抑菌半徑＞8.5 mm，對福氏志賀菌和鼠傷寒沙門氏菌的增殖抑制作用也很明顯（菌株S6、S10、S13、S17、S21的菌懸液對福氏志賀菌的抑菌半徑均＞8.2 mm；菌株S6、S10、S13、S17的菌懸液對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌半徑＞8.2 mm，S11的抑菌半徑也達到7.7 mm），但多數(shù)菌株對痢疾志賀氏菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制能力較弱（除菌株S17的菌懸液外，各菌株的菌懸液、重懸液及上清液對痢疾志賀氏菌的抑菌半徑均＜8.0 mm；8株細菌對蠟樣芽孢桿菌的抑菌半徑均＜8.0 mm，除菌株S17外的7株細菌上清液均未表現(xiàn)出抑菌能力）。拮抗活性具有菌株特異性，菌株S6對試驗病原菌的綜合拮抗能力最強（除蠟樣芽孢桿菌、痢疾志賀氏菌（抑菌半徑為7.3 mm）外，菌株S6的菌懸液對其余病原菌的抑菌半徑＞9.2 mm，菌株S6的重懸液對肺炎克雷伯菌的抑菌半徑為9.3 mm，菌株S6的上清液對腸炎沙門氏菌和肺炎克雷伯菌兩種病原菌的抑菌半徑都＞11 mm），其次是菌株S13和S17，而菌株S23和S24的抑菌能力最弱（S23、S24對鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌基本無抑菌效果，對其他病原菌的抑菌半徑＜6.1 mm）。與菌株細胞重懸液及上清液相比，乳酸菌培養(yǎng)液具有更強的抗菌活性。

2.6 抗氧化能力

代謝過程中的許多自由基會對人體造成嚴重的傷害，其中羥基自由基的活動對人體的危害最大。此前的研究表明，一些乳酸桿菌可以保護宿主免受自由基的攻擊[29]。本研究采用3種方法對分離得到的乳酸桿菌的抗氧化活性進行了評價，結果見表5。

表5 篩選菌株抗氧化活性試驗結果Table 5 Result of antioxidant activity tests of screened strains

由表5可知，乳酸桿菌的上清液能夠有效地清除·OH，其中菌株S13、S6、S21和S23的上清液具有較強的·OH清除活性，清除率為53.51%～86.38%。除菌株S10外，所有菌株上清液的抗氧化活性均高于相對應的重懸液。據(jù)此可初步認定，乳酸桿菌分泌的胞外物質在清除羥基自由基方面發(fā)揮主要作用。

由表5可知，菌株S6和S11的上清液具有最強的清除DPPH自由基的能力分別為56.29%、53.65%，而菌株S23的重懸液抗氧化活性最強，為35.74%。

由表5可知，分離菌株在Fe2+螯合能力方面存在巨大的差異。菌株S17和S6的上清液對Fe2+螯合能力最強，分別為69.82%、58.14%，菌株S23和S13也表現(xiàn)出了很好的Fe2+螯合能力，分別為41.81%、29.05%，但其余菌株沒有明顯的Fe2+螯合能力。

3 結論

本研究從青方腐乳中分離出24株菌株，初步篩選出8株進行了5種功能特性檢測。結果表明，植物乳桿菌S6具有更好的降低亞硝酸鈉及膽固醇的能力，同時在降乳糖方面也表現(xiàn)良好；在抑菌試驗中，對福氏志賀菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、肺炎克雷伯菌5種病原菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用；菌株S6在清除·OH自由基、DPPH自由基以及螯合Fe2+方面同樣表現(xiàn)良好。綜合來看，S6具有最佳的益生菌特性。由于菌株S6篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵食品，因此食用安全性具有保障，后續(xù)的研究將對該菌株的發(fā)酵性能和益生特性進行進一步的研究，以期未來在包括腐乳在內(nèi)的發(fā)酵食品中加以應用。