周 文，舒學(xué)香，張崇軍，隋 明

（1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 輕工工程學(xué)院，四川 都江堰 611830；2.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065）

窖泥對濃香型白酒的風(fēng)味特征和品質(zhì)有非常重要的影響[1]，但是不同性狀的窖泥（新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥）的理化特性存在顯著差異[2-3]，這也導(dǎo)致了不同性狀的窖泥中微生物群落組成結(jié)構(gòu)上的明顯差異[4]。窖泥微生物群落的代謝作用形成了大量的風(fēng)味物質(zhì)，這些風(fēng)味物質(zhì)決定著濃香型白酒的品質(zhì)[5]，因此解析不同性狀窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)并預(yù)測微生物群落的代謝功能對揭示濃香型白酒品質(zhì)差異的成因具有重要的意義。

早期探索窖泥微生物的方法主要是分離培養(yǎng)法[6]，但由于窖泥環(huán)境的密閉性、微生物厭氧生長的特殊性以及傳統(tǒng)培養(yǎng)法的技術(shù)局限性，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室條件下大量窖泥微生物難以培養(yǎng)或不可培養(yǎng)[7]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，一些免培養(yǎng)技術(shù)逐漸應(yīng)用于白酒釀造微生物的研究中[8-10]，這些技術(shù)對全面解析窖泥微生物的群落結(jié)構(gòu)起到了極大的促進(jìn)作用。例如，有研究運(yùn)用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)發(fā)現(xiàn)窖泥中的細(xì)菌主要包括厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）等[11-12]，也有研究采用高通量測序法得到了類似的結(jié)論[13-14]，并發(fā)現(xiàn)窖泥中古菌主要是廣古菌門（Euryarchaeota）[15-16]。但是，目前運(yùn)用高通量測序法對窖泥性狀與微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝功能之間的關(guān)系進(jìn)行全面分析的研究鮮見報(bào)道。

本研究采用基于16S rRNA的窖泥細(xì)菌群落多樣性分析法解析宜賓地區(qū)新窖泥、老熟窖泥和老化窖泥的細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)差異，并通過PICRUSt菌群代謝功能預(yù)測工具推測不同性狀窖泥微生物的代謝功能差異，以期確定影響該地區(qū)窖泥性狀和濃香型白酒風(fēng)味的關(guān)鍵微生物和關(guān)鍵功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥：取自宜賓地區(qū)某白酒釀造企業(yè)，窖泥的性狀（新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥）由企業(yè)專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)其感官性質(zhì)判斷。取樣人員佩戴口罩、無菌無酶手套，取窖底泥500 g迅速混合均勻，并保存在液氮中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。

Fast脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）SPIN Kit for soil：美國Mpbio公司；RNase-free雙蒸水（分子生物級）：生工生物工程（上海）股份有限公司；MiSeq Reagent Kit v3/NovaSeq Reagent Kits：美國Illumina公司；NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit：美國Bioo Scientific公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf N13462C移液器、Eppendorf 5430 R小型離心機(jī)、Eppendorf5424R高速臺式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)：美國Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；QuantusTM微型熒光計(jì)：美國Promega公司；Illumina Miseq測序儀：美國Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 窖泥總DNA提取與檢測

采用FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒提取三種性狀窖泥樣品的總DNA，每個(gè)性狀的窖泥都做三個(gè)平行。提取的總DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，電壓5 V/cm，電泳時(shí)間20 min；完整性檢測合格的DNA用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測其純度和濃度。

1.3.2 窖泥細(xì)菌多樣性文庫構(gòu)建與測序

窖泥細(xì)菌多樣性測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。以提取的總DNA為模板，采用上游引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和下游引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對窖泥細(xì)菌的16S V3-V4區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：5×FastPfu Buffer 4 μL；FastPfu Polymerase 0.4 μL；2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）2 μL；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）緩沖液0.2 μL；上游引物338F（5 μmol/L）0.8μL；下游引物（5 μmol/L）0.8 μL；DNA模板10 ng；加雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。使用2%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測并回收，將檢測合格的樣品用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒按照其說明書對回收產(chǎn)物進(jìn)行純化，并用QuantusTM微型熒光計(jì)進(jìn)行定量檢測。按照測序量要求將PCR產(chǎn)物用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫，再使用Illumina公司的Miseq PE300平臺上機(jī)測序。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用fastp[17]（https：//github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）軟件對原始序列進(jìn)行質(zhì)控，再使用FLASH[18]（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）軟件進(jìn)行原始序列的拼接。拼接序列采用UPARSE[19]（http：//drive5.com/uparse/，version 7.1）軟件按照97%[19-20]的相似度進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類并剔除嵌合體。最后用RDP classifier[21]（http：//rdp.cme.msu.edu/，version2.2）軟件比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫（v138）進(jìn)行每條序列的物種分類注釋，設(shè)置比對閾值為70%。通過PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）菌群代謝功能預(yù)測工具[22]，將樣品的16S rRNA基因序列通過京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝功能預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU劃分與分析

經(jīng)質(zhì)控后的測序序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，并將豐度值低于全體樣本測序總量0.001%的OTU去除，對每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行比對后獲得每個(gè)OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息。根據(jù)新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥的OTU劃分結(jié)果，計(jì)算它們之間的共有OTU數(shù)量，并繪制不同性狀窖泥OTU劃分Venn圖，結(jié)果見圖1。

圖1 老熟、老化和新窖泥樣品的OTU韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of OTU of aged,degenerated and new pit mud samples

由圖1可知，三種性狀窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，三種窖泥的獨(dú)有OTU占比分別達(dá)到：新窖泥51.26%，老化窖泥40.1%，老熟窖泥34.68%，這也是三種性狀窖泥所產(chǎn)濃香型白酒品質(zhì)差異的重要原因。其中老熟窖泥與老化窖泥之間的共有OTU數(shù)量高于它們與新窖泥的共有OTU數(shù)量，表明它們之間的相似性更高，說明了建窖以后新窖泥中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)都朝著老熟方向發(fā)展，但一旦工藝不當(dāng)，窖泥可能會由老熟轉(zhuǎn)向老化的方向發(fā)展。

2.2 Alpha多樣性分析

在Alpha多樣性分析中常用ACE指數(shù)和超1（Chao1）指數(shù)來顯示窖泥中細(xì)菌群落的豐富度，用辛普森（Simpson）指數(shù)和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)來體現(xiàn)窖泥細(xì)菌群落的多樣性，三種性狀窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的Alpha多樣性分析結(jié)果見表1。

表1 老熟、老化和新窖泥樣品中細(xì)菌群落的α多樣性分析結(jié)果Table 1 Analysis results of α diversity of bacterial community in aged,degenerated and new pit mud samples

由表1可知，老化窖泥和老熟窖泥的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)基本相等，而新窖泥則相對更低，說明老熟、老化窖泥中細(xì)菌群落豐富度高于新窖泥，物種種類更多，其原因可能是在窖泥的往復(fù)使用過程中，來源于糟醅和釀酒環(huán)境中的微生物物種逐漸富集所致。從Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)可以看出，其變化規(guī)律為新窖泥＞老熟窖泥＞老化窖泥，表明新窖泥的細(xì)菌群落多樣性更高。多樣性指數(shù)綜合考慮了細(xì)菌群落的豐富度和均勻度，其中Shannon指數(shù)側(cè)重于考查稀有OTU數(shù)，而Simpson指數(shù)側(cè)重于考查優(yōu)勢OTU數(shù)[23-25]。由于新窖泥的豐富度較低，但其多樣性更高，說明新窖泥中稀有物種更多，且優(yōu)勢物種更突出；隨著窖泥的往復(fù)使用，其中的稀有物種可能會逐漸被淘汰，使窖泥中細(xì)菌群落更均勻，優(yōu)勢物種也不再明顯，導(dǎo)致老熟窖泥和老化窖泥的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均低于新窖泥。

2.3 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

經(jīng)測序序列的物種分類注釋，從不同性狀窖泥的細(xì)菌微生物群落中共鑒定出34個(gè)細(xì)菌門和735個(gè)細(xì)菌屬。從三種窖泥中根據(jù)顯著性差異分析結(jié)果選取差異大小排前20的細(xì)菌屬做柱狀圖，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，三種性狀窖泥的細(xì)菌微生物組成結(jié)構(gòu)在“屬”水平上存在顯著差異，其差異主要體現(xiàn)在Caproiciproducens和乳酸桿菌（Lactobacillus）的相對豐度。其中Caproiciproducens在老熟和老化窖泥中的平均相對豐度更高，分別達(dá)到了38.04%和34.78%，顯著高于新窖泥（5.47%）；乳酸桿菌（Lactobacillus）的平均相對豐度變化規(guī)律則相反，其在新窖泥中的相對豐度達(dá)到28.26%，在老熟窖泥和老化窖泥則只有19.40%和3.95%。由此說明，Caproiciproducens可能是該地區(qū)窖泥成熟的標(biāo)志，在窖泥的往復(fù)使用過程中，Caproiciproducens可能更適應(yīng)窖泥環(huán)境，使其逐漸在老熟窖泥中富集，該菌是產(chǎn)生己酸的功能菌，己酸是合成濃香型白酒中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯的重要底物，因此，老熟窖泥中富集Caproiciproducens對濃香型白酒的風(fēng)味和品質(zhì)是有利的。目前，對Caproiciproducens的研究已有一定成果，表明該菌可通過鏈延長反應(yīng)生成乳酸、乙酸、丁酸、己酸等有機(jī)酸[24]，這些有機(jī)酸對濃香型白酒的風(fēng)味都有重要影響，并且它們還是產(chǎn)生濃香型白酒中有機(jī)酸乙酯的重要底物，同時(shí)Caproiciproducens還具有轉(zhuǎn)化乳酸生成己酸的能力[25]，以達(dá)到“增己降乳”的目的。乳酸桿菌（Lactobacillus）在新窖泥中高于老熟和老化窖泥的原因可能是在制作新窖泥時(shí)原料和環(huán)境中的乳酸桿菌（Lactobacillus）豐度較高且易于繁殖所致，在窖泥的往復(fù)使用過程中，環(huán)境條件對乳酸桿菌（Lactobacillus）可能有抑制作用，且Caproiciproducens等其他微生物逐漸富集，引起乳酸桿菌（Lactobacillus）在窖泥成熟過程逐漸極少。這一變化規(guī)律與其他地區(qū)、其他酒廠已有的研究報(bào)告是一致的[26]。

圖2 基于屬水平老熟、老化和新窖泥樣品中細(xì)菌群落組成差異分析結(jié)果Fig. 2 Analysis results of bacterial community composition difference between aged,degenerated and new pit mud samples based on genus level

為進(jìn)一步探討不同性狀窖泥在細(xì)菌分類學(xué)組成上的差異，對三種窖泥中相對豐度總量排名前50位的細(xì)菌屬進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，新窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與老熟和老化窖泥截然相反，這充分說明在窖泥的長期使用過程中菌群發(fā)生了顯著變化，其原因可能是在周期性的往復(fù)發(fā)酵過程中糟醅、黃水等物質(zhì)持續(xù)地影響窖泥理化條件，并反復(fù)地提供糖類、氨基酸等有機(jī)質(zhì)以及來自大曲、釀造環(huán)境等介質(zhì)中的細(xì)菌，使窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)逐漸改變。老熟窖泥與老化窖泥之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在較大差異，這說明窖泥的退化過程也會導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的逐漸變化。

圖3 基于屬水平老熟、老化和新窖泥樣品中細(xì)菌群落聚類分析結(jié)果Fig. 3 Results of cluster analysis of bacterial community in aged,degenerated and new pit mud samples based on genus level

2.4 窖泥細(xì)菌群落代謝功能預(yù)測分析結(jié)果

通過PICRUSt工具將老熟、老化、新窖泥的16S rRNA基因序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行菌群代謝功能預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在KEGG數(shù)據(jù)庫6大類代謝通路（代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環(huán)境信息處理（EnvironmentalInformation Processing）、細(xì)胞過程（Cellular Processes）、生物系統(tǒng)（Organismal Systems）、人類疾?。℉uman Diseases））中，窖泥細(xì)菌群落在代謝（Metabolism）功能的相對豐度最高。為進(jìn)一步分析窖泥細(xì)菌群落在代謝（Metabolism）大類上具體功能和不同性狀窖泥之間的差異，進(jìn)行代謝（Metabolism）大類第二級預(yù)測，結(jié)果見圖4。

圖4 PICRUSt預(yù)測的窖泥樣品中細(xì)菌群落代謝功能第二級分布結(jié)果Fig. 4 Second-order distribution of metabolic function of bacterial community in pit mud samples predicted by PICRUSt

由圖4可知，窖泥中細(xì)菌群落在碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）和氨基酸代謝（amino acid metabolism）方面的能力最強(qiáng)，其原因可能是濃香型白酒釀造過程中糟醅和黃水持續(xù)不斷地為窖泥提供大量糖類、氨基酸類物質(zhì)，窖泥中的細(xì)菌以此為底物可代謝產(chǎn)生醇、醛、酸、酯類風(fēng)味物質(zhì)，因此這兩類代謝作用最強(qiáng)。從碳水化合物代謝能力的強(qiáng)弱排序來看，老熟窖泥＞老化窖泥＞新窖泥，而三類窖泥在氨基酸代謝能力方面的差異則不大，說明不同性質(zhì)的窖泥中以糖類為底物代謝產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的差異可能會更大，因此在窖泥的質(zhì)量改善或窖泥微生物強(qiáng)化時(shí)需要更多地關(guān)注碳水化合物代謝相關(guān)菌群。

通過KEGG直系同源基因簇（KEGG orthologous groups，KO）注釋可以獲得更詳細(xì)的代謝功能信息，KO是KEGG數(shù)據(jù)中最小的分類，它對應(yīng)代謝通路上各個(gè)具體的代謝反應(yīng)。對老熟、老化和新窖泥中相對豐度總量排名前50的KO進(jìn)行聚類分析并繪制相對豐度熱圖，結(jié)果見圖5。由圖5可知，老熟窖泥、老化窖泥、新窖泥的三個(gè)平行樣本各自聚為一類，這同樣證明了三種性狀窖泥在代謝功能上存在顯著差異。由圖5亦可知，三種窖泥中相對豐度排名前50的KO呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，其相對豐度都表現(xiàn)為老熟窖泥＞老化窖泥＞新窖泥，這再次證實(shí)了老熟窖泥的代謝能力最強(qiáng)，其次是老化窖泥，新窖泥則最弱。注釋到排名前50的KO多數(shù)是氨基酸代謝相關(guān)的酶（如K02035、K02030等）和糖代謝相關(guān)的酶（如K07024、K01834等），這也再次證實(shí)了窖泥細(xì)菌主要代謝碳水化合物和氨基酸的特征，而這兩類代謝是濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的主要來源，因此推測老熟窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成是最有利的。

圖5 PICRUSt預(yù)測的窖泥細(xì)菌群落KEGG直系同源基因簇豐度熱圖Fig. 5 Heat map of abundance of KEGG lineal homologous gene cluster of bacterial community in pit mud samples predicted by PICRUSt

3 結(jié)論

從宜賓地區(qū)新窖泥、老熟窖泥和老化窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)來看，三類窖泥存在顯著差異，這可能是三類窖泥所產(chǎn)濃香型白酒品質(zhì)和風(fēng)味存在顯著差異的重要原因。其中，老熟窖泥和老化窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更接近，它們的細(xì)菌群落豐富度高于新窖泥，新窖泥則表現(xiàn)為稀有物種更多，優(yōu)勢物種更突出。根據(jù)物種分類注釋，Caproiciproducens的豐度變化規(guī)律為老熟窖泥＞老化窖泥＞新窖泥，說明Caproiciproducens可能是該地區(qū)窖泥老熟的標(biāo)志，該菌對濃香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)形成具有重要的作用。乳酸桿菌屬（Lactobacillus）在新窖泥中高于老熟和老化窖泥，這可能是該地區(qū)新窖泥的標(biāo)志。通過三種性狀窖泥細(xì)菌群落的代謝功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)窖泥的代謝功能最強(qiáng)，其中碳水化合物代謝和氨基酸代謝的相對豐度最大，且同樣呈現(xiàn)出老熟窖泥＞老化窖泥＞新窖泥的豐度變化規(guī)律，這兩類代謝是濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的主要來源，說明老熟窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成是最有利的。