張澤錕，閆 勇，郭 靜，胡青平

（山西師范大學 生命科學學院，山西 太原 030031）

汾河是黃河的第二大支流，其受煤礦開采和工業(yè)排放等的影響，水體污染比較嚴重，尤其是氨氮（NH4+-N）含量過高，富營養(yǎng)化嚴重，加上水體自身的自凈能力較差，河流的生態(tài)環(huán)境面臨著嚴重威脅[1-2]。目前，氨氮的去除方法主要包括物理法、化學法和生物（微生物）法等[3-5]，其中微生物法應用于污水氨氮去除已成為目前的研究熱點[6-7]。但硝化細菌為自養(yǎng)好氧型微生物，反硝化細菌為異養(yǎng)厭氧型微生物，因此，硝化、反硝化過程無法同步進行[8]。近年來，部分學者聚焦研究一種新型的氨氮去除微生物—異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌，如副球菌（Paracoccusdavis）、貪銅菌（Cupriavidus）、芽孢桿菌（Bacillus）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、假單胞菌（Pseudomonadaceae）等細菌都具有好的異養(yǎng)硝化—好氧反硝化功能[9-12]，該類菌解決了傳統(tǒng)生物模式下硝化、反硝化過程不能在同一時空內(nèi)進行的問題，無疑擁有巨大的潛力。

目前研究發(fā)現(xiàn)，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌降解氨氮的途徑主要有兩種，第一種是NH4+-N氧化為NH2OH后，再經(jīng)NO3--N、NO2--N兩種中間產(chǎn)物，最后經(jīng)反硝化作用生成N2的主要途徑；另一種是NH4+-N氧化為NH2OH后直接經(jīng)反硝化作用生成N2的候補途徑[13]。其中，氨單加氧酶（ammonia monooxygenase，Amo）可以將NH4+-N氧化為NH2OH，這是兩種代謝過程的共同途徑，在第一種途徑中，還有硝酸鹽還原酶（nitrate and periplasmic nitrate reductases，Nap）和亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase，Nir）在異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的過程中發(fā)揮著關鍵作用。Nap可將NO3--N還原為NO2--N，Nir可將NO2--N還原為NO[14-15]?？梢姡煌木N資源會選擇不同的氨氮降解途徑，且菌種資源開發(fā)仍較少，尤其是立足于汾河土著微生物的菌種資源開發(fā)更少。

因此，本研究聚焦汾河土著微生物，采用選擇性培養(yǎng)基從汾河底泥中分離篩選具有氨氮降解功能的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，對其氨氮的降解過程進行初步研究，以期為土著微生物的菌種資源開發(fā)及其在汾河污水氨氮去除中的應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

底泥樣品：取自汾河，取樣位置在臨汾市堯都區(qū)沙橋村汾河壩附近（111°29'24"E，36°4'17"N）。

1.1.2 化學試劑

丁二酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀、三羥甲基氨基甲烷（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉、酒石酸鉀鈉、氨基磺酸、對氨基苯磺酰胺（均為分析純）：天津市光復精細化工研究所；鹽酸、磷酸、體積分數(shù)50%戊二醛、無水乙醇（均為分析純）：洛陽市化學試劑廠；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、亞硝酸鈉、納氏試劑、鹽酸萘乙二胺（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（通用型）、1×TSE101金牌mix、瓊脂糖、DNA凝膠回收試劑盒、DL5 000 DNA Marker：北京擎科生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[16]：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL，pH7.0。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中添加瓊脂粉18 g。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基[17]：丁二酸鈉4.052 g、硫酸銨0.472 g、維氏溶液50 mL、蒸餾水950 mL，pH7.0。異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉18 g。

好氧反硝化培養(yǎng)基[17]：硝酸鉀0.72 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1 g、丁二酸鈉2.8 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.0。好氧反硝化固體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉18 g。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-SⅡ型全自動高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；T6新世紀紫外可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；YHZ-98AB數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；Z36HK高速冷凍離心機：德國賀默公司；JSM-7500F冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡：日本株式會社；2720 thermal cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；JY300C電泳儀、JY04S-3C凝膠成像儀：北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株的分離及篩選

初篩：取10 g底泥樣品加入100 mL無菌水（含有玻璃球）中，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)1 h。取2 mL底泥懸液加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下擴大培養(yǎng)24 h。取2 mL菌懸液加入異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下富集培養(yǎng)24 h，重復3次，然后對菌懸液進行梯度稀釋并涂布至好氧反硝化固體培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出單菌落，挑選不同形態(tài)的菌株，在好氧反硝化固體培養(yǎng)基上反復劃線純化，將初步分離篩選獲得的菌株4 ℃保存。

復篩：將初步分離篩選得到的菌株分別接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下擴大培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后將菌液在5 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，用無菌水洗滌重懸，重復3次，將菌液的OD600nm值調(diào)至0.8，分別接入異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基和好氧反硝化培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中NH4+-N和NO3--N的含量，并計算降解率，其計算公式如下：

式中：C0為NH4+-N或NO3--N的初始含量，mg/L；C終為發(fā)酵后發(fā)酵液中NH4+-N或NO3--N的含量，mg/L。

1.3.2 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株的鑒定

形態(tài)觀察：菌株經(jīng)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后，參考王永剛等[18]的方法制備掃描電鏡樣品，使用掃描電鏡觀察菌株個體形態(tài)，并觀察菌株群體形態(tài)。對菌株進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察結(jié)果。

生理生化試驗：參考《伯杰氏手冊》對菌株進行氧化酶、接觸酶、糖類利用等生理生化實驗[19]。

分子生物學鑒定：使用通用型DNA提取試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，采用通用引物對27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴增16S rDNA基因序列。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托西安擎科生物科技有限公司進行測序。將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索對比，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA7軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌種分類定位。

1.3.3 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株生長曲線測定及氨氮降解動態(tài)監(jiān)測

將篩選菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min條件下活化并培養(yǎng)至對數(shù)期（12 h）后，5 000 r/min離心10 min，棄上清，用無菌水重懸，重復3次，調(diào)節(jié)OD600nm值至0.8，以2%（V/V）的接種量接種至100 mL異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min下培養(yǎng)，每2 h取樣，采用分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值）[20]，同時分別使用納氏試劑分光光度法、紫外分光光度法、N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測定NH4+-N、NO3--N、NO2--N的含量[21]，以發(fā)酵液中NH4+-N、NO3--N、NO2--N的含量變化來檢測氨氮的降解動態(tài)過程。

1.3.4 關鍵酶基因的PCR擴增

參考楊壘等[22-23]的方法合成Amo、Nap、Nir 3種關鍵酶基因的PCR擴增引物，Amo基因的引物為amoA-1F（5'-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3'）/amoA-2R（5'-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3'），Nap基因的引物為Nap-1F（5'-TCTGGACCATGGGCTTCAACCA-3'）/Nap-2R（5'-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3'），Nir基因的引物為NirS-1F（5'-CCTAYTGGCCGCCRCART-3'）/NirS-6R（5'-CGTTGAACTTRCCGGT-3'），引物委托西安擎科生物科技有限公司合成。以培養(yǎng)至對數(shù)期篩選菌株的基因組DNA為模板對3種關鍵酶的基因進行PCR擴增。PCR擴增體系（50μL）：1×TSE101金牌mix 45 μL，上下游引物（10 pmol/L）各2 μL，純化菌液1 μL。PCR擴增條件：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.3.5 關鍵酶活性的測定

將篩選菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min條件下活化并培養(yǎng)至對數(shù)期（12 h）后，接種至異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，30℃、150r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)期（12 h），5000r/min條件下離心菌液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重懸菌體，重復3次，取重懸菌液，使用超聲波細胞粉碎機破碎菌體后，10 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清液為粗酶液。參考張峰峰等[24-25]的方法測定Amo、Nap、Nir酶活性。

酶活定義[26]：每分鐘催化1 μmol反應物所用的酶量定義為一個酶活單位（U），比酶活力定義[26]：每毫克蛋白質(zhì)所包含的酶活力單位定義為比酶活力（U/mg）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用鄧肯氏單因素方差分析，采用Excel 2019進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株的分離篩選

在底泥樣品中共分離篩選得到8株具有氨氮降解功能的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，其對NH4+-N和NO3--N的降解率見圖1。由圖1可知，8株菌株對NH4+-N均具有較強的降解能力，其中菌株ZH-2對NH4+-N的降解率最高，為83.13%，顯著高于其他7株菌（P＜0.05）。8株菌株對NO3--N的降解能力均相對較弱，降解率均＜20%，其中菌株ZH-2對NO3--N的降解率最高，為17.87%。8株菌株對NH4+-N的降解能力均高于對NO3--N的降解能力，推測可能是由于NH4+-N相較于NO3--N更容易被菌株利用，此外，碳源的用量也是限制菌株降解NO3--N的重要因素[27]。綜上，確定菌株ZH-2為優(yōu)良的具有氨氮降解功能的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌。

圖1 不同菌株對NH4+-N和NO3--N的降解率Fig. 1 Degradation rate of NH4+-N and NO3--N by different strains

2.2 菌株ZH-2的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株ZH-2的革蘭氏染色結(jié)果顯示該菌株為革蘭氏陰性菌，其個體及群體形態(tài)見圖2。由圖2a可知，菌株ZH-2的個體長度約為0.5 μm×（1.0～1.3）μm，形狀為短桿狀，無鞭毛。由圖2b可知，菌株ZH-2的菌落呈乳白色且不透明，表面光滑，邊緣平整。

圖2 菌株ZH-2的掃描電鏡（a）及菌落形態(tài)（b）Fig. 2 Scanning electron microscope (a) and colony morphology (b)of strain ZH-2

2.2.2 生理生化試驗

菌株ZH-2的生理生化試驗結(jié)果見表1。由表1可知，菌株ZH-2的氧化酶試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗和VP試驗結(jié)果均為陰性，不能利用檸檬酸鹽和明膠，而接觸酶試驗、淀粉水解試驗結(jié)果均為陽性，且能利用葡萄糖、乳糖、果糖。結(jié)合形態(tài)觀察，根據(jù)《伯杰氏手冊》初步鑒定菌株ZH-2為不動桿菌屬（Acinetobactersp.）。

表1 菌株ZH-2的生理生化試驗結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical tests of strain ZH-2

2.2.3 分子生物學鑒定

基于16S rDNA菌株ZH-2的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知，菌株ZH-2與醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）KF358257.1聚于一支，親緣關系最近，同源性達到99%。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株ZH-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain ZH-2 based on 16S rDNA gene sequence

綜上所述，結(jié)合菌株ZH-2的個體形態(tài)、群體形態(tài)、生理生化試驗結(jié)果和16S rDNA基因序列分析結(jié)果，最終將菌株ZH-2鑒定為醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）。

2.3 醋酸鈣不動桿菌ZH-2氨氮降解過程初探

2.3.1 醋酸鈣不動桿菌ZH-2生長曲線及氨氮降解的動態(tài)監(jiān)測

菌株ZH-2在24 h內(nèi)的生長曲線及氨氮降解過程見圖4。

由圖4可知，在整個發(fā)酵過程中，NH4+-N含量的變化與菌株ZH-2的生長量變化呈現(xiàn)出明顯的負相關關系。發(fā)酵0～6 h時，菌株ZH-2的生長處于延滯期，對NH4+-N的降解速率較慢，發(fā)酵6 h時，菌株ZH-2對NH4+-N的降解率僅為19.75%；發(fā)酵6～16 h時，菌株ZH-2的生長處于對數(shù)生長期，同時對NH4+-N的降解速率最快，發(fā)酵12 h時對NH4+-N的降解率達到71.14%，發(fā)酵16 h時菌株的生長量達到最高1.30；發(fā)酵16 h后，菌株ZH-2的生長處于平緩期，NH4+-N的含量也不再降低，最終NH4+-N的降解率達到82.77%。

圖4 醋酸鈣不動桿菌ZH-2的生長曲線（A）及氨氮降解過程（B,C）Fig. 4 Growth curve (A) and ammonia nitrogen degradation process(B,C) of Acinetobacter calcoaceticus ZH-2

由圖4亦可知，在A.calcoaceticusZH-2降解NH4+-N過程中監(jiān)測到了NO3--N和NO2--N兩種中間產(chǎn)物的存在。在NH4+-N開始降解后，NO3--N的含量開始上升，在整個NH4+-N降解過程中NO3--N含量基本保持在1.00～5.50 mg/L；同時，NO2--N含量基本保持在0.03～0.11 mg/L。結(jié)果表明，A.calcoaceticusZH-2對NH4+-N的降解過程中可能經(jīng)過了NO3--N和NO2--N兩種中間產(chǎn)物。

2.3.2 醋酸鈣不動桿菌ZH-2基因組中關鍵酶基因的檢測

A.calcoaceticusZH-2基因組中3種關鍵酶（Amo、Nap和Nir）基因的PCR擴增結(jié)果見圖5。由圖5可知，三種關鍵酶Amo、Nap和Nir基因的堿基長度分別為2 000 bp、900 bp、900 bp左右，與預期結(jié)果相符，說明PCR擴增成功，結(jié)果表明，菌株ZH-2基因組中含有氨氮降解過程中的3種關鍵酶（Amo、Nap和Nir）基因，與氨氮降解途徑中有NO3--N和NO2--N兩種中間產(chǎn)物存在的結(jié)果相符。

圖5 醋酸鈣不動桿菌ZH-2基因組中3種關鍵酶基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 5 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products of 3 key enzyme genes in Acinetobacter calcoaceticus ZH-2 genome

2.3.3 醋酸鈣不動桿菌ZH-2氨氮降解過程中關鍵酶活性的檢測

3種關鍵酶Amo、Nap和Nir的酶活見圖6。由圖6可知，醋酸鈣不動桿菌ZH-2降解氨氮過程中檢測到3種關鍵酶，其中，Amo的比酶活最高達45.69 mU/mg，顯著高于Nap（3.54 mU/mg）與Nir（6.91 mU/mg）（P＜0.05），魏冉[28]研究發(fā)現(xiàn)，在氨氮降解過程中，Amo作用的過程是降解過程的關鍵步驟，其首先將NH4+-N降解為NH2OH。本實驗結(jié)果表明，Amo在氨氮降解過程中發(fā)揮重要作用，其在對數(shù)生長期（12 h）的比酶活較高，這與圖4A中的結(jié)果一致，此時培養(yǎng)基中的NH4+-N被快速降解，降解率達到71.14%。

圖6 醋酸鈣不動桿菌ZH-2氨氮降解過程中3種關鍵酶酶活的測定結(jié)果Fig. 6 Determination results of 3 key enzymes activity during ammonia nitrogen degradation of Acinetobacter cinetobacter ZH-2

綜上，A.calcoaceticusZH-2的Amo基因被成功擴增，且具有較高的酶活，充分說明菌株ZH-2的氨氮降解過程中存在著由Amo催化的NH4+-N→NH2OH的通用途徑。Nap與Nir基因被成功擴增且具有一定的酶活，并在NH4+-N降解過程中監(jiān)測到了中間產(chǎn)物NO3--N和NO2--N，說明A.calcoaceticusZH-2降解氨氮過程中存在著由Nap催化的NO3--N→NO2--N與Nir催化的NO2--N→NO過程。因此，初步判定菌株ZH-2對氨氮的降解是先經(jīng)NO3--N和NO2--N等中間產(chǎn)物的硝化作用，再經(jīng)反硝化作用生成N2的經(jīng)典降解途徑。

3 結(jié)論

本研究從汾河底泥中篩選獲得一株具有氨氮降解功能的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株ZH-2，其對NH4+-N和NO3--N的降解率分別達到83.13%和17.87%；通過形態(tài)觀察、生理生化試驗和16S rDNA基因序列分析，鑒定該菌為醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）；通過對菌株ZH-2降解氨氮過程中中間產(chǎn)物的動態(tài)監(jiān)測、關鍵酶基因的擴增和酶活的測定，初步判定A.calcoaceticusZH-2降解氨氮的途徑可能為NH4+-N→NH2OH→NO2--N→NO3--N→NO2--N→NO→N2O→N2的經(jīng)典降解途徑。本研究可為A.calcoaceticusZH-2菌在汾河水的氨氮治理中奠定良好的理論基礎。