梁小東，湯 承，2，雷江英，沈凡鈺，陳德純，2

（1.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.動物醫(yī)學(xué)四川省高校重點實驗室，四川 成都 610041）

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶由天然發(fā)酵的方式制備，富含豐富的微生物菌群，由于西藏地區(qū)地勢海拔高、空氣稀薄，長期處于該環(huán)境下的菌種多具備獨特的生理機能[1]，而傳統(tǒng)發(fā)酵方式較好地保存了自然環(huán)境下的微生物，尤其是乳酸菌。乳酸菌（lactic acid bacteria）是一類利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的細菌總稱[2]，被公認(rèn)為安全性微生物[3]，種類多樣、數(shù)量龐大，具備拮抗病原菌、調(diào)節(jié)腸道微生物平衡等多種益生功能[4]。已有關(guān)于具備益生功能乳酸菌的研究報道，如黃堅等[5]從傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵酸奶中篩選出能提高動物生長性能和免疫功能的耐久腸球菌（Enterococcus durans）；董翎逸等[6]對益生性屎腸球菌（Enterococcus faecium）WEFA23和海氏腸球菌（Enterococcus hirae）WEHI01的荷葉發(fā)酵上清液進行抑菌及抗氧化性能評價；許英瑞等[7]以野生黑枸杞為原料，優(yōu)化超聲波提取黑枸杞多糖的工藝條件，研究黑枸杞多糖對嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）G2與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）L9生長特性的影響以及對2株乳酸菌抗氧化能力的影響。

細菌素是由乳酸菌核糖體合成的一類抑菌肽，具有無毒無害、高效抑菌性能、不易殘留、不產(chǎn)生抗性等特點受到廣泛關(guān)注[8]。細菌素可通過阻礙病原菌細胞壁的合成，形成質(zhì)膜孔道；還能阻止病原菌遺傳物質(zhì)的復(fù)制，以及蛋白質(zhì)的脂質(zhì)合成等方式對病原菌產(chǎn)生抑制作用[9]。細菌素主要由多肽或抗菌蛋白組成，不產(chǎn)生抗性，也是天然的防腐劑[10]。近年來，不合理的抗生素使用及耐藥基因的遺傳導(dǎo)致抗生素耐藥問題嚴(yán)重[11-13]，對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重影響，甚至危害人體健康，因此，尋找抗生素的替代品尤為重要，而細菌素可以成為未來抗生素最有效的替代品[14]。目前國內(nèi)外關(guān)于產(chǎn)細菌素乳酸菌的研究報道有很多，用產(chǎn)細菌素乳酸菌改善發(fā)酵食品的風(fēng)味和質(zhì)量[15]、抑制病原微生物[16-17]等，但關(guān)于牦牛源乳制品產(chǎn)細菌素乳酸菌的研究較少。

本研究采用含0.5%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基結(jié)合溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水（bromocresol purple glucose peptone water，BCP）培養(yǎng)基對來自青海海南藏族自治區(qū)、四川阿壩、甘孜理塘的傳統(tǒng)牦牛酸奶中的乳酸菌進行分離篩選，采用形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA序列分析對篩選菌株進行鑒定，并測定篩選菌株上清液對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）抑菌性能；考察篩選菌株上清液對蛋白酶的耐受性及對抗生素的敏感性，并確定細菌素種類。以期為細菌素的產(chǎn)品開發(fā)尋找安全有效的益生菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

傳統(tǒng)牦牛酸奶樣本：來自四川阿壩州紅原縣1份（編號為1#）、甘孜州理塘縣4份（編號為2#～5#）、青海海南藏族自治區(qū)2份（編號為6#～7#）。

金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922：由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室提供。

1.1.2 試劑

蛋白酶K（30 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（15 000 U/mg）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）標(biāo)記MarkerA、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、2×TaqPCR Master Mix及16S引物：上海生工生物工程股份有限公司；慶大霉素、米諾環(huán)素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林藥敏紙片：杭州微生物試劑有限公司；鹽酸（1 mol/L）、氫氧化鈉（2 mol/L）、過氧化氫酶（5 000 U/mg）、DNA提取液、10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、氯化鈉：索萊寶生物科技有限公司。本實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

BCP培養(yǎng)基、莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽MRS肉湯培養(yǎng)基、莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽MRS固體培養(yǎng)基：上海生工生物工程股份有限公司；水解酪蛋白（mueller hinton，MH）培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基：青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQLY-180S 振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；DYY-3C型電泳儀：北京六一儀器廠；TGL-16K醫(yī)用離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；NAnoDROP ONE超微量核酸蛋白測定儀、VeritiTM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）核酸擴增儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；UV-6100紫外可見分光光度儀：上海儀電分析儀器有限公司；FR-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)：上海復(fù)日科技有限公司；牛津杯（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm）：成都諾舟生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

取1 mL酸奶樣品于9 mL的無菌水中，振蕩混合均勻，按照10倍系列梯度稀釋。分別吸取0.3 mL乳酸菌數(shù)為104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL的樣品涂布于含0.5%CaCO3的MRS培養(yǎng)基[18]，在37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。挑選具有溶鈣圈的菌落，再分別挑選不同菌落形態(tài)的單菌落涂布于含溴甲酚紫的BCP培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑選能使BCP培養(yǎng)基顏色由紫變黃的菌落[19]，且在MRS培養(yǎng)基上劃線、培養(yǎng)，反復(fù)純化，得到單個菌落。將純化的單菌落用甘油保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.3.2 產(chǎn)細菌素乳酸菌的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察

將篩選菌株的單菌落接種于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，采用革蘭氏染液進行染色并進行顯微鏡觀察，根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》對乳酸菌進行菌落及細胞形態(tài)觀察。

（2）分子生物學(xué)鑒定

DNA的提?。和ㄟ^酚-氯仿法提取具有抑菌活性的菌株DNA，用超微量核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度和純度，以A260nm/A280nm＞1.8和A260nm/A230nm＞2.0為判定標(biāo)準(zhǔn)。

PCR擴增：以提取的菌株DNA為模板，選擇16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增體系為：DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix10 μL，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補齊20 μL，PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；70 ℃再延伸5 min。

瓊脂糖凝膠電泳：使用濃度為2%的瓊脂糖凝膠，以1×TAE緩沖液為電泳介質(zhì)對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。電泳條件：電壓120 V，電流200 mA，時間25 min[20]。選擇目標(biāo)條帶產(chǎn)物分子質(zhì)量大小在1 500 bp的樣品送擎科生物有限公司雙向測序，測序結(jié)果選用軟件SeqMan 6.0進行序列拼接，并剪去多余的片段，將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）中的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行局部比對基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，利用MEGA 11軟件的鄰接（neighbor-joining，NJ）法bootstrap method值為1 000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株種屬關(guān)系。

1.3.3 產(chǎn)細菌素乳酸菌抑菌活性的測定

篩選菌株發(fā)酵上清液制備：挑選篩選菌株的單個菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)24 h后，得到菌株種子液。采用高速冷凍離心機于10 000 r/min、4 ℃離心15 min獲得上清液。用0.22 μm一次性無菌過濾器除去上清液中的菌體及其他雜質(zhì)之后保存?zhèn)溆肹21]。

質(zhì)控菌株菌懸液的制備：吸取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌凍存菌液，TSB培養(yǎng)基傳2～3代，使菌液活性得到恢復(fù)，然后按1%的比例重新接種TSB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)6 h，調(diào)整菌懸液OD600nm值為0.5，備用。

抑菌性能測定：采用牛津杯法[22]抑菌試驗篩選菌株發(fā)酵上清液的抑菌能力，檢測平板選用NA培養(yǎng)基。

1.3.4 有機酸和過氧化氫排除實驗

通過pH計測定各產(chǎn)細菌素菌株無細胞培養(yǎng)液的pH，將上清液pH值用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)到6.0[23]，并且滴加過氧化氫酶進行處理，37 ℃水浴2 h，以同樣pH值的MRS肉湯培養(yǎng)基進行對比。質(zhì)控菌株選用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌做牛津杯抑菌試驗[24]。

1.3.5 細菌素對蛋白酶的耐受性

取3份等量的上清液，用氫氧化鈉和鹽酸將上清液的pH值調(diào)到蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶的最適pH值，分別為7.6、7.6、3.0，將各蛋白酶用無菌水溶解成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的母液，等體積加入發(fā)酵上清液中[25]，37 ℃水浴孵育1 h后，使蛋白酶失活。以未處理的上清液為對照，將pH值調(diào)至6.0，采用牛津杯法做抑菌試驗[26]。

1.3.6 抗生素敏感性實驗

采用K-B紙片法檢測篩選菌株對常見抗生素的敏感性[27]，根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（clinical and laboratory shandards institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判斷受試菌株氨芐西林等7種抗菌藥物的藥敏性[28]。將方法1.3.3篩選菌株的種子液按1%（V/V）的比例接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。取0.1 mL菌懸液接種于TSB培養(yǎng)基中，200 r/min恒溫搖床振蕩6 h后，采用無菌水將菌懸液濃度校正為0.5麥?zhǔn)媳葷岫?。用一次性無菌棉簽蘸取混合均勻的菌懸液，均勻涂布于MH培養(yǎng)基，待表面菌液稍稍干燥，藥敏片依次貼于培養(yǎng)基表面，每個平皿平均分4個區(qū)域，于各中間位置放置，并輕按藥敏片，使藥敏片與培養(yǎng)基之間不留空隙，單層放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，測量抑菌圈直徑[29]，記錄結(jié)果。

1.3.7 細菌素基因的確定

按照1.3.2的方法提取篩選菌株的DNA，參考王曉蕊等[30]的方法設(shè)計目的基因引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成腸球菌素相關(guān)的9種引物，具體引物設(shè)計見表1。以提取的DNA為模板，對目的基因進行PCR擴增，擴增體系為模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix10 μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補齊20 μL，PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度見表1，退火30 s，70 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；70 ℃再延伸5 min，所得PCR產(chǎn)物用3.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 腸球菌素相關(guān)引物設(shè)計Table 1 Design of enterococcin related primers

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察

從7份傳統(tǒng)牦牛酸奶樣品中共分離得到6株有明顯溶鈣圈的菌株，將分離自四川阿壩樣本的菌株分別命名為菌株A1、A2，分離自甘孜理塘樣本的菌株命名為G1、G2、G3和G4，代表菌株G3的菌落及細胞形態(tài)見圖1。

圖1 代表菌株G3的菌落形態(tài)（A）及細胞形態(tài)（B）（×1 000）Fig. 1 Colony (A) and cell morphology (B) of representative strain G3(×1 000)

由圖1可知，菌株形態(tài)為凸起、邊緣整齊的乳白色的單菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌體細胞呈圓形或橢圓形，單個、成對或短鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌。

2.2 篩選菌株的分子生物學(xué)鑒定

6株菌株的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產(chǎn)物目的條帶清晰，堿基長度約為1 500 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖2 篩選菌株的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 Agarose electrophoresis results of PCR amplification products of screened strains

6株乳酸菌的16S rRNA基因測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，比對結(jié)果見表2。

表2 不同菌株的16S rRNA基因序列比對結(jié)果Table 2 Comparison results of 16S rRNA gene sequences of different strains

由表2可知，菌株A1和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的同源性達98.0%，菌株A2和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的同源性達99.0%，菌株G1～G4和屎腸球菌（Enterococcus faecium）的同源性均達99.0%。應(yīng)用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 基于16S rRNA基因序列菌株A1～A2（A）與G1～G4（B）的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain A1-A2 (A) and G1-G4 (B) based on 16S rRNA gene sequence

由圖3可知，菌株A1～A2與嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）親緣關(guān)系最近；菌株G1～G4屎腸球菌（Enterococcus faecium）親緣關(guān)系較近。根據(jù)不同菌株的菌落特征、顯微鏡觀察特征、16S rRNA基因序列分析結(jié)果，將菌株A1～A2鑒定為嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），菌株G1～G4鑒定為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。

2.3 產(chǎn)細菌素乳酸菌抑菌活性的測定

產(chǎn)細菌素乳酸菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性的測定結(jié)果見表3。由表3可知，菌株A1、A2、G1、G2、G3、G4對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，且抑菌圈直徑均≥13 mm。

表3 產(chǎn)細菌素乳酸菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性的測定結(jié)果Table 3 Determination results of antibacterial activity of bacteriocinproducing lactic acid bacteria against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.4 有機酸和過氧化氫抑菌排除試驗

對不同菌株進行排除酸和H2O2試驗后觀察菌株的抑菌活性，結(jié)果見表4。

表4 有機酸和H2O2的抑菌排除試驗結(jié)果Table 4 Results of bacteriostatic exclusion test of organic acid and H2O2

由表4可知，只有菌株G3對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑菌活性，且牛津杯抑菌圈直徑＞20 mm，其原因可能是，發(fā)酵液中除了這兩種物質(zhì)，還有其他物質(zhì)可以抑制菌株的生長。根據(jù)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的飼料添加劑品種目錄顯示，屎腸球菌是被批準(zhǔn)適用于養(yǎng)殖動物的一種添加劑，其可以抑制腸道病原微生物，還能促進畜禽的生長發(fā)育[31-32]。王永等[33]的研究表明，在飼料中添加屎腸球菌對仔豬生長性能有明顯改善，并且能夠維持腸道菌群平衡，顯著增強仔豬免疫力。此外黃怡等[34]的研究表明，給予哺乳仔豬屎腸球菌可以明顯改善腸道菌群構(gòu)成，促進腸道的健康。

2.5 蛋白酶耐受性

菌株G3發(fā)酵上清液分別用蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解，通過觀察抑菌圈直徑，考察發(fā)酵上清液對蛋白酶的耐受性，結(jié)果見圖4。由圖4可知，發(fā)酵液經(jīng)3種蛋白酶水解后抑菌圈完全喪失，表明菌株G3發(fā)酵液中起主要抑菌活性的物質(zhì)為蛋白類，初步判斷為細菌素。

圖4 不同蛋白酶對抑菌物質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of different protease on antibacterial material

2.6 產(chǎn)細菌素乳酸菌的藥物敏感性

對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和菌株G3的抗生素敏感性進行測定，結(jié)果見表5。由表5可知，菌株G3對抗生素氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟霉素、氯霉素均表現(xiàn)出敏感性。

表5 抗生素敏感實驗結(jié)果Table 5 Results of antibiotic sensitivity tests mm

2.7 菌株G3細菌素基因的鑒定

由圖5可知，菌株G3細菌素以ENTP和ENTA為引物的PCR產(chǎn)物大小在100～150 bp之間，與該引物擴增目的片段大小基本相符，所以，初步確定菌株G3產(chǎn)細菌素基因為腸球菌素A和腸球菌素P。

圖5 產(chǎn)細菌素乳酸菌G3的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 5 Electrophoretic results of PCR amplification products of bacteriocin-producing lactic acid bacteria G3

3 結(jié)論

本研究從來自青海海南藏族自治區(qū)、四川阿壩、甘孜理塘的傳統(tǒng)牦牛酸奶中篩選得到6株產(chǎn)細菌素乳酸菌，根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定，鑒定菌株A1～A2為嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、菌株G1～G4屎腸球菌（Enterococcus faecium）；6株菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均＞15 mm。經(jīng)過排除酸、H2O2，僅菌株G3發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌仍具有較強的抑菌活性（抑菌圈直徑＞20 mm）；經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解，表現(xiàn)為不耐受。因此，菌株G3中起到抑菌作用的物質(zhì)為蛋白質(zhì)或者多肽類；對常見抗生素敏感；初步確定為腸球菌素A和腸球菌素P，是一株可以產(chǎn)細菌素的益生菌候選菌株。