高 榮，鄭志國，鮑時(shí)翔，莫坤聯(lián)，黃惠琴

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

褐藻膠裂解酶是制備生物活性寡糖的重要工具酶，可通過β-消除反應(yīng)將褐藻酸鈉降解為在非還原端具有雙鍵的不飽和寡糖，在食品、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等行業(yè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。根據(jù)底物特異性，褐藻膠裂解酶可分為聚古羅糖醛酸（polyguluronic acid，polyG）嵌段特異性裂解酶、聚甘露糖醛酸（polymannuronic acid，polyM）嵌段特異性裂解酶及兩種嵌段都可裂解的雙功能裂解酶[3]。迄今為止，已經(jīng)從海洋生物（藻類、軟體動(dòng)物、細(xì)菌和真菌）、陸生細(xì)菌和一些病毒中鑒定出多種褐藻膠裂解酶[4]，其中海洋細(xì)菌是褐藻膠裂解酶的重要來源，如弧菌[5]、黃桿菌[6]、交替單胞菌[7]、微泡菌[8]、芽孢桿菌[9]等。但是，由于現(xiàn)有微生物產(chǎn)酶量少、酶活低，限制了其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用，尋找新的高效產(chǎn)酶菌、深入研究酶的產(chǎn)生條件、提高菌株發(fā)酵酶活力是迫切需要解決的問題。

誘變是提高微生物發(fā)酵產(chǎn)酶水平的有效方法之一，已成為微生物誘變育種的重要技術(shù)。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變是一種基于大氣環(huán)境溫度和射頻等離子體的新型微生物誘變育種技術(shù)，可在大氣壓和室溫（25～40 ℃）條件下高效誘導(dǎo)脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）斷鏈[10-11]，具有條件溫和、成本低、效率高的特點(diǎn)，成為微生物基因組的高效快速誘變育種技術(shù)，近幾年在工業(yè)菌種育種中得到了廣泛成功的應(yīng)用[12-13]。CHENG G等[14]通過ARTP誘變成功選育高產(chǎn)L-精氨酸菌株；ZHANG C等[15]通過ARTP誘變成功選育高產(chǎn)木糖醇酵母菌；林楊等[16]針對(duì)蛋白酶活性高而產(chǎn)酸能力較弱的德氏乳植桿菌保加利亞亞種菌株，采用ARTP誘變技術(shù)獲得一株蛋白酶活性穩(wěn)定且高產(chǎn)酸的菌株Y8-6。

本研究從南海海域海藻、動(dòng)物及沉積物樣品中分離篩選產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株，并以高產(chǎn)褐藻膠裂解酶篩選菌株為出發(fā)菌株，利用ARTP誘變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行誘變處理，通過平板初篩及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩獲得高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的突變菌株，為褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)提供新的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

海藻、動(dòng)物及沉積物樣品：采集于我國海南島周邊及西沙海域。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、Ladder Marker、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）擴(kuò)增引物，褐藻酸鈉（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；2216E瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：英國Oxoid公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：添加0.05%褐藻酸鈉的2216E瓊脂培養(yǎng)基。

檢測(cè)培養(yǎng)基：褐藻酸鈉5.0 g/L，（NH4）2SO45.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：褐藻酸鈉5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，NaCl 20.0 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：褐藻酸鈉7.0 g/L，胰蛋白胨12.0 g/L，NaCl 30.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g/L，K2HPO40.1 g/L，pH 7.0。

上述培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP-Ⅱ常溫常壓等離子體誘變儀：無錫思清源生物科技有限公司；SP-756 PC紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；ZHWY-2112B恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制備有限公司；5804R冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長曲線分析儀：芬蘭Oy Growth Curves Ab公司；SPECTRA MAX 190酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；TP600 PCR儀：日本專業(yè)儀器制造廠；DYY-12D電泳儀：北京六一儀器廠；Tanon4100全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像儀：上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌的分離

分別取海藻、動(dòng)物胃腸道及沉積物樣品各10 g，磨碎，加入90 mL滅菌海水，在30 ℃、200 r/min條件下振蕩30 min，吸取上清液，梯度稀釋，涂布于細(xì)菌分離培養(yǎng)基用于分離普通細(xì)菌。另取上述梯度稀釋液（100～10-2），80 ℃水浴處理15 min后，涂布于細(xì)菌分離培養(yǎng)基用于分離產(chǎn)芽孢細(xì)菌。將平板置于30 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d后，根據(jù)菌落表型不同進(jìn)行劃線純化。

1.3.2 產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選

初篩：采用平板酶解圈法[17]。挑取單菌落點(diǎn)接于檢測(cè)培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d，加入適量1 mol/L CaCl2覆蓋平板，靜置20～40 min顯色，有透明圈或暈圈的為陽性菌株。測(cè)量菌株酶解圈直徑，選取酶解圈直徑＞20 mm的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩：將初篩得到的高產(chǎn)酶菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r/min、30 ℃培養(yǎng)36 h，離心收集上清液，采用紫外吸收法[18]測(cè)定其酶活。取1.8 mL底物（3.0 g褐藻酸鈉溶于1 L 50 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液）40 ℃預(yù)熱5 min，加入0.2 mL待測(cè)樣品，40 ℃溫浴10 min，以滅活的酶液體系為空白對(duì)照。100 ℃加熱10 min滅活混合反應(yīng)體系，測(cè)定在波長235 nm處的吸光度值（OD235nm值）。

褐藻膠裂解酶酶活定義：在上述測(cè)定方法下，定義OD235nm值每分鐘增加0.01的酶量為酶的一個(gè)活力單位（U/mL）。

1.3.3 篩選菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA。利用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F和1492R進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：雙蒸水（ddH2O）20.0 μL，引物27F和1492R各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，模板3 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，48 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、7 min[19]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫（https：//www.ezbiocloud.net/identify）中與已知的模式菌株序列進(jìn)行16S rDNA同源性比對(duì)分析[20]，鑒定菌株的種屬關(guān)系，并利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

1.3.4 篩選菌株的ARTP誘變選育

生長曲線測(cè)定：挑取篩選菌株純化培養(yǎng)后的單菌落接種于種子培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.5，用種子液培養(yǎng)基稀釋1 000倍形成最終體系，點(diǎn)樣于96孔板，設(shè)3個(gè)平行處理。將96孔板置于高通量微生物生長分析儀，設(shè)置培養(yǎng)溫度為30 ℃、每小時(shí)測(cè)定一次OD600nm值、共48 h，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用軟件GraphPad Prism V8.0.2繪制生長曲線。

菌懸液的制備：從平板上挑取活化后的單菌落接種于種子培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min搖瓶振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，取1 mL菌懸液離心并用生理鹽水洗滌一次，調(diào)整OD600nm值在0.6～0.8之間，最終配制成甘油含量為5%的菌懸液。

ARTP誘變：在無菌條件下吸取配制好的細(xì)菌懸液10 μL均勻涂布于無菌金屬載片表面，將金屬載片轉(zhuǎn)移至ARTP誘變儀對(duì)應(yīng)凹槽，以氦氣（He）作為工作氣體，電源功率120 W，照射距離2 mm，氣流量10 L/min，誘變時(shí)間分別為0、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、80 s、100 s，誘變后分別將載片放入含有1 mL生理鹽水的離心管中振蕩，取各照射劑量的菌懸液稀釋涂板，于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，以未經(jīng)ARTP處理的菌懸液作對(duì)照。通過菌落數(shù)計(jì)算致死率[22]，其計(jì)算公式如下：

一般而言，當(dāng)致死率在90%左右時(shí)，菌株發(fā)生高產(chǎn)突變的概率較高，且在此突變率下的回復(fù)性更小，因此采用致死率90%的條件對(duì)細(xì)菌進(jìn)行誘變[23-24]。

1.3.5 高產(chǎn)褐藻膠裂解酶誘變菌株的篩選

參考1.3.2中的平板酶解圈法[17]對(duì)誘變菌株進(jìn)行初篩，測(cè)量酶解圈的直徑，以原始菌株作對(duì)照，酶解圈變大則為正突變。對(duì)酶解圈明顯變大的菌株，采用紫外吸收法[18]測(cè)定酶活力進(jìn)行復(fù)篩，篩選出高產(chǎn)褐藻膠裂解酶誘變菌株。

1.3.6 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性分析

誘變得到的高產(chǎn)菌株在添加0.05%褐藻酸鈉的2216E瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)6次，測(cè)定酶活力大小，檢測(cè)誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的分離與篩選

將樣品在分離培養(yǎng)基上挑取細(xì)菌菌落進(jìn)行劃線純化，經(jīng)平板酶解圈法[17]篩選獲得產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株共131株，部分菌株酶解圈直徑結(jié)果見圖1。

圖1 部分篩選菌株酶解圈直徑Fig. 1 Enzymatic circle diameters of some screened strains

由圖1可知，在CaCl2的浸潤下，未被降解的褐藻酸鈉形成不透明白色背景，而被降解的褐藻酸鈉形成透明酶解圈（白環(huán)）或白色暈圈（PloyM被裂解酶裂解后，剩余的PloyG與CaCl2結(jié)合生成白色凝膠，顯現(xiàn)為白色暈圈）[17]，酶解圈直徑＞20 mm的菌株有14株。

按1.3.2的方法對(duì)14株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株進(jìn)行發(fā)酵，離心、收集上清液作為粗酶液，采用紫外吸收法測(cè)定酶活力，結(jié)果見表1。由表1可知，分離于海南文昌海域褐藻的菌株HB172198T，發(fā)酵36 h時(shí)酶活為135.0 U/mL。菌株HB171871、IB203801和IB203800酶活力較高，均＞170 U/mL。

表1 14株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的酶活測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of enzyme activities of 14 strains of high yield alginate lyase

2.2 產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌通用引物27F-1492R，對(duì)14株高產(chǎn)酶菌株進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增、測(cè)序與比對(duì)分析，高產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株鑒定結(jié)果見表2。由表2可知，它們隸屬于3個(gè)門、5個(gè)綱、7個(gè)目、8個(gè)科、9個(gè)屬。在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）10株，其中α-變形菌綱3株（IB192996、IB204138、IB204140）、γ-變形菌綱7株（HB161653、HB161718、HB171871、IB203800、IB203801、IB204810、IB204811）；其次是厚壁菌門（Firmicutes）（HB172198T、IB20480）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（IB203985、IB204192）各2株，各占14.3%。在屬水平上，弧菌屬（Vibrio）最多（5株）（HB161653、HB171871、IB203800、IB203801、IB204811），占35.7%；其次是交替單胞菌屬（Alteromonas）2株（HB161718、IB204810），占14.3%；類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）（HB172198）、海洋赤桿菌屬（Pelagerythrobacter）（IB192996）、黃桿菌屬（Flavobacterium）（IB203985）、拉布倫茨氏菌（Labrenzia）（IB204138）、袁其鵬屬（Qipengyuania）（IB204140）、粉色桿狀菌屬（Roseivirga）（IB204192）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（IB204808）各1株。酶活力高的菌株HB171871、IB203801和IB203800均為弧菌屬（Vibrio）細(xì)菌。

表2 14株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of 14 strains of high yield alginate lyase

以16S rDNA相似度閾值98.65%為判斷標(biāo)準(zhǔn)[25]，有5株菌（HB161653、HB171871、HB172198T、IB203985和IB204192）與其同源性最高的模式菌株的相似性＜98.65%（占35.7%），初步鑒定為新的分類單元，基于16S rDNA的14株菌株與其同源性最高模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列14株產(chǎn)酶細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of 14 enzyme-producing bacteria based on 16S rDNA gene sequence

由圖2可知，分離菌株均與同源性最高菌株聚在同一分支。由此可見，在南海生境中，產(chǎn)褐藻膠裂解酶細(xì)菌資源非常豐富，蘊(yùn)含著眾多新的微生物等待被挖掘。此外，已利用細(xì)菌多相分類的方法，鑒定菌株HB172198T為類芽孢桿菌屬的一株新種，命名為海藻類芽孢桿菌（Paenibacillus algicolasp.nov.）[26]。

2.3 產(chǎn)酶菌株HB172198T的ARTP誘變

在14株褐藻膠裂解酶活性高的菌株中，菌株HB172198T的活性不是最高的，但鑒于芽孢桿菌產(chǎn)生內(nèi)生孢子，抵抗外界環(huán)境能力強(qiáng)，且能產(chǎn)生多種胞外酶，具有更為廣闊的應(yīng)用前景[27]。同時(shí)菌株HB172198T是海洋中不可多得的能夠產(chǎn)生褐藻膠裂解酶的芽孢桿菌新種，因此，選擇菌株HB172198T進(jìn)行等離子體誘變選育。

2.3.1 菌株HB172198T生長曲線測(cè)定

對(duì)數(shù)生長期細(xì)菌代謝旺盛，比生長速率最大，微生物誘變應(yīng)選擇對(duì)數(shù)生長期的菌株。菌株HB172198T的生長曲線如圖3所示，菌株HB172198T培養(yǎng)0～15 h區(qū)間處于遲緩期，培養(yǎng)15～25 h區(qū)間處于對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)25～35 h區(qū)間處于平穩(wěn)期。當(dāng)菌株HB172198T培養(yǎng)22 h時(shí)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期后期，此階段細(xì)胞生長繁殖旺盛，選用此時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行等離子體照射。

圖3 菌株HB172198T生長曲線Fig. 3 Growth curve of strain HB172198T

2.3.2 ARTP誘變菌株HB172198T致死曲線測(cè)定

致死率是誘變實(shí)驗(yàn)中的重要參考數(shù)據(jù)。菌株HB172198T在ARTP誘變中的致死率曲線如圖4所示，致死率隨誘變時(shí)間的增加不斷升高。處理時(shí)長＜10 s時(shí)致死率較低，20～40 s期間致死率急速增長，從31.6%增長到82.8%，50 s時(shí)致死率達(dá)91.5%，當(dāng)ARTP處理100 s時(shí)菌體全部死亡。根據(jù)前人的研究報(bào)道，菌株致死率為90%左右時(shí)正突變率最高[25]。因此，選擇菌株HB172198T的最適誘變時(shí)間為50 s。

圖4 ARTP誘變菌株HB172198T的致死率曲線Fig. 4 Fatality rate curve of ARTP mutated strain HB172198T

2.3.3 高產(chǎn)褐藻膠裂解酶突變株篩選

選取原始菌株HB172198T作為對(duì)照，比較酶解圈直徑大小初步確定正向突變菌株，該方法操作簡便、實(shí)驗(yàn)周期短并且具有直觀性[19]。誘變菌株篩選結(jié)果見圖5。由圖5可知，原始菌株HB172198T酶解圈直徑為2.0 cm，以酶解圈明顯增大的誘變菌作為目標(biāo)菌株，通過初篩共得到16株正向突變菌株，分別編號(hào)為7、70-29、50-22、50-21、30-2、80-6、50-6、30-19、40-54、10-13、27、60-2、3、80-4、80-3和50-30。按1.3.2的方法對(duì)這16株誘變菌株進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，獲得2株酶活明顯提高的突變菌株，編號(hào)為30-19和80-6，其產(chǎn)褐藻膠裂解酶酶活分別為179.9 U/mL和165.0 U/mL，比原始菌株HB172198T酶活分別提高了32.6%和21.6%。

圖5 高產(chǎn)褐藻膠裂解酶突變菌株篩選結(jié)果Fig. 5 Screening results of mutant strains of high yield alginate lyase

2.3.4 高產(chǎn)褐藻膠裂解酶突變株30-19和80-6產(chǎn)酶穩(wěn)定性測(cè)定

對(duì)2株突變菌株30-19和80-6在分離培養(yǎng)基上連續(xù)進(jìn)行6代傳代培養(yǎng)，分別在30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，采用紫外吸收法測(cè)定酶活力，結(jié)果見圖6。由圖6可知，突變菌株30-19和80-6六代傳代的酶活力范圍分別保持在172.2～187.4 U/mL和155.8～172.0 U/mL區(qū)間，雖有小幅波動(dòng)，但總體來說具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

圖6 高產(chǎn)褐藻膠裂解酶突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 6 Genetic stability tests results of mutant strains of high yield alginate lyase

3 結(jié)論

本研究從南海海域采集的樣品中共篩選得到高產(chǎn)褐藻膠裂解酶海洋細(xì)菌14株。經(jīng)16S rDNA比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株隸屬于3個(gè)門、5個(gè)綱、7個(gè)目、8個(gè)科、9個(gè)屬，其中來源于弧菌屬的菌株最多（5株），占35.7%，并有5株菌可能代表著新的分類單元。由此可見，海洋細(xì)菌是褐藻膠裂解酶的重要來源，南海生境中產(chǎn)酶細(xì)菌資源多樣性非常豐富，并存在著大量的未知資源有待于被挖掘。

新產(chǎn)酶菌種Paenibacillus algicolaHB172198T的初始酶活力為135.0 U/mL，為進(jìn)一步提高其酶活力，開展了ARTP誘變選育，篩選得到突變株30-19和80-6，其產(chǎn)褐藻膠裂解酶的酶活分別為179.9 U/mL和165.0 U/mL，比出發(fā)菌株酶活力分別提高32.6%和21.6%，并通過傳代6次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其良好的產(chǎn)酶穩(wěn)定性。本研究可為產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選和ARTP誘變選育提供參考。雖然ARTP誘變育種能提高菌株的產(chǎn)酶量，但突變效果最佳的菌株30-19酶活相比原始菌株只提高了32.6%，產(chǎn)酶量與酶活力還不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因而進(jìn)一步挖掘環(huán)境中存在的新型高效褐藻膠降解菌、優(yōu)化酶的產(chǎn)生條件、構(gòu)建高效產(chǎn)酶工程菌是迫切需要解決的問題。