江 威，王路瑤，張宗杰，林 斌，唐 潔，李 群，朱麗萍，楊 強，陳申習(xí)

（1.勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶 435100；2.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435000）

乳酸菌作為發(fā)酵中常見的微生物，可以產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如有機酸類和酶類（葡萄糖苷酶、酯酶和蛋白酶等），在酶類作用下，有機酸與醇類進一步生成酯類物質(zhì)[1]。除乳酸外，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）可產(chǎn)乙酸；植物乳桿菌、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）和類布氏乳桿菌（Lactobacillus parabuchneri）可產(chǎn)丁酸[2]。乳酸在掩蓋酒精的刺激性的同時還能使酒體協(xié)調(diào)柔和，乙酸則具有爽口微甜的特征，適量乙酸可提升白酒口感[3-4]。此外，乳酸菌還可產(chǎn)生一定的醇類、醛類、酮類、吡嗪類、芳香族類和烷烴類化合物等白酒呈香、呈味物質(zhì)[5-7]。

呂錫斌等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌作為優(yōu)勢細菌貫穿了醬香型白酒下沙、造沙堆積發(fā)酵、窖內(nèi)發(fā)酵過程。堆積發(fā)酵過程中，類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和面包乳桿菌（Lacto bacillus panis）占比高達80%以上。窖內(nèi)發(fā)酵結(jié)束，面包乳桿菌、乳桿菌屬和耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）占比達到90%。王暉等[5]從白酒窖泥中分離到短乳桿菌、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和鉛黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）。熊亞等[9]利用微生物菌群多樣性分析技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE），發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬和耐酸乳桿菌屬為濃香型白酒窖泥中的優(yōu)勢種群。喬宗偉[10]研究發(fā)現(xiàn)，耐酸乳桿菌是糟醅發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌。張松等[11]從濃醬兼香型不同輪次的酒醅中分離到布氏乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、乳酸片球菌和戊糖片球菌。乳酸菌也是米香型小曲白酒中主要的細菌，主要有食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、巴黎鏈球菌（Streptococcus lutetiensis）和卡氏腸球菌（Enterococcus casseliflavus）[12]。乳酸菌在清香型白酒發(fā)酵過程中也發(fā)揮著重要作用，是發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌株。劉雪婷等[13]從酒醅中分離得到乳酸片球菌、副干酪乳桿菌、短乳桿菌、希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）和糞腸球菌。陳申習(xí)等[14]從清香型小曲酒機械化釀造車間發(fā)酵過程中的酒醅中分離鑒定到干酪乳桿菌、短乳桿菌、希式乳桿菌和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）。李銳等[15]從清香型小曲酒醅中分離到植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、短乳桿菌、戊糖片球菌、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、布氏乳桿菌和類布氏乳桿菌共7種乳桿菌。PANG X N等[16]研究發(fā)現(xiàn)，耐酸乳桿菌能夠促進乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙醇、乙酸和2,4-二叔丁基苯酚的形成，感官分析顯示用希氏乳桿菌和耐酸乳桿菌發(fā)酵的樣品更和諧，植物乳桿菌發(fā)酵的樣品具有更高的酯香味。除此之外，乳酸菌在釀造過程中還具有抑制腐敗微生物和雜菌的生長；維持釀酒環(huán)境的偏酸性，促進釀酒酶系的糖化與發(fā)酵能力等作用[17-19]。

白酒中乳酸菌資源豐富，目前，在白酒中強化乳酸菌研究十分有限，細菌強化進行發(fā)酵在黃酒和白醋應(yīng)用較多，劉彩霞等[20]利用強化乳酸菌有效降低了黃酒浸米過程中的生物胺含量；錢楨文等[21]強化乳酸菌釀造高酸黃酒用于調(diào)節(jié)黃酒酸度，提高黃酒產(chǎn)品品質(zhì)和安全水平；洪家麗等[22]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌均能促進黃酒釀造過程中酵母的生長，且都能顯著提高黃酒中有機酸含量；鄧永建等[23]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵可以改變麩皮浸出液中的有機酸組成；添加乳酸菌發(fā)酵的麩皮浸出液能夠增加液態(tài)發(fā)酵米醋中乳酸的質(zhì)量濃度，強化乳酸菌能增加米醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量，提升產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)。因此，在清香型小曲白酒中強化乳酸菌，將有可能提高產(chǎn)品中風(fēng)味物質(zhì)的含量，進而提升白酒質(zhì)量。本研究從不同季節(jié)的清香型小曲白酒酒醅中分離鑒定乳酸菌，研究不同季節(jié)酒醅中乳酸菌種類和數(shù)量的差異，篩選可用于提升乙酸乙酯、乳酸乙酯、降低雜醇油和正丙醇的乳酸菌，以期在今后可強化制曲用于車間生產(chǎn)，進一步提升清香型小曲白酒的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

夏季酒醅（8月，發(fā)酵周期14 d）、秋季酒醅（11月，發(fā)酵周期21 d）、冬季酒醅（1月，發(fā)酵周期16 d）和春季酒醅（4月，發(fā)酵周期14 d）：勁牌有限公司楓林酒廠釀造一車間；桂花曲：勁牌有限公司楓林制曲車間配制。

1.1.2 試劑

土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司；PremixTaq：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；正丙醇、乙酸乙酯等標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：中國醫(yī)藥集團有限公司；β-淀粉酶（50 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：無錫雪梅酶制劑科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：海博生物技術(shù)有限公司。

高粱汁培養(yǎng)基：高粱粉碎后按照高粱和水質(zhì)量比為1∶4的比例混勻，添加β-淀粉酶和糖化酶各10 g，60 ℃恒溫糖化24 h，過濾后調(diào)整糖度為8°Bx。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MBT11-10氣體采集袋：大連海德科技有限公司；QYC-200全溫空氣搖床：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；YXQLS-75S蒸汽滅菌鍋、SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；Agilent 7890A型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：美國安捷倫公司；YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱：上海皓莊儀器有限公司；HWS-250 J恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Biometra Tone 96G聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國耶拿公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌計數(shù)

分別對夏季、秋季、冬季和春季酒醅進行取樣。每個季節(jié)跟蹤相同發(fā)酵批次3個發(fā)酵槽車，取發(fā)酵0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d、9 d、11 d、14 d的酒醅各2份。在無菌條件下，取10 g發(fā)酵酒醅于裝有90 mL無菌生理鹽水中，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)30 min后取出進行梯度稀釋，取200 μL適宜梯度稀釋液置于空平板內(nèi)，傾注MRS固體培養(yǎng)基，凝固后于37 ℃厭氧培養(yǎng)1～2 d至單菌落長出，采用菌落記號方式對單菌落進行計數(shù)[24]。

1.3.2 乳酸菌的分離及形態(tài)觀察

將單菌落挑取劃線至MRS固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)1～2 d后待單菌落長出，觀察菌落形態(tài)[25-26]。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書提取乳酸菌的基因組DNA，以其為模板，采用細菌16S rRNA通用引物27F和1492R進行PCR擴增[27]，PCR擴增體系：PremixTaq15 μL，引物27F和引物1492R各0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）12 μL，DNA模板2 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測合格的PCR擴增產(chǎn)物送到武漢華大基因公司進行測序，將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對分析[28]，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 乳酸菌代謝產(chǎn)物分析

將分離純化后的乳酸菌單菌落分別接入含10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)16 h，制成乳酸菌種子液。將種子液按3%的接種量接種于糖度為8°Bx的高粱汁培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，采用針頭式濾器過濾后，采用氣相色譜檢測代謝物質(zhì)（乳酸、乙酸、丙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯）的含量[29]。

1.3.5 乳酸菌清香型白酒固態(tài)發(fā)酵小試

模擬清香型白酒發(fā)酵工藝[30]，稱取280 g糯高粱于65 ℃熱水中浸泡過夜，次日115 ℃蒸糧10 min后于開水中悶糧5 min，再111 ℃復(fù)蒸10 min。稱取熟糧1 kg，攤晾至30 ℃左右，對照組加入5.0 g桂花曲，實驗組加入等量桂花曲后再加入10 mL乳酸菌種子液，拌勻后于30 ℃糖化24 h。糖化完成后每500 g與滅菌后的500 g酒糟進行混合，放入密封袋，30 ℃發(fā)酵7 d后進行蒸酒，小火慢蒸，取前100 mL酒樣，測定出酒率[31]，同時采用氣相色譜檢測乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油、正丙醇含量[29]，并計算增減幅度，具體計算公式為：

1.3.6 乳酸菌麩皮種最佳添加比例、添加時間及固態(tài)發(fā)酵小試周期探究

實際生產(chǎn)中麩皮種相比液體種更加方便使用，因此，制備乳酸菌麩皮種，并應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵小試。乳酸菌麩皮種的制作：50 g麩皮滅菌，加入15 mL乳酸菌種子液，37 ℃培養(yǎng)24 h后于30 ℃烘干，檢測其中乳酸菌數(shù)量達到1×108CFU/g，備用。泡糧及糖化步驟同1.3.5，對照組僅加入5.0 g桂花曲，實驗組在添加5.0 g桂花曲的基礎(chǔ)上添加一定比例的麩皮種，糖化完成后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃發(fā)酵7 d，發(fā)酵完畢后取出酒醅蒸酒，并檢測各項指標(biāo)。

（1）乳酸菌麩皮種添加比例優(yōu)化

實驗組在添加5.0 g桂花曲的基礎(chǔ)上，再分別添加桂花曲質(zhì)量的5%、10%、20%、30%、40%的麩皮種。

（2）乳酸菌麩皮種不同添加時間及不同發(fā)酵周期探究

實驗組1中乳酸菌在糖化前添加，即糖化時加入5.0 g桂花曲以及1.0 g 乳酸菌麩皮種，發(fā)酵7 d；實驗組2中桂花曲糖化完成后加入1.0 g乳酸菌麩皮種，發(fā)酵7 d。以菌株X29為例，取入池時（第0天）、發(fā)酵第2、4、7天的酒醅樣品，適當(dāng)稀釋后涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基，進行酵母計數(shù)，傾注MRS固體培養(yǎng)基進行乳酸菌計數(shù)。延長發(fā)酵組為在實驗組1的基礎(chǔ)上，發(fā)酵12 d后再進行蒸酒，檢測各項指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)酒醅中乳酸菌數(shù)量的變化趨勢

為了解不同季節(jié)不同發(fā)酵時間點樣品中乳酸菌含量的變化，為后期取樣及菌株應(yīng)用提供指導(dǎo)，對不同節(jié)點取樣樣品中的乳酸菌進行計數(shù)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，四個季節(jié)酒醅中的乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵過程中生長趨勢較為一致，均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，其中夏季酒醅中的乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵后期高于其他三季。夏季酒醅中的乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵10 d左右達到峰值，秋季酒醅中的乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵18 d左右達到峰值，冬季和春季酒醅中的乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵5 d左右達到峰值。從乳酸菌數(shù)量的峰值看，夏季＞秋季＞春季＞冬季，說明乳酸菌數(shù)量和生長趨勢與所處季節(jié)（溫度）有較大的關(guān)系，數(shù)量表現(xiàn)為夏季及秋季乳酸菌數(shù)量高于冬季和春季的數(shù)量。

圖1 不同季節(jié)酒醅中乳酸菌數(shù)量的變化趨勢Fig. 1 Change trends of lactic acid bacteria number of fermented grains in different seasons

2.2 各季節(jié)酒醅中乳酸菌菌株的分離及鑒定

通過單菌落培養(yǎng)從各季節(jié)酒醅中共分離得到225株乳酸菌，通過形態(tài)觀察初步分為15種，15種乳酸菌的典型代表菌株的菌落形態(tài)見圖2，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，具體分離及鑒定結(jié)果見表1。

圖2 15種乳酸菌代表菌株的菌落形態(tài)Fig. 2 Colony morphologies of 15 representative lactic acid bacteria strains

由圖2、圖3及表1可知，分離得到的乳酸菌菌株歸屬于3個屬的15個種，分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、類布氏乳桿菌（Lactobacillus parabuchneri）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、納格里乳桿菌（Lactobacillus nagelii）、馬里乳桿菌（Lactobacillus mali）、類干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）、布氏乳桿菌（Lactobacil lus buchneri）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa）、斯比氏乳桿菌（Lactobacillus spicheri）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、美洲虎乳桿菌（Lactobacillus pantheris），其中夏、秋、冬三季酒醅中分離得到的乳酸菌種類略多于春季，各季節(jié)酒醅中植物乳桿菌占絕大多數(shù)，其他以短乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌居多。

圖3 基于16S rRNA基因序列15種乳酸菌代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of representative lactic acid bacteria strains based on 16S rRNA gene sequences

表1 不同季節(jié)酒醅中乳酸菌菌株的分離及鑒定結(jié)果Table 1 Isolation and identification results of lactic acid bacteria strains of fermented grains in different seasons

續(xù)表

2.3 乳酸菌主要代謝產(chǎn)物的分析

乳酸菌作為代謝酸類物質(zhì)的重要微生物，廣泛存在于白酒釀造中，是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物[8-15]。接種225株分離得到的乳酸菌菌株于高粱汁培養(yǎng)基中，分析主要代謝產(chǎn)物（乳酸、乙酸、丙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯）的含量，結(jié)果見圖4。

圖4 19株不同乳酸菌主要代謝產(chǎn)物含量分析結(jié)果Fig. 4 Analysis results of main metabolites content of 19 strains of different lactic acid bacteria

由圖4可知，植物乳桿菌X11、馬里乳桿菌X16、納格里乳桿菌X29、副干酪乳桿菌C11和植物乳桿菌C13產(chǎn)乳酸含量較高，達15 000 mg/L以上。菌株C11和X29產(chǎn)乙酸含量較高，達1 000 mg/L以上。部分菌株檢測到代謝產(chǎn)物丙酸，含量較少，均＜50 mg/L。有部分菌株檢測到少量的乙酸乙酯和乳酸乙酯，其中副干酪乳桿菌D5、腸膜明串珠菌X5、植物乳桿菌C23和X29代謝乙酸乙酯相對較多，植物乳桿菌C13和C15則代謝產(chǎn)生較多的乳酸乙酯。

根據(jù)國標(biāo)GB/T 10781.2—2006《清香型白酒標(biāo)準(zhǔn)》及實際生產(chǎn)經(jīng)驗，乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油、正丙醇對清香型白酒酒質(zhì)影響較大，乙酸乙酯和乳酸乙酯是主要的風(fēng)味物質(zhì)成分，尤其乙酸乙酯的含量影響白酒的分級[32]。根據(jù)代謝產(chǎn)物結(jié)果，為進一步篩選可應(yīng)用于清香型白酒中的乳酸菌，選取菌株C11、C13、C23、X9、X11、X16、X29、Q39、Q52、Q62、Q73、D5、D6共13株乳酸菌進行清香型白酒固態(tài)發(fā)酵小試，探究其對發(fā)酵質(zhì)量的影響。

2.4 乳酸菌清香型白酒固態(tài)發(fā)酵小試結(jié)果

雜醇油含量過高容易導(dǎo)致酒后“上頭”，其中正丙醇含量過高還能導(dǎo)致酒體辛辣，出酒率則是反應(yīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化是否完全的重要指標(biāo)[33]。因此，發(fā)酵后的原酒主要關(guān)注乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油、正丙醇、出酒率5項指標(biāo)，來分析乳酸菌的強化對酒質(zhì)的影響。乳酸菌添加對清香型白酒固態(tài)發(fā)酵小試酒樣質(zhì)量的影響見圖5。

圖5 不同乳酸菌添加對清香型白酒發(fā)酵主要指標(biāo)的影響Fig. 5 Effect of different addition of lactic acid bacteria on main indexes of light-flavor Baijiu fermentation

由圖5可知，所有乳酸菌的加入，都對乙酸乙酯的提升有一定的作用，部分乳酸菌的加入可在一定程度上提高乳酸乙酯含量，降低雜醇油以及正丙醇含量。此外，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌的加入對出酒率沒有較大負面影響。其中，菌株X29和X9的加入對乙酸乙酯、乳酸乙酯的提升幅度較大，對雜醇油和正丙醇的降低幅度較大，乙酸乙酯含量分別提升36.00%和38.03%，乳酸乙酯含量分別提升33.62%和32.14%，雜醇油含量分別降低24.23%和13.22%，正丙醇含量分別降低30.77%和17.84%。綜上，選擇布氏乳桿菌X9和納格里乳桿菌X29進行后續(xù)驗證實驗。

2.5 乳酸菌麩皮種在清香型白酒固態(tài)發(fā)酵應(yīng)用中的研究

2.5.1 乳酸菌麩皮種不同添加比例的探究

為探究篩選乳酸菌應(yīng)用于白酒釀造在酒曲中的最佳添加比例，以期為后續(xù)更大規(guī)模應(yīng)用提供參考，考察乳酸菌X9和X29麩皮種不同添加比例對固態(tài)發(fā)酵小試酒樣主要指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 乳酸菌強化麩皮種不同添加比例對固態(tài)發(fā)酵小試酒樣主要指標(biāo)的影響Fig. 6 Effect of different addition ratio of fortified bran seeds with lactic acid bacteria on main indexes of Baijiu samples with solid-state fermentation by small test

由圖6可知，乙酸乙酯含量隨兩株乳酸菌麩皮種添加量的增加呈先增加后降低的趨勢，其中，乳酸菌X9麩皮種添加量為30%時，乙酸乙酯含量提升17.74%，而乳酸菌X29麩皮種添加量為20%時，乙酸乙酯含量提升32.84%。乳酸乙酯提升量隨兩株乳酸菌麩皮種添加量的增加呈先增加后逐漸降低的趨勢，當(dāng)乳酸菌X29和X9麩皮種添加量為20%時，乳酸乙酯提升量最高，分別為36.44%和37.38%。乳酸菌X29和X9麩皮種的添加能在一定程度上降低正丙醇和雜醇油含量，且菌株X9降正丙醇及雜醇油效果優(yōu)于菌株X29。兩株菌對出酒率沒有明顯影響。綜合5項指標(biāo)，當(dāng)乳酸菌X29和X9麩皮種的添加量都為20%時，發(fā)酵效果綜合較好，為最佳添加比例，可分別提升乙酸乙酯含量32.84%和16.79%，提升乳酸乙酯含量37.38%和36.44%，另外，分別降低正丙醇含量2.61%和5.40%，降低雜醇油含量21.33%和26.71%。

2.5.2 乳酸菌麩皮種不同添加時間及發(fā)酵周期的探究

探究乳酸菌麩皮種不同添加時間及發(fā)酵周期對固態(tài)發(fā)酵小試酒樣主要指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7A可知，針對正丙醇和雜醇油含量，實驗組1＜實驗組2＜對照組，推測乳酸菌參與糖化可以較好的減少正丙醇和雜醇油的含量。針對乙酸乙酯含量，實驗組2的乙酸乙酯含量與對照組接近，但均低于實驗組1，說明糖化前添加乳酸菌可使乙酸乙酯含量得到大幅提高。針對出酒率，實驗組2＞實驗組1＞對照組，針對乳酸乙酯含量，實驗組1＞對照組。說明在糖化后加入乳酸菌則可以更顯著提升乳酸乙酯的含量以及提高出酒率。由圖7B可知，發(fā)酵12 d與發(fā)酵7 d相比，正丙醇含量略有上升，雜醇油無較大變化。延長發(fā)酵時長至12 d使乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量均有明顯提升。因此，延長發(fā)酵時間對正丙醇、雜醇油和出酒率影響不明顯，對乙酸乙酯和乳酸乙酯含量有提升作用。

圖7 乳酸菌X29和X9強化麩皮種不同添加時間（A）及發(fā)酵時間（B）對固態(tài)發(fā)酵小試酒樣主要指標(biāo)的影響Fig. 7 Effect of different addition time (A) and fermentation time (B)of fortified bran seeds with lactic acid bacteria X29 and X9 on main indexes of Baijiu samples with solid-state fermentation by small test

綜上，乳酸菌糖化前添加可顯著增加乙酸乙酯含量，并在一定程度上降低雜醇油和正丙醇含量。而糖化后加入乳酸菌能較大程度提高乳酸乙酯含量和出酒率。延長發(fā)酵時間至12 d可提升原酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量。

3 結(jié)論

從四個季節(jié)清香型小曲發(fā)酵酒醅中共分離鑒定得到3屬15種共計225株乳酸菌，經(jīng)高粱汁培養(yǎng)基初篩、固態(tài)發(fā)酵小試實驗復(fù)篩，得到兩株提升乙酸乙酯、乳酸乙酯含量和降低雜醇油、正丙醇含量效果較好的乳酸菌，分別為納格里乳桿菌X29和布氏乳桿菌X9，通過對兩株乳酸菌麩皮種與酒曲不同配比發(fā)酵優(yōu)化，確定乳酸菌麩皮種最佳添加量為20%，此時，酒樣中乙酸乙酯含量分別提升32.84%和16.79%，乳酸乙酯含量分別提升37.38%和36.44%，正丙醇含量分別降低2.61%和5.40%，雜醇油含量分別降低21.33%和26.71%。同時，在小試實驗中探究乳酸菌麩皮種添加時間發(fā)現(xiàn)，乳酸菌糖化前強化能在后期明顯提升酒體中乙酸乙酯含量，糖化后強化則可提升乳酸乙酯的含量，并提高出酒率。延長發(fā)酵時間至12 d對提升乙酸乙酯和乳酸乙酯也具有一定的作用。本研究對清香型小曲白酒四季發(fā)酵中的乳酸菌種類、數(shù)量、功能及其在酒曲發(fā)酵中作用進行了研究，為進一步挖掘乳酸菌在白酒釀造中的功能，提供了大量菌株資源。