王家東，李 暄，肖 云，曹 珊，余君偉，夏 婷，鄭 宇

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽 464000；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；3.寧夏中寧枸杞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755100）

枸杞（Lycium barbarum）是茄科、枸杞屬植物，富含多糖、類胡蘿卜素、多酚、生物堿等生物活性成分，為我國傳統(tǒng)的藥食同源水果，性甘味平，具有滋補肝腎、益精明目等功效[1]。乳酸菌是一類利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等風味物質(zhì)的革蘭氏陽性細菌，廣泛存在于泡菜、酵素等發(fā)酵食品中[2-3]。枸杞原漿經(jīng)乳酸菌發(fā)酵可以豐富產(chǎn)品的風味，同時乳酸菌發(fā)酵帶來的益生作用也提高了產(chǎn)品的保健價值[4]。枸杞發(fā)酵常用的乳酸菌菌種有植物乳植桿菌（Lac-tiplantibacillus plantarum）、發(fā)酵粘液乳桿菌（Limosilactobacillus fermentun）和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）等[5-7]，發(fā)酵過程可以產(chǎn)生乳酸等有機酸以及乙偶姻、2,3-丁二醇等風味物質(zhì)[8-9]，并且多種乳酸菌共同發(fā)酵，往往比單一菌株發(fā)酵的產(chǎn)品具有更加豐富、協(xié)調(diào)的風味[10-11]。

發(fā)酵過程乳酸菌的活菌數(shù)是分析與控制發(fā)酵過程的重要指標[12]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法是微生物檢測的“金標準”，但其存在操作繁瑣、檢測周期長、易受雜菌干擾，難以檢測“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but non-culturable，VBNC）”微生物的缺點，導(dǎo)致漏檢現(xiàn)象的發(fā)生[13-14]。此外，乳酸菌種類眾多，但常用的乳桿菌屬在菌落形態(tài)、顯微鏡下形狀以及代謝特征等方面非常接近，常規(guī)的平板計數(shù)和顯微鏡計數(shù)等方法并不能有效地區(qū)分不同種屬的乳桿菌。目前較為常用的宏基因組高通量測序等方法[15-19]，由于檢測周期長、測序分析費用高等，不適合發(fā)酵過程乳酸菌的快速檢測。熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（fluorescent quantitative-polymerase chain reaction，fqPCR）是一種在脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）擴增反應(yīng)中，以熒光強度表示每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，可實現(xiàn)特征序列的快速分析檢測[20]。利用該方法能夠簡便、快速地對多種發(fā)酵產(chǎn)品中的乳酸菌進行準確定量，如發(fā)酵乳中的植物乳植桿菌（L.plantarum）[21]，發(fā)酵物料中的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）[22]，發(fā)酵面團中的舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）[23]，以及葡萄酒中的乳酸菌[24]。但是，由于乳酸菌發(fā)酵過程酸度逐漸增加，容易導(dǎo)致微生物細胞膜的損傷甚至死亡，會影響微生物濃度與多樣性檢測的準確性[25-27]。細胞死亡后DNA分子能保留較長時間，常規(guī)的fqPCR技術(shù)，容易受到樣品中的“死亡微生物”的影響，易造成假陽性結(jié)果。疊氮溴化丙錠（propidiummonoazide，PMA）是一種光反應(yīng)的DNA結(jié)合染料，可被活的微生物完整的細胞膜阻止在外，但能滲入膜損傷細胞并插入雙鏈DNA內(nèi)，與DNA反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價交聯(lián)沉淀物，可抑制后續(xù)DNA擴增，從而排除死亡微生物的干擾，準確定量活細菌[14，28]。韓之皓等[29]采用PMA處理結(jié)合fqPCR方法建立了一種準確檢測發(fā)酵乳品中L.plantarum活菌數(shù)的方法，減少了死亡微生物的干擾。利用該方法還可以分析檢測山西老陳醋發(fā)酵過程不同種屬乳酸菌的活菌數(shù)，可以對發(fā)酵過程乳酸菌的濃度變化進行監(jiān)測[30]。

本研究以枸杞果汁為原料，植物乳植桿菌、發(fā)酵粘液乳桿菌和瑞士乳桿菌為混合菌種進行發(fā)酵。為實現(xiàn)枸杞果汁發(fā)酵過程中主要乳酸菌的快速檢測，對可修復(fù)乳酸菌細胞膜損傷的修復(fù)液的組成及修復(fù)溫度進行優(yōu)化，以期使亞致死性損傷的乳酸菌細胞進行修復(fù)，提高方法的準確性，并分別針對植物乳植桿菌、發(fā)酵粘液乳桿菌和瑞士乳桿菌設(shè)計特異性引物，利用PMA-fqPCR方法，實時定量檢測枸杞果汁發(fā)酵過程中不同乳酸菌活菌數(shù)，建立枸杞果汁發(fā)酵過程主要乳酸菌的實時定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

寧夏中寧枸杞原漿：寧夏中寧枸杞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院。植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）AF1-9、發(fā)酵粘液乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）AF4-5、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）AF1-5：保存于天津科技大學(xué)微生物菌種保藏管理中心。pMD-18T載體、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細胞：大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 引物

利用DNAMAN軟件（V 8.0）分別比對分析美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫中L.plantarumWCFS1、L.fermentumIFO 3956、L.helveticusCNRZ32的乳酸脫氫酶基因序列，設(shè)計特異性引物，見表1。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in the study

1.1.3 化學(xué)試劑

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、疊氮溴化丙錠（PMA）：北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒：TIANGEN生化科技（北京）有限公司；高效感受態(tài)細胞制備試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：大連寶生物公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，無水乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，調(diào)節(jié)pH為6.2～6.8，115 ℃滅菌20 min。

減量肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/L，牛肉浸出粉0.3 g/L，氯化鈉0.5 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；TMTime PCR System熒光定量PCR儀：美國Applied Biosystems公司；Mastercycler基因擴增儀、D30微量核酸蛋白濃度測定儀：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

分別將乳酸菌AF1-9、AF4-5、AF1-5斜面培養(yǎng)物在MRS液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，OD600nm值≈0.8時，以1%（V/V）的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)2次作為種子液。

1.3.2 枸杞果汁的發(fā)酵

將活化后的乳酸菌AF1-9、AF4-5、AF1-5種子液在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，將3株乳酸菌的種子液分別以1%（V/V）的接種量接入枸杞原漿中，37 ℃靜置培養(yǎng)，每12 h振蕩混勻10 min，即得枸杞汁發(fā)酵果汁。

1.3.3 亞致死乳酸菌修復(fù)條件的優(yōu)化

亞致死乳酸菌修復(fù)液成分：減量肉湯培養(yǎng)基＋外源物。外源物包括：吐溫80（0.05%、0.1%、0.15%）、丙酮酸鈉（0.05%、0.09%、0.13%）、過氧化氫酶（0.01%、0.04%、0.07%）、MgCl2（1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L）、Na2HPO4（0.05 mmol/L、1mmol/L、2mmol/L）、MnCl2（1mmol/L、2mmol/L、4 mmol/L）、FeCl2（1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L）。

亞致死乳酸菌修復(fù)液組成的確定：乳酸菌種子液于6 000 r/min離心3 min后棄上清，沉淀用等體積無菌PBS緩沖液重懸，放入55 ℃的水浴鍋，水浴5 min，得到損傷菌，于6 000 r/min離心3 min后棄上清，沉淀用等量的修復(fù)液溶解，于37 ℃靜置培養(yǎng)15 min后進行PMA-fqPCR分析，統(tǒng)計結(jié)果并分析，每組實驗平行3次，確定最適的修復(fù)液組成。

亞致死乳酸菌修復(fù)溫度的確定：取適量損傷菌菌液于6 000 r/min離心3 min后棄上清，添加修復(fù)液（吐溫80 0.1 g/L、丙酮酸鈉0.09 g/L、過氧化氫酶0.04 g/L、MgCl23 mmol/L、Na2HPO41 mmol/L、MnCl22 mmol/L、FeCl22 mmol/L）后分別置于不同溫度（37 ℃、32 ℃、27 ℃、22 ℃）下，靜置培養(yǎng)15 min后進行PMA-fqPCR分析，統(tǒng)計結(jié)果并分析，每組實驗平行3次，得到最適修復(fù)溫度。

1.3.4 PMA-fqPCR檢測枸杞果汁發(fā)酵過程乳酸菌數(shù)量

質(zhì)粒DNA標準曲線的建立：分別采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株L.helveticus（AF1-5）、L.plantarum（AF1-9）、L.fermentum（AF4-5）的基因組DNA。如表1所示，分別以Lh-f和Lh-r為引物，L.helveticus的基因組DNA為模板，擴增特異性基因片段；以Lp-f和Lp-r為引物，L.plantarum的基因組DNA為模板，擴增特異性基因片段；以Lf-f和Lf-r為引物，L.fermentum的基因組DNA為模板，擴增特異性基因片段。PCR擴增體系及條件參照本實驗室方法進行[30]。將特異性基因片段連接到pMD-18T載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆菌落，經(jīng)過PCR及測序后提取質(zhì)粒DNA獲得質(zhì)粒標準品，測定質(zhì)粒標準品DNA的濃度并換算成基因拷貝數(shù)，標準品濃度的計算公式如下：

其中：c標為質(zhì)粒標準品濃度，拷貝數(shù)/μL；OD260nm值為由核酸濃度測定儀3次測定的平均值；A為換算系數(shù)0.05，即1個單位的OD260nm值=0.05 μg/（μLDNA）；N為稀釋倍數(shù)；6.02×1023為阿佛加德羅常數(shù)。

將獲得的質(zhì)粒標準品進行10倍梯度稀釋至1×1010～1×106拷貝數(shù)/μL的5個梯度，作為標準模板溶液進行熒光定量PCR反應(yīng)，以質(zhì)粒標準品濃度的對數(shù)（Y）作為縱坐標，以熒光定量PCR的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）（即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）為橫坐標（X），繪制質(zhì)粒DNA濃度標準曲線。

fqPCR擴增體系（20 μL）[30]：質(zhì)粒模板2 μL，熒光定量PCR上、下游引物（如表1所示）各0.4 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，加雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)；生成熔解曲線步驟為：95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)60 s，95 ℃反應(yīng)15 s。根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，系統(tǒng)將自動生成擴增曲線和熔解曲線，得到每個樣品的Ct值。

枸杞果汁發(fā)酵過程中乳酸菌的PMA-fqPCR檢測：取枸杞發(fā)酵液5 mL，在4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體，棄上清。菌體沉淀用等體積的修復(fù)液重懸，在27 ℃靜置培養(yǎng)15 min后4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。菌體沉淀用無菌PBS緩沖液重懸，加入疊氮溴化丙錠（PMA）至終質(zhì)量濃度為30 μg/mL，PMA與菌液充分混勻后在室溫條件下避光反應(yīng)10 min，之后將樣品置于冰上（避免過熱），在距離樣品20 cm處利用500 W的鹵素燈曝光20 min，曝光期間每隔5 min進行充分混勻。曝光交聯(lián)后菌體用無菌PBS緩沖液洗滌，然后在4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體，提取DNA進行fqPCR實驗[30]。根據(jù)標準品質(zhì)粒標準曲線回歸方程計算枸杞果汁發(fā)酵過程中的乳酸菌濃度。

1.3.5 分析檢測

總糖的測定按照GB/T 5099.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》?？偹岬臏y定按照GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》。

樣品中乳酸菌總數(shù)的測定：將樣品梯度稀釋，吸取0.1 mL稀釋液涂布于MRS培養(yǎng)基平板，正向放置30 min待液體被固體培養(yǎng)基吸收完全，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h。選擇菌落數(shù)在30～300之間的平板進行乳酸菌計數(shù)[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMA-fqPCR方法優(yōu)化

2.1.1 引物特異性驗證

分別以L.helveticusAF1-1、L.plantarumAF1-9、L.fermentumAF4-5的基因組為模板進行PCR擴增，驗證引物特異性。由圖1可知，根據(jù)L.helveticus、L.plantarum、L.fermentum中乳酸脫氫酶基因設(shè)計的特異性引物相互之間不存在干擾，具有較好的特異性。

圖1 引物特異性驗證結(jié)果Fig. 1 Verification results of the primers specificity

2.1.2 標準曲線回歸方程的建立

根據(jù)1.3.4所述實驗方法進行fqPCR定量檢測，每個濃度3個平行檢測，取平均Ct值，分別建立不同菌株活菌數(shù)對數(shù)值lg（CFU/mL）與Ct值的標準曲線回歸方程，結(jié)果見表2。由表2可知，所建立的標準曲線回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)達到0.99以上，均符合實時熒光定量PCR的定量要求，可對待檢測樣品濃度進行精確定量。

表2 不同菌株活菌數(shù)標準曲線回歸方程Table 2 Standard curves regression equation of viable bacterial counts of different strains

2.1.3 亞致死乳酸菌修復(fù)條件的優(yōu)化

乳酸菌是一類重要的微生物，在食品工業(yè)上常用作發(fā)酵劑及益生菌制品[4]。果汁發(fā)酵通常具有較高的糖度，發(fā)酵過程乳酸菌會代謝產(chǎn)生乳酸等有機酸導(dǎo)致pH降低，而高滲和高酸等條件會造成部分乳酸菌細胞膜和細胞殼損傷，形成亞致死狀態(tài)，影響了PMA-fqPCR方法的準確性[14]。通常情況下，亞致死乳酸菌的細胞膜損傷轉(zhuǎn)變是可逆的，合適的修復(fù)條件有助于亞致死乳酸菌的修復(fù)，有機物質(zhì)和礦化處理都有助于乳酸菌細胞膜和細胞殼的損傷修復(fù)。因此，在進行PMA-fqPCR時進行細胞修復(fù)，可以提高分析結(jié)果的準確性。本研究在減量肉湯培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加了吐溫80、丙酮酸鈉、過氧化氫酶、MgCl2、Na2HPO4、MnCl2、FeCl2等有機物和鹽類[22-23]，同時考察溫度對乳酸菌修復(fù)效果的影響，結(jié)果見表3。

表3 乳酸菌修復(fù)條件的優(yōu)化Table 3 Optimization of the repair conditions of lactic acid bacteria

由表3可知，試驗菌株分別在減量肉湯培養(yǎng)基添加吐溫80的濃度分別為0.05%、0.10%、0.15%時，乳酸菌的修復(fù)率呈先升高后下降的趨勢，吐溫80的濃度為0.10%時，修復(fù)率達到最大值，為62%；減量肉湯培養(yǎng)基添加丙酮酸鈉的濃度分別為0.05%、0.09%、0.13%時，乳酸菌的修復(fù)率呈先升高后下降的趨勢，當丙酮酸鈉的濃度為0.09%時，修復(fù)率達到最大值，為68%；減量肉湯培養(yǎng)基添加過氧化氫酶的濃度為0.01%、0.04%、0.07%時，乳酸菌的修復(fù)率呈先升高后下降的趨勢，當過氧化氫酶的濃度為0.04%時，修復(fù)率達到最大值，為61%；減量肉湯培養(yǎng)基添加MgCl2濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L時，乳酸菌的修復(fù)率呈先升高后下降的趨勢，當MgCl2的濃度為3 mmol/L時，修復(fù)率達到最大值，為67%；減量肉湯培養(yǎng)基添加Na2HPO4濃度為0.05 mmol/L、1.00 mmol/L、2.00 mmol/L時，乳酸菌的修復(fù)率呈先升高后下降的趨勢，當Na2HPO4的濃度為1.00 mmol/L時，修復(fù)率達到最大值，為61%；減量肉湯培養(yǎng)基添加MnCl2濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L時，乳酸菌的修復(fù)率呈先升高后下降的趨勢，當MnCl2的濃度為2 mmol/L時，修復(fù)率達到最大值，為79%；減量肉湯培養(yǎng)基添加FeCl2濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L時，乳酸菌的修復(fù)率呈先升高后下降的趨勢，當FeCl2的濃度為2 mmol/L時，修復(fù)率達到最大值，為68%；因此，確定最適的乳酸菌修復(fù)液組成為吐溫80 0.10%、丙酮酸鈉0.09%、過氧化氫酶0.04%、MgCl23 mmol/L、Na2HPO41.00 mmol/L、MnCl22 mmol/L和FeCl22 mmol/L；當溫度在22～27 ℃時乳酸菌的修復(fù)率呈先升高的趨勢，當溫度為27 ℃時，乳酸菌修復(fù)率達到最大值97%，當溫度＞27 ℃后，乳酸菌的修復(fù)率逐漸下降，因此，確定最佳修復(fù)溫度為27 ℃。

2.2 枸杞果汁發(fā)酵過程主要乳酸菌的實時檢測

利用植物乳植桿菌AF1-9、發(fā)酵粘液乳桿菌AF4-5和瑞士乳桿菌AF1-5進行枸杞果汁發(fā)酵，枸杞果汁發(fā)酵過程中總糖、總酸及活菌數(shù)的變化見圖2。

圖2 枸杞果汁發(fā)酵過程中總糖含量、總酸含量、微生物平板計數(shù)（A）及PMA-fqPCR計數(shù)（B）變化Fig. 2 Changes of total sugars contents,total acid contents,microbial plate counts (A) and PMA-fqPCR counts during wolfberry juice fermentation (B)

由圖2（A）可知，枸杞果汁發(fā)酵過程總糖含量快速降低，酸度和活菌數(shù)快速增加，說明乳酸菌快速生長，代謝糖類產(chǎn)生了乳酸等有機酸，發(fā)酵最終總酸含量為18.9 g/L，總糖含量為28.9 g/L，平板計數(shù)法檢測的總活菌數(shù)為7.94×108CFU/mL。該研究結(jié)果與他人結(jié)果一致[3-4，6]。由圖2（B）可知，隨著發(fā)酵時間的延長，采用PMA-fqPCR方法檢測的植物乳植桿菌AF1-9、發(fā)酵粘液乳桿菌AF4-5和瑞士乳桿菌AF1-5的活菌數(shù)逐漸增加，其中植物乳植桿菌AF1-9生長最快，當發(fā)酵時間為36 h時，活菌數(shù)達到最高值，發(fā)酵時間＞36 h時，活菌數(shù)下降。發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵粘液乳桿菌AF4-5、植物乳植桿菌AF1-9和瑞士乳桿菌AF1-5總活菌數(shù)分別為7.41×107CFU/mL、3.55×108CFU/mL和3.98×108CFU/mL。與平板計數(shù)法相比（圖2A），采用PMA-fqPCR方法（圖2B）菌體總濃度略高，可能是由于部分乳酸菌在修復(fù)培養(yǎng)的時候進行繁殖導(dǎo)致的。因此，PMA-fqPCR方法能夠?qū)崟r監(jiān)測發(fā)酵過程植物乳植桿菌、發(fā)酵粘液乳桿菌和瑞士乳桿菌的菌體濃度，有助于今后發(fā)酵工藝的優(yōu)化與產(chǎn)品品質(zhì)的控制。

3 結(jié)論

采用復(fù)合乳酸菌（植物乳植桿菌、發(fā)酵粘液乳桿菌、瑞士乳桿菌（1∶1∶1，V/V））進行枸杞果汁發(fā)酵，最優(yōu)的乳酸菌亞致死修復(fù)液的組成為：蛋白胨1 g/L，牛肉浸出粉0.3 g/L，氯化鈉0.5 g/L；吐溫80 0.1 g/L、丙酮酸鈉0.09 g/L、過氧化氫酶0.04 g/L、MgCl23 mmol/L、Na2HPO41 mmol/L、MnCl22 mmol/L、FeCl22 mmol/L。在27 ℃靜置培養(yǎng)15 min，乳酸菌亞致死細胞修復(fù)率達到97%。設(shè)計分別針對植物乳植桿菌、發(fā)酵粘液乳桿菌和瑞士乳桿菌的特異性引物，利用PMA-fqPCR方法，實現(xiàn)了發(fā)酵過程不同乳酸菌的實時熒光定量檢測，為今后復(fù)合乳酸菌發(fā)酵過程中的微生物的動態(tài)在線監(jiān)測提供了參考方法。