黃潤娜，侯建光，崔璐蕓，胡曉龍，劉延波，韓素娜*，李 華，王曉毅，劉 琳，付 蕊

（1.河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南 三門峽 472400；2.鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院（酒業(yè)學院），河南 鄭州 450046）

陶融型白酒是具有河南地域和仰韶文化特色的創(chuàng)新產(chǎn)品，以陶泥窖為發(fā)酵容器，其釀造工藝特點可概括為“三曲九糧、四陶九甑、深養(yǎng)兩藏、自成一格”。窖泥富含氮、磷、鉀、腐殖質(zhì)等重要成分，具有高含水量、低含氧量等特征[1-2]，可以為微生物的生長、繁殖提供營養(yǎng)。窖泥微生物經(jīng)過長期的馴化、變異，種類不斷豐富，形成了窖泥功能菌微生態(tài)菌群系[3-5]，是白酒釀造過程中重要的微生物來源，特別是厭氧菌群[6]。這些微生物群落可以代謝出影響白酒質(zhì)量的風味化合物[7-8]。

窖池退化是一個長期積累的過程，引起窖池老化的原因主要有酒醅酸度過高、窖泥配料不合理、窖泥發(fā)酵不平衡等，這些因素導(dǎo)致生成的乳酸鈣、乳酸亞鐵、乳酸銅和乳酸鎂等在窖壁上沉積[9]，影響白酒品質(zhì)[10-11]。目前，對窖泥的研究主要集中在濃香型白酒窖泥，包括對窖泥的感官評價、理化指標、微生物群落分析和應(yīng)用等方面的研究，而對窖池上、中、下、底層不同空間位置窖泥的微生物變化及其與理化指標關(guān)聯(lián)性的研究較少。余有貴等[12]通過對老化窖池與常規(guī)窖池窖泥的特性與發(fā)酵性能進行比較，發(fā)現(xiàn)老化窖池的窖泥因理化指標的變化，直接影響微生物的正常代謝，導(dǎo)致酒質(zhì)降低和產(chǎn)酒量下降；HU X L等[13]研究發(fā)現(xiàn)，隨著窖泥質(zhì)量的提高，梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和甲烷桿菌綱（Methanobacteria）等物種的豐富度及微生物群落多樣性顯著增加，pH、NH4+和有效磷水平相應(yīng)增加；王艷麗等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，退化窖泥中的鈣、鐵含量均高于正常窖泥和優(yōu)質(zhì)窖泥，乳酸桿菌（Lactobacillus）、芽孢桿菌（Bacillus）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）和諾卡氏菌屬（Nocardia）的相對含量低于正常窖泥；胡曉龍等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，隨著窖泥質(zhì)量的提高，微生物群落的香農(nóng)（Shannon）指數(shù)及Chao1指數(shù)顯著增加；羅雯等[18]研究發(fā)現(xiàn)，趨老熟、老熟窖泥中梭菌屬（Clostridium）為主要優(yōu)勢菌群，而新窖泥、趨老化窖泥、老化窖泥中，假單胞菌屬（Pseudomonas）為絕對優(yōu)勢菌屬。

目前，關(guān)于陶融型白酒窖泥的研究鮮有報道。解析陶融型白酒窖泥細菌群落結(jié)構(gòu)及其隨質(zhì)量、空間位置的變化規(guī)律，對陶融型白酒的生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。因此，本研究以陶融型白酒退化窖池和正常窖池上層、中層、下層及窖底窖泥為研究對象，采用高通量測序技術(shù)解析窖泥細菌群落多樣性和組成及其空間分布特征，并通過冗余分析（redundancy analysis，RDA）對影響細菌群落的理化因素進行了分析，以期闡明陶融型白酒窖泥微生物細菌菌群組成及其隨質(zhì)量及空間位置的變化特征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

窖泥樣品：陶融型白酒釀造車間。

1.1.2 試劑

酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、無水亞硫酸鈉、無水葡萄糖、氨水、抗壞血酸（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氯化鉀（均為分析純）：生工生物工程股份有限公司；硫酸、鹽酸（均為分析純）：洛陽昊華化學試劑有限公司；重鉻酸鉀（分析純）：洛陽市化學試劑廠；苯酚（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；氯化銨（分析純）：煙臺市雙雙化工有限公司；次氯酸鈉（分析純）：天津市津東天正精細化學試劑廠；酒石酸銻鉀、亞硝基鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；鉬酸銨（分析純）：天津亨鑫化工有限公司；氟化銨（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；硼酸（分析純）：天津市登科化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；2,4-二硝基酚（分析純）：上?；瘜W試劑有限公司；Magen HiPure Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit試劑盒：廣州美基生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV BlueStar A紫外分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；PB-10 pH計：德國Sartorius公司；MP200A精密電子天平：上海良豐儀器儀表有限公司；101-1電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DF-1集熱式恒溫磁力攪拌鍋：金壇市中大儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 窖泥樣品的采集

窖泥樣品均取自陶融型白酒釀造車間。根據(jù)退化窖池窖泥（黃色、酯香弱等）和正常窖池窖泥的感官特征（香氣正、手感細膩、帶有明顯酯香、酒香等）選取退化窖池（A）和正常窖池（B）[19]。隨機選取正常使用的3口退化窖池和3口正常窖池，每口窖池選取窖壁上層（位置1）、中層（位置2）、下層（位置3）及窖底（位置4）窖泥（圖1）；每層選取1個窖泥樣品，并將2類窖池相同位置的窖泥分別混勻作為該窖池的代表性樣品。即正常窖池、退化窖池各取4個代表樣品，即上層A1和B1、中層A2和B2、下層A3和B3和窖底A4和B4窖泥，共計8個窖泥樣品。將每份窖泥樣品分為2份于-20 ℃冰箱保存，1份用于高通量測序分析，1份用于理化性質(zhì)分析。

圖1 窖泥取樣位置Fig. 1 Sampling location of pit muds

1.3.2 理化指標的測定

含水量：參照李俊輝等[20]的烘干法測定；pH：參照李俊輝等[20]的電位法測定；總酸含量：采用酸堿中和滴定法測定[21]；銨態(tài)氮含量：采用靛酚藍比色法測定[22]；有效磷含量：參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1121.7—2014《土壤檢測第7部分：土壤有效磷的測定》測定。

1.3.3 窖泥宏基因組提取及Illumina Miseq高通量測序

利用Magen HiPure Soil DNA Kit試劑盒并參照說明書提取窖泥樣品的總DNA，采用Qubit 2.0熒光定量儀測定其濃度和純度。將合格的DNA委托北京百邁客生物科技有限公司完成建庫及Illumina MiSeq雙端測序。其中16S rDNA擴增子引物對為F（5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRV GAAT-3'）和R（5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3'），擴增區(qū)域為16S rDNA的V3-V4區(qū)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（v1.9.6）及Qiime（v1.9.1）軟件對高通量測序序列進行質(zhì)控，包括序列拼接，以及去除含有N的序列、引物和接頭、質(zhì)量值＜20的堿基、堿基長度＜200 bp的序列及嵌合體序列，得到有效序列。使用VSEARCH（v1.9.6）將有效序列進行聚類，將相似性≥97%的序列歸為1個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）?；贠TU分析結(jié)果，采用對樣本序列進行隨機抽平的方法，分別計算Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)等α-多樣性指數(shù)反映群落的物種豐度和多樣性?；讦?多樣性分析得到的4種距離矩陣，使用R語言工具進行主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）和非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析，進而完成不同樣品間細菌群落結(jié)構(gòu)的β-多樣性分析。采用軟件Canoco 5繪制RDA圖譜；采用Heml軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥樣品理化性質(zhì)的測定

不同窖泥理化指標的測定結(jié)果見表1和表2。

表1 退化窖池窖泥樣品理化指標的測定結(jié)果Table 1 Determination results of physical and chemical indexes of pit mud samples in degraded pit

由表1和表2可知，退化窖池窖泥含水量（36.78%）低于正常窖池窖泥含水量（38.24%）。分析原因可能是老化窖泥有些許板結(jié)，保水能力低于正常窖泥[12]。窖泥的pH值影響微生物的生長繁殖，能反映窖池發(fā)酵是否正常，將不同質(zhì)量窖泥區(qū)分開[13，15，23]。本研究中正常窖池的pH值（6.67）與劉梅等[19]研究得到的優(yōu)質(zhì)窖泥的pH值更接近于7的結(jié)論相符，高于退化窖池的窖泥pH值（5.50）。退化窖池窖壁泥的總酸含量（13.00 mg/g）明顯高于正常窖池窖壁泥（平均值0.60 mg/g）。退化窖池窖泥的銨態(tài)氮含量（23.48 mg/100 g）低于正常窖池窖泥（35.33 mg/100 g）；退化窖池窖泥的有效磷含量（27.32 mg/100 g）高于正常窖池窖泥（18.16 mg/100 g）。

表2 正常窖池窖泥樣品理化指標的測定結(jié)果Table 2 Determination results of physicochemical indexes of pit mud samples in normal pit

從空間位置來看，正常窖池窖泥和退化窖池窖泥下層的含水量要顯著高于其他位置（P＜0.05）；退化窖池窖底泥樣品A4中的pH值要顯著高于其他位置（P＜0.05），而正常窖池中層窖泥樣品B2中的pH值顯著高于其他位置（P＜0.05）；退化窖池窖底泥樣品A4中的總酸含量顯著低于其他位置（P＜0.05），而正常窖池窖泥與之相反（P＜0.05）；退化窖池中層窖泥樣品A2中的銨態(tài)氮含量顯著低于其他位置（P＜0.05），而正常窖池與之相反（P＜0.05）；退化窖池下層窖泥樣品A3中的有效磷含量顯著高于其他位置（P＜0.05），而正常窖池窖底泥樣品B3、B4中的有效磷含量顯著高于其他位置（P＜0.05）。結(jié)果表明，退化窖池窖泥的理化性質(zhì)發(fā)生了一定程度的變化。

2.2 窖泥樣品細菌群落α-多樣性分析結(jié)果

基于OTU數(shù)不同窖泥樣品的細菌群落的稀疏曲線及α-多樣性分析結(jié)果分別見圖2和表3。

表3 不同窖泥樣品細菌群落的α-多樣性分析結(jié)果Table 3 Analysis results of α-diversity of bacterial community in different pit mud samples

圖2 基于窖泥細菌群落OTU數(shù)的稀疏曲線Fig. 2 Rarefaction curve based on the number of OTUs of bacterial community in pit mud

由圖2可知，當測序深度＞10 000條之后，稀疏曲線進入平臺期。由于本研究測序深度（≥70 000條）遠大于10 000條，且由表3可知，覆蓋率均＞99%，說明本次測序深度可覆蓋樣品中絕大多數(shù)微生物信息。

由表3可知，退化窖池窖泥樣品中的OTU數(shù)在505～664個之間，Chao1指數(shù)在594.03～723.00之間，Shannon指數(shù)在2.97～8.41之間，而正常窖池的OTU數(shù)在456～589個之間，Chao1指數(shù)在573.79～651.66之間，Shannon指數(shù)在4.93～6.20之間。退化窖池各層窖泥的OTU數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均高于正常窖池窖泥；除樣品A2外，退化窖池各層窖泥的Shannon指數(shù)也高于正常窖池窖泥，這與郭壯等[15，24]的研究結(jié)果相似，說明窖泥經(jīng)過長時間的積累、退化后，其細菌菌群的多樣性和豐度均會顯著提升。隨著窖泥位置深度的增加，OTU數(shù)、ACE指數(shù)均呈下降趨勢。退化窖池窖泥與正常窖池窖泥都是上層（A1、B1）物種豐度（ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)）明顯高于其他位置，這可能是由于上層接觸空氣多，更利于環(huán)境微生物的吸附和生長。而退化窖池的窖泥樣品A2多樣性明顯低于其他位置，結(jié)合理化分析結(jié)果可知，中層窖泥可能退化更明顯。

2.3 窖泥樣品細菌群落β-多樣性分析結(jié)果

2.3.1 基于門水平窖泥樣品細菌群落組成

基于OTU注釋，所有窖泥樣品中共檢測到33個細菌門和1個古菌門（廣古菌門（Euryarchaeota）），不同窖泥樣品中的細菌菌群結(jié)構(gòu)見圖3。

由圖3可知，退化窖池窖泥中有7個優(yōu)勢細菌門（退化窖池窖泥樣品平均相對豐度＞1%），分別為厚壁菌門（Fir micutes）（64.32%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（12.58%）、變形菌門（Proteobacteria）（9.66%）、放線菌門（Actinobacteria）（2.90%）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）（2.52%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（2.11%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（1.33%）。正常窖池窖泥中有5個優(yōu)勢細菌門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）（67.14%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（26.40%）、變形菌門（Proteobacteria）（2.55%）、放線菌門（Actinobacteria）（1.35%）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）（1.29%）。與已報告的濃香型白酒窖泥中的優(yōu)勢細菌門種類相似[24-27]，但本研究中Actinobacteria和Synergistetes在陶融型白酒窖泥中的平均相對豐度略高。

圖3 基于門水平窖泥樣品細菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig. 3 Analysis results of bacterial community structure in pit mud samples based on phylum level

兩種窖池窖泥的共有優(yōu)勢細菌門為Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria、Synergistetes。退化窖池窖泥的Firmicutes和Bacteroidetes的平均相對豐度明顯低于正常窖池窖泥，而Proteobacteria、Actinobacteria、Synergistetes、Acidobacteria、Chloroflexi的平均相對豐度與之相反。由此可見，隨著窖泥質(zhì)量的提升，厚壁菌門所占比例有所增大，變形菌門所占比例有所下降，這與吳樹坤等[28]的研究結(jié)果一致。兩種窖池窖泥樣品的細菌群落中，都是Firmicutes占主導(dǎo)地位，這類細菌大多數(shù)能夠產(chǎn)生內(nèi)生孢子抵抗極端環(huán)境，與郭壯等[15，19]的研究結(jié)果一致。

從窖池空間位置分析，退化窖池窖泥在門水平上的細菌群落組成具有空間異質(zhì)性，其中Firmicutes（22.8%～90.6%）隨窖池深度的增加均呈先增加后下降的趨勢，樣品A1中相對豐度最低，由此可知，上層窖泥也有一定程度退化；而Bacteroidetes（4.8%～49.6%）變化規(guī)律與之相反，樣品A2中相對豐度最低，進一步說明中部窖泥可能退化較明顯。

2.3.2 基于屬水平窖泥樣品細菌群落組成

在屬水平，所有樣品中共檢測到480個可鑒定屬及未分類的屬，選取每個樣品中的優(yōu)勢細菌屬（相對豐度＞1%），共計59個屬進行菌群結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，退化窖池窖泥有9個優(yōu)勢細菌屬（退化窖池窖泥樣品平均相對豐度＞1%），分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）（21.24%）、嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）（6.60%）、氫孢菌屬（Hydrogenispora）（3.33%）、己酸菌屬（Caproicipro ducens）（3.03%）、氨基酸桿菌屬（Aminobacterium）（2.39%）、Syntrophaceticus（2.00%）、類香味菌屬（Myroides）（1.53%）、棒狀桿菌屬（Caldicoprobacter）（1.06%）、Fermentimonas（1.01%）；正常窖池窖泥有14個優(yōu)勢細菌屬，分別為嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）（18.85%）、己酸菌屬（Caproicipro-ducens）（11.89%）、佩特里單胞菌屬（Petrimonas）（6.23%）、消化鏈球菌屬（Sedimentibacter）（5.31%）、Tepidimicrobium（4.15%）、棒狀桿菌屬（Caldicoprobacter）（3.06%）、Lutispora（2.77%）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）（2.76%）、泰氏菌屬（Tissierella）（2.10%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（1.98%）、氫孢菌屬（Hydrogenispora）（1.70%）、氨基酸桿菌屬（Aminobacterium）（1.25%）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）（1.16%）、Christensenellaceae_R-7_group（1.03%）。

圖4 基于屬水平窖泥樣品細菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig. 4 Analysis results of bacterial community structure in pit mud samples based on genus level

兩種窖池窖泥的共有優(yōu)勢細菌屬為Lactobacillus、Proteiniphilum、Caproiciproducens、Hydrogenispora、Aminobacterium、Caldicoprobacter，從窖泥質(zhì)量來看，退化窖池窖泥中主要優(yōu)勢細菌屬（8個樣品中總平均相對豐度＞1%）乳桿菌屬、氨基酸桿菌屬、氫孢菌屬的平均相對豐度高于正常窖池窖泥，而己酸菌屬、嗜蛋白菌屬、棒狀桿菌屬的平均相對豐度低于正常窖池窖泥。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著窖泥質(zhì)量的提升，乳桿菌屬含量顯著減少，而己酸菌屬等核心屬的含量明顯增加；菌群變化表現(xiàn)為：以乳桿菌屬為單一優(yōu)勢屬逐漸過渡到以己酸菌屬為主，其他老熟窖泥指示菌如互營單胞菌屬、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）等的相對豐度逐漸增加[13，25，29]，這與本研究中窖泥群落的變化基本相符。

從空間位置上看，退化窖池窖泥中Lactobacillus在樣品A2中的相對豐度＞樣品A1＞樣品A3，其在樣品A4中不是優(yōu)勢細菌屬；Proteiniphilum在樣品A4中的相對豐度最高，在樣品A1中不是優(yōu)勢細菌屬；Caproiciproducens在樣品A3相對豐度最高，在樣品A1和A4中不是優(yōu)勢細菌屬；Aminobacterium在樣品A4中的相對豐度＞樣品A3＞樣品A2，分布較均勻，其在樣品A1中不是優(yōu)勢細菌屬。正常窖池窖泥中Lactobacillus只在樣品B1中是優(yōu)勢細菌屬；Caproiciproducens在4個樣品中都是優(yōu)勢細菌屬，在樣品中的相對豐度為樣品B3＞樣品B2＞樣品B1＞樣品B4；Proteiniphilum在樣品B4中的相對豐度最高，樣品B1＞樣品B2＞樣品B3；Petrimonas在樣品中的相對豐度為樣品B4＞樣品B1＞樣品B2＞樣品B3。由此可見，不同位置的窖泥樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，張明珠等[25，30-31]對濃香型白酒窖泥的研究也發(fā)現(xiàn)明顯的空間異質(zhì)性。

2.4 基于OTU不同窖池窖泥細菌群落結(jié)構(gòu)的聚類分析

進一步采用基于OTU數(shù)據(jù)計算所得的Jaccard距離的主坐標分析和非加權(quán)組UPGMA對窖泥樣品的β多樣性進行揭示，主坐標分析結(jié)果見圖5。

圖5 基于操作分類單元非加權(quán)Jaccard距離的主坐標分析Fig. 5 Principal coordinate analysis of OTUs based on unweighted Jaccard distance

由圖5可知，PC1的方差貢獻率為44.96%，PC2的方差貢獻率為18.63%，累計方差貢獻率為63.59%，說明這兩個主成分可以解釋63.59%的信息。正常窖池窖泥樣品分布在第一象限，而退化窖池窖泥樣品分布在二、三、四象限。由此可見，正常窖池窖泥和退化窖池窖泥樣品在空間排布上呈現(xiàn)出明顯的區(qū)分，說明這兩種窖泥細菌群落可能存在較大差異。為了對這一結(jié)果進行驗證，進一步采用UPGMA對兩種窖泥樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果見圖6。

圖6 基于操作分類單元非加權(quán)Jaccard距離的UPGMA聚類分析Fig. 6 UPGMA clustering analysis of OTUs based on unweighted Jaccard distance

由圖6可知，退化窖池窖泥樣品A1與其他位置的物種組成差異最大，樣品A2和A3物種組成最相似，與窖底泥有一定差異性；正常窖池窖泥樣品B1和B3物種組成最相似，與樣品B2和B4也有一定差異性。由此可見，兩種窖池窖泥樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)具有差異性，且同一窖池中的窖泥存在空間異質(zhì)性。

2.5 窖泥理化因子與主要優(yōu)勢細菌屬相對豐度的冗余分析

如前所述，空間位置及質(zhì)量對供試窖泥細菌群落的α-及β-多樣性有一定的影響，分析原因可能是，不同位置和不同質(zhì)量窖泥的理化性質(zhì)存在差異，是影響微生物群落多樣性改變的本質(zhì)因素[13]。因此，對窖泥樣品的理化性質(zhì)與主要優(yōu)勢細菌屬（8個樣品中總平均相對豐度＞1%）總平均相對豐度之間的相關(guān)性進行冗余分析，結(jié)果見圖7。圖中，箭頭的長度代表相關(guān)性的大小，中心點和窖泥菌群之間的連線與箭頭的夾角為銳角表示窖泥優(yōu)勢菌屬與相應(yīng)的理化因子呈正相關(guān)，鈍角表示負相關(guān)[32]。

圖7 窖泥理化因子與主要優(yōu)勢細菌屬平均相對豐度間的冗余分析結(jié)果Fig. 7 Redundancy analysis results between physicochemical factors and average relative abundance of main dominant bacterial genera of pit mud

由圖7可知，兩個主成分對兩者相關(guān)性的總解釋度為77.24%，且主要集中在Axis1軸上，可將正常窖池窖泥和退化窖池窖泥樣品較好的區(qū)分開，其中正常窖池窖泥樣品只分布在第四象限，退化窖池窖泥樣品主要分布在第四象限之外的位置。Axis2軸可以將退化窖池窖泥樣品的上部（A1、A2）和下部（A3、A4）區(qū)分開。但對主要優(yōu)勢細菌屬菌群結(jié)構(gòu)的影響是多個理化因子的綜合作用，如正常窖池窖泥樣品B1、B3、B4與pH值、含水量和有效磷含量呈正相關(guān)，樣品B2與pH值、含水量和銨態(tài)氮含量呈正相關(guān)；退化窖池窖泥中樣品A1與pH值、含水量和銨態(tài)氮含量呈負相關(guān)，樣品A2、A3和A4與總酸和有效磷含量呈正相關(guān)。條件限制性分析結(jié)果顯示，有效磷含量（40.5%）和總酸含量（28.5%）對主要細菌屬影響較大，然后依次為銨態(tài)氮含量（9.6%）＞pH值（8.2%）＞含水量（4.5%），且只有有效磷含量與主要優(yōu)勢細菌屬菌群結(jié)構(gòu)呈顯著相關(guān)（P＜0.05），其他因子均不具有顯著性（P＞0.05）。此外，有研究表明，總酸與退化窖泥或者新窖泥的菌群呈強烈正相關(guān)[13，33]，氨態(tài)氮、總氮、有效磷含量對微生物群落的影響最大[19]。綜上，有效磷、總酸和銨態(tài)氮含量可能是影響不同質(zhì)量窖泥細菌菌群在空間分布的主要理化因子。

3 結(jié)論

本研究對陶融型白酒退化窖池和正常窖池中窖泥的理化指標進行測定，結(jié)果表明，退化窖池窖泥的含水量（36.78%）、pH值（5.50）及銨態(tài)氮含量（23.48 mg/100 g）均低于正常窖池，而總酸含量（13.00 mg/g）和有效磷含量（27.32 mg/100 g）與之相反。通過高通量測序技術(shù)解析其細菌群落多樣性，結(jié)果表明，窖泥中細菌群落存在明顯的空間異質(zhì)性。與正常窖池窖泥相比，退化窖池窖泥中主要優(yōu)勢細菌門厚壁菌門（Firmicutes）（64.32%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（12.58%）以及優(yōu)勢細菌屬己酸菌屬（Caproiciproducens）（3.03%）、嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum）（6.60%）、棒狀桿菌屬（Caldicoprobacter）（1.06%）、消化鏈球菌屬（Sedimentibacter）（0.63%）、Lutispora（0.78%）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）（0.68%）、泰氏菌屬（Tissierella）（0.57%）、佩特里單胞菌屬（Petrimonas）（0.91%）的平均相對豐度較低。通過RDA對影響微生物群落的主要理化因素進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有效磷、總酸和銨態(tài)氮含量可能是影響不同質(zhì)量窖泥細菌菌群在空間分布的主要理化因子。本研究在一定程度上增加了人們對陶融型白酒正常窖池窖泥和退化窖池窖泥細菌群落的認識，說明了窖泥細菌群落具有明顯空間異質(zhì)性，對識別退化窖泥及人工窖泥的研制和促進白酒風味形成等可能具有一定的積極作用。