劉嘉藝, 岳俊陽, 劉永勝

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

根據(jù)獼猴桃屬植物分類學最新修訂,該屬植物全世界有54個種、21 個變種,共約75個分類單元,中國分布有52個種,其中有44個種為中國特有[1],獼猴桃遺傳資源非常豐富,對于其開發(fā)利用有著天然的優(yōu)勢。獼猴桃原是一種古老藤本果樹上的野果, 19世紀初被引種至新西蘭,逐漸發(fā)展成為一種風靡全球的水果。獼猴桃含有豐富的營養(yǎng)成分,富含維生素C、多種礦質、氨基酸,有“水果之王”的美譽[2]。

獼猴桃作為顯花雌雄異株果樹,對其早期性別鑒定的研究在實踐中有著非常重要的意義。首先,獼猴桃是以果實為主的經濟作物,雌株的經濟價值明顯高于雄株;其次,由于獼猴桃從播種到多產的成熟期經歷時間較長,需要3～5 a,童期漫長和幼苗期雌雄無法辨別,是獼猴桃改良和選育道路上的一個巨大阻礙[3]。因此,開發(fā)用于獼猴桃早期性別鑒定的技術或分子標記可以有效地控制栽培過程中的雌雄比例,減少不必要的生產浪費,提高育種效率,創(chuàng)造更大的經濟價值。

近年來,分子標記技術作為分析遺傳變異的有效工具被應用廣泛。分子標記包括隨機擴增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)、相關序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)等,這些技術先后用于獼猴桃早期性別分析,在果樹童期進行雌雄選株提供了可靠的技術方法[4-5]。隨著測序技術的飛速發(fā)展以及測序成本的不斷降低,在許多物種的研究上產生了豐富的轉錄組數(shù)據(jù)。基于轉錄組測序獲得的EST數(shù)據(jù)進一步分析得到的微衛(wèi)星序列已成為分子標記技術使用的重點,且在花椒、洋蔥、蘑菇等物種上得到成功驗證[6-8]。微衛(wèi)星序列又稱簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR),是重復序列的主要組成成分之一。SSR是一類由 1～6個核苷酸為重復單位序列組成的串聯(lián)重復序列[9]。SSR為共顯性標記,能區(qū)分純合子和雜合子,能檢測出等位基因,較簡單、快捷、低成本,效率更高更經濟。

近年來,國內外學者對SSR技術應用于獼猴桃進行了一些研究。文獻[10]報道了在雜交后代中符合孟德爾遺傳定律分離的40對SSR引物,并以二倍體和四倍體的中華獼猴桃作為研究對象,討論其雜合程度;文獻[11]將文獻[10]報道的引物應用于我國栽培的中華獼猴桃和美味獼猴桃2個商業(yè)物種的9個天然居群(共221個樣),對其遺傳多樣性進行初步分析;文獻[12-13]均通過美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)EST數(shù)據(jù)庫的軟棗獼猴桃EST序列開發(fā)了若干對在獼猴桃屬種有著較高通用性的EST-SSR引物;本課題組對中華獼猴桃“紅陽”的轉錄組序列進行分析,根據(jù)分析結果開發(fā)了EST-SSR引物,并對28個品種的獼猴桃進行遺傳多樣性分析[14]。大多數(shù)報道的獼猴桃SSR分子標記的開發(fā)應用均使用來自于EST數(shù)據(jù)庫的序列、轉錄組測序分析或者直接采用已公布的SSR引物來進行生物信息學分析和遺傳多態(tài)性的實驗,但用于性別鑒定的SSR引物并不多。

本研究進行SSR性別鑒定位點篩選所用的基因組序列為毛花獼猴桃(A.eriantha)雄雌基因組數(shù)據(jù)[15]。通過對獼猴桃雄雌基因組的29條染色體進行篩選獲得SSR標記,對SSR位點的組成、分布及特征進行分析,開發(fā)可以有效鑒定毛花獼猴桃雄雌植株的SSR引物,以期為毛花獼猴桃幼苗期性別鑒定、毛花獼猴桃性別相關基因的克隆提供依據(jù),并為其轉化和利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

用于本研究的毛花獼猴桃樣品于2020年7月采集,雄株5株,雌株2株,人工栽培于安徽省合肥市蜀山區(qū)安徽農業(yè)大學農萃園。選取植株上的幼嫩葉片,作為提取基因組DNA的供試材料,采下后放置于冰盒中,立即帶回實驗室經液氮處理后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組數(shù)據(jù)及SSR位點識別定位

利用MISA(http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具對毛花獼猴桃基因組數(shù)據(jù)進行SSR位點的識別定位。篩選標準如下:單核苷酸重復的次數(shù)在10次或10次以上;二核苷酸重復的次數(shù)在6次或6次以上;三至六核苷酸重復的次數(shù)在5次或5次以上。

1.2.2 引物設計

利用Primer 3.0對篩選得到的SSR位點設計引物,引物設計原則為:引物序列長度18～22 bp, 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)產物長度100～300 bp,退火溫度50～63 ℃, GC占比為40%～60%,盡量避免出現(xiàn)錯配、二聚體、發(fā)夾結構和引物二聚體。最終隨機合成150對引物,將引物序列送生工生物工程上海有限公司合成,部分引物信息見表l所列。

基于小流域河（溝）道生態(tài)監(jiān)測的必要性和緊迫性，本研究借鑒歐盟水框架的理念與方法，選擇典型河（溝）道開展生態(tài)監(jiān)測和評價的研究探索，為摸清北京市河（溝）道生態(tài)質量、實行分類和指導治理奠定基礎，服務于北京的水資源和生態(tài)環(huán)境保護。

表1 SSR引物序列

1.2.3 獼猴桃基因組DNA的提取

采用改良后的CTAB方法提取毛花獼猴桃新鮮幼嫩葉片總DNA,提取后的DNA經NanoDrop 2000測定質量濃度,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴增反應體系

本研究所用的普通PCR擴增反應體系,總體積為10 μL,其中Taq Mix 8.4 μL,DNA模板1.0 μL,正反向引物各為0.3 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min、94 ℃變性30 s、根據(jù)實際溫度退火30 s、72 ℃延伸30 s,30個循環(huán),72 ℃完全反應10 min,最后在4 ℃下保存。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR擴增產物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測,電泳凝膠配方為：蒸餾水8 mL,30%丙烯酰胺4 mL,5×TBE溶液3 mL,10%APS溶液100 μL,四甲基乙二胺10 μL。電泳后使用紫外核酸檢測儀成像。

2 實驗結果分析

2.1 SSR位點數(shù)量與分布

利用MISA工具對毛花獼猴桃的雄雌基因組序列進行識別,在29條染色體和1條未匹配序列共計30條序列中,總長690 378 758 bp, 共識別出381 250個符合條件的SSR位點,每條序列都含有1個以上的SSR位點。

毛花獼猴桃基因組的SSR種類非常豐富,各種重復類型均有出現(xiàn),但是其數(shù)量有很大差異,見表2所列。由表2可知,單核苷酸重復類型的數(shù)量最多,占比50.74%;其次是二核苷酸重復類型,占比39.82%;然后是三核苷酸重復;五核苷酸重復類型的數(shù)量最少,占比不到0.6%。

表2 毛花獼猴桃基因組SSR類型和比例

表3 毛花獼猴桃基因組SSR位點重復次數(shù)分布

2.2 SSR位點的分布特征

毛花獼猴桃SSR核苷酸基序類型見表4所列。從表4可以看出,SSR以單核苷酸重復基序為主要類型,有193 459次;其次是二核苷酸和三核苷酸重復類型。在單核苷酸重復基序中以A/T為主,有187 077次,占總單核苷酸重復的96.7%,以重復10次為主;在二核苷酸重復基序中以AG/CT為主,有85 326次,占總二核苷酸重復的56.2%,以重復6次為主;在三核苷酸重復基序中以AAT/ATT為主,有6 134次,占總三核苷酸重復的24.6%,以重復5次為主。

表4 毛花獼猴桃雄雌基因組中的SSR類型分布

2.3 SSR性別特異片段的篩選

利用150對特異引物對毛花獼猴桃雌雄植株的基因組DNA進行PCR擴增。結果顯示:在150對特異引物中,有117對引物擴增出性別特異產物,但是多數(shù)引物特異性較差,多態(tài)性強,擴增出的條帶數(shù)目多。其中一對引物(序號為Primer000181)在雌雄個體上出現(xiàn)差異,在雄性植株中擴增出一條長度為250 bp的特異性片段,在雌株中沒有擴增出特異性片段,如圖1所示。圖1中:1～10個泳道分別為引物Primer000041、Primer000066、Primer000161、Primer000181、Primer000196用毛花獼猴桃雄株和雌株基因組DNA作為模板的擴增產物;M表示DNA marker,m表示雄性;f表示雌性，下同。

引物Primer000161和Primer000181在7株已知性別毛花獼猴桃植株中的通用性鑒定如圖2所示。從圖2可以看出，Primer000161在7個模板中沒有表現(xiàn)出和初篩結果相似的性別特異,因此不能作為性別鑒定引物;而Primer000181在5株雄株中有一條特異性片段,2株雌株中沒有擴增出特異性片段,與初篩結果一致。該結果用同樣的方法重復3次,得到同樣的結果,說明該標記穩(wěn)定、可靠。

圖1 引物篩選的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖2 引物Primer000161和Primer000181的通用性鑒定

3 討 論

獼猴桃作為雌雄異株植物,在育苗期對其進行性別鑒定具有重要的生物學意義和經濟價值。由于雌株和雄株會在生理生化、蛋白質與核酸等方面體現(xiàn)出差異,隨著分子生物學的發(fā)展,性別鑒定的方法也非常廣泛。目前形態(tài)學鑒定方法、性別特異蛋白的研究以及DNA分子標記法應用較多。DNA分子標記是DNA水平遺傳變異的直接反應,由于結果更為穩(wěn)定等諸多優(yōu)點,SSR已成為目前分子標記研究中的主要形式,在山楊、海棗等植物中都有過SSR性別分子標記的報道[16-17]。

本研究通過對比毛花獼猴桃雌雄基因組序列,分析SSR位點的數(shù)量與分布特征,通過PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法篩選特異性引物,從而獲得理想的SSR性別分子標記,即Primer000181。Primer000181在Chr19染色體,位置為186948 187203,附近有Glycosyltransferase family 90 protein、Outer dense fiber protein等功能基因,為后續(xù)毛花獼猴桃性別決定機制研究奠定基礎,該SSR引物帶結果清晰、特異性高,為毛花獼猴桃雌雄植株的早期性別鑒定提供了技術保障。