李倩倩，李淑芳，陳貴元，2*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000）

刺梨中豐富的維生素C含量可促使機(jī)體干擾素的合成，當(dāng)干擾素進(jìn)入人體后，主要通過細(xì)胞表面的受體作用激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒的蛋白，阻止病毒在人體細(xì)胞中粘附、聚集、定植和過度繁殖，從而達(dá)到抗病毒的目的[1-2]。根據(jù)《中國食品成分標(biāo)準(zhǔn)版》，新鮮成熟的刺梨中維生素C含量為2585.0mg/100g，是蘋果的861.67倍，檸檬的117.5倍，中華獼猴桃的41.69倍[3]。刺梨中富含多糖[4]、多酚[5]、黃酮[6]、超氧化物歧化酶[7]等重要的生化分子。至此，越來越多的相關(guān)產(chǎn)品并非簡單地將刺梨果原材料進(jìn)行初步加工，而是趨向于以刺梨果水提物為原料進(jìn)行深度加工[8]。眾所周知，采用水提醇沉法[9]浸提的刺梨多糖色澤呈黑褐色、渾濁、黏稠度增加，大量色素的存在會干擾后續(xù)的分離純化、質(zhì)量分析、結(jié)構(gòu)剖析以及生物活性的研發(fā)[10-11]。鑒于此，對刺梨果水提物進(jìn)行脫色的研究勢在必行。

針對植物多糖的脫色方式有活性炭[12]、樹脂[13]、過氧化氫[14]、反膠束[15]等主要的脫色方式，其中活性炭[16]具有吸附強(qiáng)、過濾快、比表面積大、內(nèi)部空隙發(fā)達(dá)、理化性質(zhì)穩(wěn)定、耐熱、耐酸、耐堿等天然優(yōu)勢[17]。綜上所述，利用活性炭吸附法對刺梨果多糖進(jìn)行脫色。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果：購自貴州省遵義市產(chǎn)品?；钚蕴浚荷虾ｇ魈胤治鰞x器有限公司。98%濃硫酸溶液、蒽酮、無水葡萄糖、葡萄糖：以上為分析純，均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16B高速臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器有限公司；UV-8000紫外可見光分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨果多糖的制備 挑選新鮮刺梨鮮果，50℃烘干粉碎后過80目篩，制得刺梨果粉末。稱取刺梨果粉末采用石油醚回流脫脂，過濾收集殘?jiān)娓蓚溆?。采取熱水浸提刺梨果多糖水溶液，收集提取液用離心機(jī)在4000r/min條件下離心15min，收集所有上清液，利用真空濃縮的方式減壓濃縮至適量體積，然后加入4倍體積的無水乙醇靜置過夜。之后使用丙酮洗脫殘留的有機(jī)小分子，保留沉淀，冷凍干燥制成刺梨粗多糖[18]。準(zhǔn)確稱取適量刺梨粗多糖，配置成0.5mg/ml的刺梨果多糖水溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 活性炭的預(yù)處理 將活性炭用去離子水洗滌多次，洗至中性，烘干后研磨成粉末型活性炭，保存?zhèn)溆肹19]。

1.4 測定方法

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 現(xiàn)配置蒽酮-濃硫酸試劑。葡萄糖對照品溶液的配制：配制得1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲備液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml置于7個2.0ml容量瓶中，加水稀釋定容，振蕩搖勻。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確吸取上述葡萄糖對照品溶液依次各2.0ml于錐形瓶中，然后緩慢依次加入蒽酮-濃硫酸試劑4ml，輕輕振蕩混勻，每支試管加完后同時(shí)置于沸水浴中加熱10min，取出后冷卻到室溫。以去離子水作參比，于波長620nm處檢測吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲備液的質(zhì)量濃度（mg/ml）為X軸；各樣品的吸光值（A620）為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖線性回歸方程：Y=1.6579X+0.0141（R2=0.9994），表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在0～0.6（mg/ml）范圍內(nèi)與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系[20]。

1.4.2 脫色率的測定與計(jì)算 如圖1所示，將刺梨果多糖在200～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行雙束紫外可見光全波長掃描，故無法測定其吸收值。由于刺梨果多糖溶液脫色前后稀釋均為橙褐色或者橙黃色，依據(jù)互補(bǔ)色原理，刺梨果多糖溶液主要吸收藍(lán)色波段（446～464nm）可見光[21]。因此，選擇處于藍(lán)色波段中心的450nm波長作為檢測波長，進(jìn)而測定其吸光度值（A450），其脫色率計(jì)算公式如下：

圖1 刺梨粗多糖的全波長掃描

式（1）中，A表示脫色率，%；A0代表刺梨果多糖溶液通過活性炭脫色前于450nm處的吸光度值；A1代表刺梨果多糖溶液通過活性炭脫色后于450nm處的吸光度值。

1.4.3 多糖保留率的測定及計(jì)算 本試驗(yàn)采用蒽酮-濃硫酸法來測刺梨果多糖的含量，其多糖保留率計(jì)算公式如下：

式（2）中，C表示多糖保留率的綜合評分，分；C0代表刺梨果多糖溶液脫色前多糖色素質(zhì)量濃度，mg/ml；C1代表刺梨果多糖溶液脫色后多糖色素質(zhì)量濃度，mg/ml。

1.4.4 綜合評分 根據(jù)采用數(shù)據(jù)加權(quán)平均法，將刺梨果多糖的脫色率和多糖保留率兩者的權(quán)重值均設(shè)為50，總分計(jì)算為100分，其綜合評分計(jì)算公式如下[22]：

式（3）中，B表示脫色率的綜合評分，分；A表示脫色率，%；Amax表示脫色率的最大值，%；C表示多糖保留率，%；Cmax表示多糖保留率的最大值，%。

1.5 工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗(yàn)

1.5.1.1 在固定活性炭添加量1.5%、脫色溫度60℃的條件下，評價(jià)不同脫色時(shí)間（10min、20min、30min、40min、50min）對刺梨果多糖脫色率的影響。

1.5.1.2 在設(shè)定反應(yīng)條件為活性炭添加量1.5%、脫色時(shí)間30min的情況下，分析不同脫色溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）對刺梨果多糖脫色率的影響。

1.5.1.3 在控制反應(yīng)條件為脫色時(shí)間30min、脫色溫度60℃的情況下，比較不同活性炭添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）對刺梨果多糖脫色率的影響。

以上3組單因素試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，以考察各種因素對刺梨果多糖脫色率和多糖保留率的影響。

1.5.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在上述3組單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究脫色時(shí)間（A）、脫色溫度（B）和活性炭添加量（C）3個自變量之間的交互作用，以脫色率和多糖保留率組成的脫色效果綜合評分（Y）為指標(biāo)，應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)原理，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)（共17組），響應(yīng)面因素水平編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采 用Design-Expert10.0、Excel、Origin9.0等分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 脫色時(shí)間對脫色工藝的影響 如圖2所示，隨著脫色時(shí)間的延長，脫色率大致呈直線上升趨勢，但是多糖保留率在20min時(shí)出現(xiàn)最高峰，之后呈逐步下降趨勢。這可能是由于活性炭脫色是一個動態(tài)的吸附與解吸過程，吸附平衡的時(shí)間剛好為40min左右，40min之后，脫色效果隨時(shí)間的增加只是略微增加，基本趨于飽和吸附狀態(tài)[23]。

圖2 脫色時(shí)間對刺梨果水提取物脫色率與多糖保留率的影響

如圖3所示，綜合考慮選取脫色時(shí)間20min、30min和40min作為響應(yīng)面優(yōu)化的3個水平。

圖3 脫色時(shí)間對刺梨果水提取物綜合評分的影響

2.1.2 脫色溫度對脫色工藝的影響 如圖4所示，當(dāng)脫色溫度小于40℃時(shí)，脫色率曲線呈現(xiàn)直線上升趨勢?？赡苡捎跍囟仍龈邉t勢能提高，勢能轉(zhuǎn)變成動能，分子擴(kuò)散速度加快，加強(qiáng)了色素顆粒與活性炭之間的互相碰撞機(jī)會，使脫色率不斷上升[24]。當(dāng)脫色時(shí)間到達(dá)40℃時(shí)，活性炭對色素顆粒的吸附能力達(dá)到平衡；40℃之后，活性炭可以將已經(jīng)吸附的組分脫附下來，簡稱為“升溫脫附[25]”，致使脫色率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。多糖保留率隨脫色溫度的升高呈下降的趨勢，可能是由于在較低溫度時(shí)多糖提取液黏度降低，有利于糖液中色素的擴(kuò)散，活性炭吸附色素的同時(shí)也會對刺梨果多糖分子吸附，同時(shí)溫度的升高多糖提取液發(fā)生焦糖化，致使多糖保留率呈現(xiàn)下降趨勢[26]。

圖4 脫色溫度對刺梨果水提取物脫色率與多糖保留率的影響

如圖5所示，綜合考慮將脫色溫度20℃、30℃和40℃作為響應(yīng)面優(yōu)化的3個水平。

圖5 脫色溫度對刺梨果水提取物綜合評分的影響

2.1.3 活性炭添加量對脫色工藝的影響 如圖6所示，活性炭添加量在0.5%～1.5%范圍內(nèi)，脫色率與活性炭添加量成正比，但是多糖保留率與活性炭添加量成反比。可能是由于活性炭添加量的增加會增大分子之間相互吸附的能力，即“凡德瓦引力[27]”，相應(yīng)的吸附量也逐漸升高，致使溶液中的色素分子及多糖類物質(zhì)越來越多地被吸附，從而出現(xiàn)脫色率不斷增加、多糖保留率持續(xù)降低的現(xiàn)象，但是當(dāng)活性炭內(nèi)孔徑被填滿時(shí)，則會出現(xiàn)脫色率下降的現(xiàn)象。

圖6 活性炭添加量對刺梨果水提取物脫色率與多糖保留率的影響

如圖7所示，綜合考慮選取活性炭添加量1%、1.5%和2%作為響應(yīng)面優(yōu)化的3個水平。

圖7 活性炭添加量對刺梨果水提取物綜合評分的影響

2.2 脫色工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果與方差分析 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示，刺梨果多糖脫色率與多糖保留率構(gòu)成的脫色效果綜合評分（Y）與各因素的二次方程模型：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3的回歸模型方差分析可知，回歸模型達(dá)到極顯著水平（p＜0.0001），表明該模型具有極顯著意義；失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），則回歸模型與實(shí)際地試驗(yàn)值無明顯差異。模型的一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AC以及二次項(xiàng)A2、B2、C2對脫色效果有極顯著的影響（p＜0.0001）。F值為方差檢驗(yàn)，各因素對響應(yīng)值影響強(qiáng)弱的順序：B＞A＞C，說明脫色溫度（B）對響應(yīng)值的影響最顯著。模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.994 7，說明該擬合模型所解釋的因變量變化百分比為99.47%。模型的復(fù)相關(guān)系R2=0.9977，表明該模型擬合程度較高。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析

2.2.2 各因素對刺梨果多糖脫色素交互影響的等高線圖和響應(yīng)面圖 等高線（圖8a、圖9a、圖10a）的形狀及疏密程度可以反映2因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，等高線呈橢圓形且曲線密集表示2因素之間相互作用顯著，若為圓形且曲線稀疏表示2因素對響應(yīng)面的影響不顯著[28]。如圖9a所示，脫色時(shí)間和活性炭添加量的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著；圖8a的等高線呈圓形，說明脫色時(shí)間和脫色溫度2因素之間的交互作用不明顯，此結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

通過響應(yīng)面（圖8b、圖9b、圖10b）可更直觀分析各因素對響應(yīng)值的影響以及各因素間的交互效應(yīng)。響應(yīng)面的坡度反映各因素變化對響應(yīng)值的影響，坡度相對較陡峭，則響應(yīng)值對2因素的交互作用越敏感；坡度相對平緩，說明該因素對響應(yīng)值的影響越小[29]。如圖9b所示，脫色時(shí)間和活性炭添加量2因素構(gòu)成的響應(yīng)面坡度較陡，表明脫色時(shí)間和活性炭添加量作用較為敏感。

圖8 脫色時(shí)間和脫色溫度對刺梨果多糖水溶液綜合評分的效果圖

圖9 脫色時(shí)間和活性炭用量對刺梨果多糖水溶液綜合評分的效果圖

2.2.3 最佳工藝參數(shù)的確定及驗(yàn)證性試驗(yàn) 根據(jù)二次多元回歸方程的擬合，得到最佳脫色工藝的預(yù)測值：脫色時(shí)間38.573min、脫色溫度32.092℃、活性炭添加量1.573%。此時(shí)最佳綜合評分為96.080分。

根據(jù)最佳工藝預(yù)測值將試驗(yàn)條件調(diào)整為脫色時(shí)間40min、脫色溫度30℃、活性炭添加量1.5%對刺梨果多糖脫色率進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次，計(jì)算平均值，在此條件下脫色率為72.16%，多糖保留率為74.25%，綜合評分為95.49分，接近預(yù)測值（96.080分），證明該回歸模型提供參數(shù)的可靠性具有實(shí)際意義。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首次采用響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨果多糖提取液活性炭脫色工藝，利用多元二次方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系得到活性炭脫色的最優(yōu)工藝參數(shù)：脫色時(shí)間40min、脫色溫度30℃、活性炭添加量1.5%，在此條件下脫色率為72.16%，多糖保留率為74.25%，綜合評分為95.49分，接近預(yù)測值（96.080分），可見該模型能較好地預(yù)測活性炭對刺梨果多糖脫色的效應(yīng)。本試驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面分析法求得的各參數(shù)組合范圍全面，工藝參數(shù)具有精確性和可靠性，可以避免資源在實(shí)踐生產(chǎn)過程中的過度浪費(fèi)。

活性炭脫色因其成本較低，脫色效果較好，同時(shí)因活性炭脫色是物理吸附過程，不會破壞多糖結(jié)構(gòu)，也不會引入新的雜質(zhì)，適合工業(yè)化生產(chǎn)的需要，但是活性炭吸附屬于非選擇性、不定項(xiàng)的物理吸附，在吸附色素的同時(shí)會吸附多糖，造成多糖含量的損失，同時(shí)活性炭為黑色細(xì)微粉末狀，本身顏色為黑色，也會對脫色過程帶來一定的色值影響，如何去除活性炭本身的影響將成為下一個研究方向。