夏宏燕，陳雪六，謝 康

（1.廣東工業(yè)大學 機電工程學院，廣州 510006；2.廣東工業(yè)大學 省部共建精密電子制造技術(shù)與裝備國家重點實驗室，廣州 510006）

在人們的日常工作或生活中，突發(fā)的疾病或意外可能會導致人體器官衰竭或部分組織功能缺損，這通常會降低人們的生活質(zhì)量甚至嚴重影響人們的生命健康[1-2]。組織工程的快速發(fā)展為組織器官功能修復提供了新的思路[3]。組織工程支架作為組織工程的重要基礎(chǔ)之一，不僅從結(jié)構(gòu)和成分上模擬目標組織的細胞外基質(zhì)的功能和特點，為種子細胞的移植黏附提供一個臨時基質(zhì)，并將細胞順利地運送到人體內(nèi)部特定的部位，還能引導組織再生，控制組織的結(jié)構(gòu)、形貌、尺寸及釋放活性因子來調(diào)控細胞的表達[4-5]。

靜電紡絲技術(shù)制備的纖維膜不僅具有較大的比表面積[6]，適合細胞伸展，而且還具有多孔結(jié)構(gòu)和高孔隙率，方便細胞遷移、長入及物質(zhì)的輸送和交換[7]。除此以外，靜電紡絲纖維膜還具有可調(diào)的表面性質(zhì)和可控的物理結(jié)構(gòu)，可以模擬不同結(jié)構(gòu)的細胞外基質(zhì)[8-9]。特別是三維多孔材料有利于營養(yǎng)物質(zhì)在其中運輸傳遞，因此，本研究通過制備多孔PLA/CA纖維膜，探究多孔結(jié)構(gòu)對于組織工程支架的影響。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

聚乳酸（PLA，Mw=1.0×105），山東醫(yī)療器械有限公司；醋酸纖維素（CA，Mn=3×104），瑪雅試劑；二氯甲烷（DCM，分析純），光華科技；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，分析純），天津市致遠；丙酮（分析純），廣州化學試劑廠；N，N-二甲基乙酰胺（DMAC，分析純），聚-D-賴氨酸（PDL），上海麥克林；胎牛血清、馬血清、DMEM培養(yǎng)液、HBSS緩沖液、胰蛋白酶，美國Gibco；二甲基亞砜（DMSO，分析純），西格瑪；MTT，北京索萊寶科技有限公司；靜電紡絲機（QZNT-E01），佛山輕子精密測控技術(shù)有限公司；聚焦離子束場發(fā)射掃描電子顯微鏡（LYRA 3 XMU），捷克Tescan；X射線光電子能譜（Escalab 250Xi），英國Thermo Fisher；酶標儀（Thermo 3001），美國Thermo。

1.2 PLA/CA纖維膜的制備

稱量0.5 g PLA與0.5 g CA加入7 g DCM與3 g DMF的混合溶液，攪拌2 h后得到無孔PLA/CA纖維紡絲液。稱量0.5 g PLA與0.5 g CA加入8 mL DCM與2 mL丙酮的混合溶液，攪拌2 h后得到多孔PLA/CA纖維紡絲液。采用10 mL注射器吸取紡絲液，設(shè)置針頭與接收器的距離為15 cm，工作電壓25 kV，溶液推出速度為4 mL/h，滾筒轉(zhuǎn)速為300 r/min。常溫常濕條件下開始紡絲，將制好的纖維膜放入50℃真空干燥機干燥12 h，然后常溫備用。

1.3 纖維膜的改性

向HBSS緩沖液中加入PDL溶液，配制出質(zhì)量濃度為40μg/mL的改性PDL溶液，放在水浴鍋中備用。將制備的2種PLA/CA纖維膜放置在紫外光照射1 h，然后將2種PLA/CA纖維膜完全浸泡在改性苯丙氨酸解氨酶（PAL）溶液中，室溫條件下放置在搖床上以200 r/min的頻率搖勻2 h。纖維支架改性完成后取出得到PLA/CA+PDL纖維膜，用HBSS緩沖液將其沖洗3次，以此除去改性支架中為附著的PDL分子。清洗后再次使用紫外燈對纖維支架照射1 h，然后待用。

1.4 纖維膜的表征

1.4.1 SEM

無孔PLA/CA與多孔PLA/CA纖維膜經(jīng)過離子濺射鍍膜儀噴金后，使用聚焦離子束場發(fā)射掃描電子顯微鏡對纖維膜的形貌以及表面結(jié)構(gòu)進行觀察。

1.4.2 XPS

使用X射線光電子能譜對多孔PLA/CA纖維膜和多孔PLA/CA+PDL纖維膜進行掃描，分析纖維膜表面元素。

1.4.3 細胞毒性檢測

將備用的無孔PLA/CA纖維膜與多孔PLA/CA纖維膜消毒后放置于96孔板，然后把含量為5×106/9.6cm2的PC12細胞分別接種在裝有纖維膜的96孔板中，并設(shè)置空白對照組。將96孔板置入培養(yǎng)箱內(nèi)，經(jīng)過48 h培養(yǎng)后換上新的培養(yǎng)基并加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后棄去上清液，加入DMSO溶解20 min，將各孔液體轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)板，使用酶標儀在570 nm波長處測定各孔OD值。

1.5 纖維膜的細胞增殖能力測定

將含量為5×106/9.6 cm2的PC12細胞分別接種在內(nèi)置無孔PLA/CA、多孔PLA/CA及其改性后的纖維膜，培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液，然后加入DMSO溶解紫色晶體，在570 nm處測定各孔OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 形貌觀察

掃描電鏡檢測結(jié)果如圖1所示，從SEM電鏡圖中可以看到，以DCM/DMF體系的紡絲溶液所制備的靜電紡絲纖維呈現(xiàn)為一種光滑、平整且無孔狀結(jié)構(gòu)。而采用DCM/丙酮為溶劑時所制備的PLA/CA靜電紡絲纖維則為均勻多孔結(jié)構(gòu)。這是因為采用DCM/DMF為溶劑時，混合聚合物中CA中的低乙?；〈糠植荒鼙换旌先芤和耆芙?，所以最終得到是無孔的PLA/CA纖維。丙酮作為CA的良好溶劑，在DCM溶液中加入一定比例的丙酮溶液能夠?qū)LA/CA二者的混合物完全溶解。DCM溶液的沸點為40℃，并且丙酮溶液的沸點為56℃左右，兩者的沸點都相對較低，但是DMF溶液的沸點卻是152℃左右。根據(jù)熱致相分離原理，靜電紡絲的過程中，由于DCM/DMF溶劑體系沸點較高，帶電射流在拉伸變細時，溶劑的揮發(fā)速率較慢，不能形成有效的熱致相分離效應，因此最終只能形成無孔狀結(jié)構(gòu)的靜電紡絲納米纖維。但是DCM/丙酮體系的沸點就要比DCM/DMF體系的沸點低得多，所以DCM溶液能夠快速揮發(fā)，使得纖維在成形過程中溫度迅速降低，形成熱致相分離。發(fā)生熱致相分離后，紡絲溶液中的溶質(zhì)富集相形成了納米纖維的基本骨架，而溶劑的富集相則是形成了孔。因此，采用DCM/丙酮體系能夠制備出具有多孔結(jié)構(gòu)的PLA/CA納米纖維。

圖1 不同溶劑體系下纖維形貌

2.2 表面元素分析

對多孔PLA/CA+PDL纖維膜進行XPS能譜測試，分析經(jīng)賴氨酸改性后多孔PLA/CA纖維膜的表面元素，結(jié)果如圖2所示。圖2（a）為多孔PLA/CA改性前后的XPS全譜，從圖2（a）中可以看出，未改性的纖維膜中只有C和O元素，而改性后的纖維膜中出現(xiàn)了C、O和N元素，這說明賴氨酸中的氨基改性成功。

從圖2（b）可以看出，C1s光譜中出現(xiàn)了3種C元素的結(jié)合態(tài)，分別為284.8 eV處的C—C、286.65 eV處的C—O—C和288.98 eV處的O—C=O。圖2（c）的O1s光譜則是在531.85 eV和533.01 eV處分別出現(xiàn)C—O和C==O的結(jié)合態(tài)。此外，在圖2（d）的N1s光譜400.13 eV處出現(xiàn)了屬于C—N的結(jié)合態(tài)。這也說明了PDL對于多孔PLA/CA纖維膜改性的成功。

圖2 多孔PLA/CA+PDL纖維膜的XPS光譜圖

2.3 纖維膜細胞毒性檢測

采用MTT法對無孔PLA/CA膜和多孔PLA/CA膜進行細胞毒性檢測，結(jié)果如圖3所示。無論是無孔纖維膜還是多孔纖維膜的OD值均大于空白對照組的OD值。這說明接種在組織工程支架上的活細胞數(shù)量比接種在孔板中更多，也就是說PC12細胞在這2種纖維支架上都能獲得增殖。這一結(jié)果表明這2種纖維膜不具有細胞毒性，可以作為組織支架在后續(xù)實驗中繼續(xù)使用。

圖3 不同纖維細胞毒性檢測結(jié)果

2.4 纖維膜的細胞增殖能力

實驗結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，無孔PLA/CA纖維膜與多孔PLA/CA纖維膜對于促進細胞增殖的效果是相似的。經(jīng)過改性的纖維膜OD值均高于未改性纖維膜的OD值，說明PDL能有效修飾纖維膜的表面，提高纖維膜的黏附能力，從而增強細胞在纖維膜上的生長增殖能力。具有微孔結(jié)構(gòu)的纖維膜的OD值大于無孔纖維的OD值。也就是說改性后的微孔纖維膜促進細胞增殖的能力遠大于改性后的無孔纖維膜。這可能是因為多孔纖維內(nèi)部的孔為相互貫穿的連通孔，而這種孔結(jié)構(gòu)能更大程度上吸收PDL，使得改性更加徹底，也有利于營養(yǎng)物質(zhì)在其中運輸傳遞，進一步提高纖維膜對細胞的促增殖作用。更說明經(jīng)過改性的具有微孔結(jié)構(gòu)的PLA/CA纖維膜適合作為生物組織支架。

圖4 MTT細胞增殖實驗結(jié)果

3 結(jié)論

通過靜電紡絲技術(shù)，以PLA和CA為溶質(zhì)，DCM和丙酮為溶劑，在常溫常濕條件下制備了多孔納米纖維膜。SEM圖像證實了纖維膜表面存在相互貫穿的連通孔。XPS分析結(jié)果顯示，PDL的改性對PLA/CA纖維膜進行了氮摻雜，有利于細胞黏附。細胞增殖實驗表明，無孔PLA/CA纖維膜與多孔PLA/CA纖維膜在促進細胞增殖方面沒有顯著差異，但是多孔PLA/CA纖維膜對于表面修飾材料的吸收能力更加突出，經(jīng)過PDL改性過后的多孔PLA/CA纖維膜上細胞增殖水平遠遠強于無孔PLA/CA+PDL纖維膜。因此，多孔PLA/CA纖維膜更適合作為組織工程支架。