劉耀輝 謝云龍 張子恒 楊馨悅 盧敏芳 蒲德永 王志堅(jiān) 張耀光 劉小紅

(1. 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715; 2. 西南大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,重慶金佛山喀斯特生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站, 重慶 400715)

瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1 (Transient receptor potential vanilloid-1, TRPV1)屬于瞬時(shí)受體電位離子通道蛋白(TRP)超家族, 是哺乳類動(dòng)物重要的溫度感受與調(diào)控蛋白[1,2]。作為最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為深入的成員[3],TRPV1基因的相關(guān)研究仍主要見(jiàn)于哺乳動(dòng)物。小鼠(Mus musculus)TRPV1基因參與了疼痛、體溫和滲透調(diào)節(jié)等多種生理活動(dòng)和疾病的發(fā)生[4]。一方面,TRPV1參與了哺乳動(dòng)物體溫及與體溫變化有關(guān)行為的調(diào)節(jié), 如辣椒素處理可導(dǎo)致大鼠(Rattus norvegicus)體溫降低, 而這種效應(yīng)可被TRPV1受體拮抗劑辣椒平(Capsazepine, CPZ)阻斷[5];阻斷TRPV1基因的表達(dá)會(huì)引起小鼠的體溫升高,TRPV1基因敲除小鼠對(duì)熱刺激的反應(yīng)也明顯降低甚至缺失[6]。另一方面, 除辣椒素外, TRPV1蛋白的激活還受多種物理和化學(xué)因素的調(diào)控, 包括高溫、內(nèi)源性炎癥介質(zhì)和酸性環(huán)境[1]等, 如環(huán)境溫度高于43℃可激活小鼠TRPV1基因[7], 大鼠炎癥發(fā)熱時(shí)TRPV1蛋白被激活[8]等。炎癥多由外界病原生物感染而引起, 恒溫動(dòng)物炎癥的發(fā)生常伴隨著身體或局部體溫的升高。因此, 炎癥因子具有引起體溫調(diào)控系統(tǒng)及相關(guān)信號(hào)通路改變的潛能, 研究者們也更傾向于認(rèn)為T(mén)RPV1蛋白具有感應(yīng)外界有害高溫和參與調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥介導(dǎo)的體溫升高的作用。

在變溫動(dòng)物中有關(guān)TRPV1的研究較少, 但現(xiàn)有的報(bào)道表明兩棲類和爬行類的TRPV1蛋白也具有感應(yīng)熱溫的作用[9—11]; 而魚(yú)類TRPV1是否具有溫度感受功能則具有物種差異性。斑馬魚(yú)(Danio rerio)和大馬哈魚(yú)(Oncorhynchus keta)等TRPV1基因的表達(dá)具有熱溫敏感性, 但南極魚(yú)類如獨(dú)角雪冰魚(yú)(Chionodraco hamatus)和伯氏肩孔南極魚(yú)(Trematomus bernacchii)的TRPV1不具有感應(yīng)溫度的能力[12]。

魚(yú)類是種類數(shù)量最多的脊椎動(dòng)物, 水體溫度變化對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)、免疫和繁殖等生理活動(dòng)甚至存活都具有決定性調(diào)控作用。中華倒刺鲃(Spinibar-bus sinensis)為長(zhǎng)江上游珍稀特有魚(yú)類, 最適生長(zhǎng)溫度為20—28℃, 其臨界低溫和臨界高溫分別為8.4℃和39.83℃[13]; 該魚(yú)具有肉質(zhì)鮮美, 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高和經(jīng)濟(jì)效用強(qiáng)等特點(diǎn), 為長(zhǎng)江上游的優(yōu)良養(yǎng)殖魚(yú)種, 開(kāi)發(fā)利用價(jià)值高[14—16]。本研究以常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù), 開(kāi)展了中華倒刺鲃TRPV1基因克隆、組織表達(dá)譜和生物信息學(xué)分析, 并檢測(cè)該基因在改變溫度和注射免疫刺激物后間腦和延腦的表達(dá), 探討TRPV1在中華倒刺鲃體溫調(diào)節(jié)中的功能, 可為相關(guān)后續(xù)研究提供一定的理論鋪墊。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用1齡中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)購(gòu)買于重慶合川養(yǎng)殖場(chǎng), 魚(yú)體長(zhǎng)75—105 mm, 體重8.0—23.0 g。在充氧運(yùn)回后, 養(yǎng)殖于淡水魚(yú)類資源與生長(zhǎng)發(fā)育淡水魚(yú)類資源實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖大棚。實(shí)驗(yàn)前, 于200 L水桶中, (25±0.5)℃水溫下人工馴養(yǎng)7d, 馴養(yǎng)期間充氧, 按照1.5%的體重比例在每天8:00和18:00投喂商業(yè)化餌料(山東升索飼料有限公司), 投喂1h后, 清理糞便并換1/4曝氣水。實(shí)驗(yàn)前3天停止投喂。在實(shí)驗(yàn)中, 水體溫度利用精密自動(dòng)控溫加熱棒控制。

1.2 TRPV1基因克隆及序列分析

選取健康中華倒刺鲃1年齡幼魚(yú)6尾, 100 mg/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS222, Sigma-Aldrich, USA)麻醉致死后, 于冰上快速解剖并取腦的各部分組織, 經(jīng)液氮速凍后–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)已獲得的中華倒刺鲃轉(zhuǎn)錄組和NCBI有關(guān)數(shù)據(jù), 設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增中華倒刺鲃TRPV1的引物(表 1)。購(gòu)買RNAiso Plus (TaKaRa, Dalian, China)試劑, 根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作步驟提取中華倒刺鲃腦組織的總RNA。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后, 取1 μg總RNA為模板, 根據(jù)使用說(shuō)明, 使用M-MLV試劑盒(TaKaRa, Dalian,China)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。產(chǎn)物稀釋5倍后, 取1 μL為模板, 加入終濃度為0.5 μmol/L的引物、0.1 U/μL的rTaq酶(TaKaRa, Dalian, China)、100 μmol/L的dNTPs (TaKaRa, Dalian, China), 混合后于Veriti PCR儀(Applied Biosystem, USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min; 94℃ 30s; 55℃ 30s;72℃ 1.5min循環(huán)35次; 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根, 北京)切膠回收, 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后連接至 pMD19-T載體(TaKaRa, Dalian,China), 轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌(天根, 北京), 經(jīng)后續(xù)氨芐青霉素篩選和擴(kuò)大培養(yǎng), 取陽(yáng)性克隆的菌液PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 中華倒刺鲃TRPV1基因克隆和表達(dá)分析所用引物Tab. 1 Primers used for cloning and expression analysis of TRPV1 in Spinibarbus sinensis

測(cè)序所得序列經(jīng)過(guò)NCBI網(wǎng)站初步比對(duì)分析后,使用DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)軟件包拼接、編輯并翻譯為氨基酸序列, 利用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析中華倒刺鲃TRPV1蛋白的理化性質(zhì)。下載各物種TRPV1蛋白序列, 使用MEGA5.1中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),步展值設(shè)置為500。使用在線軟件如SMART (http://smart.embl-heidelberg.de), TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.3 TRPV1基因的組織表達(dá)譜分析

取6尾健康1年齡中華倒刺鲃, 在上述馴養(yǎng)條件馴養(yǎng)7d后, 經(jīng)MS222深度麻醉致死后, 冰上快速解剖并取間腦、延腦、中腦、小腦、端腦、鰓、皮膚、肝、腎、脾、腸、心臟和肌肉等組織, 液氮速凍后保存于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)說(shuō)明書(shū), 利用RNAiso Plus (TaKaRa, Dalian, China)分別提取上述組織總RNA, 各取1 μg RNA為模板, 使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, China)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 稀釋5倍后保存?zhèn)溆谩?/p>

設(shè)計(jì)TRPV1和ACTB、GAPDH基因的特異性引物(表 1), 按照TB Green?Premix ExTaq? II (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, Dalian, China)的使用說(shuō)明,于20 μL反應(yīng)體系中加入模板cDNA 1 μL和引物各0.5 μmol/L, 于Step one plus熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystem, USA)進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增(RT-qPCR)。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性10min; 95℃ 15s;60℃ 30s循環(huán)40次; PCR擴(kuò)增結(jié)束后, 以儀器自帶的參數(shù)進(jìn)行溶解曲線反應(yīng)。在RT-qPCR結(jié)束后, 以看家基因ACTB和GAPDH為內(nèi)參[17], 計(jì)算中華倒刺鲃TRPV1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 溫度及LPS處理對(duì)TRPV1基因表達(dá)的影響

中華倒刺鲃的最適生長(zhǎng)溫度為30℃以下, 高溫臨界溫度可高達(dá)39.8℃[13], 因此35℃是一個(gè)可以引起中華倒刺鲃產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)但卻不致死的溫度。為檢測(cè)高溫是否可引起中華倒刺鲃TRPV1基因表達(dá)的改變, 設(shè)置無(wú)菌磷酸緩沖液(PBS)對(duì)照組和脂多糖(LPS)免疫刺激實(shí)驗(yàn)組, 每組又分為25℃和35℃亞組。選取健康實(shí)驗(yàn)魚(yú), 室內(nèi)25℃水溫下人工馴養(yǎng)7d, MS222麻醉后, 快速腹腔注射200 μL PBS或LPS (1 mg/mL, Sigma-Aldrich, USA), 清潔水體中恢復(fù)1min后, 迅速轉(zhuǎn)移至不同水溫(25℃和35℃)的水桶內(nèi), 并分別在實(shí)驗(yàn)處理后1h、6h和24h解剖實(shí)驗(yàn)魚(yú)(N=6), 分離間腦和延腦等組織, 液氮速凍后–80℃保存待用。

按照1.2所述步驟提取各實(shí)驗(yàn)魚(yú)間腦和延腦組織總RNA、逆轉(zhuǎn)錄, 進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增, 并計(jì)算TRPV1基因在溫度和LPS處理后的實(shí)驗(yàn)魚(yú)間腦和延腦組織的相對(duì)表達(dá)量。利用GraphPad Prism (California, USA)軟件的ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,Fisher LSD方法進(jìn)行多重比較, 并以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)判斷差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 TRPV1基因序列克隆與分析

克隆得到的中華倒刺鲃TPRV1基因序列長(zhǎng)2023 bp(GenBank登錄號(hào): ON571553), 屬于該基因的CDS區(qū)域內(nèi)序列, 可編碼含673個(gè)氨基酸殘基的多肽。通過(guò)比對(duì)分析, 該序列與歐洲鯉相似性最高,為88.80%, 與鯉科其他魚(yú)類相似性均在80%以上,而與非鯉科魚(yú)類的相似性<70%; 與非魚(yú)類脊椎動(dòng)物的相似性<55%?？寺〉玫降闹腥A倒刺鲃TRPV1序列所預(yù)測(cè)的多肽含有173個(gè)高度保守氨基酸位點(diǎn),某些連續(xù)保守位點(diǎn)形成一個(gè)保守區(qū)段, 保守性相對(duì)低的序列主要位于N端、C端和中間的某些部位。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示: 中華倒刺鲃與金線鲃、鯽、南亞野鯪、斑馬魚(yú)等鯉科魚(yú)類聚為一支, 并與大海鰱、大西洋鮭、斗魚(yú)、箭魚(yú)、南極冰魚(yú)等海水性魚(yú)類聚為的支形成姐妹群(圖 1)。

圖1 基于TRPV1氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(鄰接法, 步展值為500)Fig. 1 Phylogenetic tree of TRPV1 based on amino acids(Neighbor-joining method, with bootstrap value of 500)

2.2 TRPV1的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

克隆得到的中華倒刺鲃TRPV1序列編碼的多肽含有78個(gè)堿性氨基酸, 69個(gè)酸性氨基酸, 分別占該肽鏈氨基酸總數(shù)的11.59%和10.25%; 還有255個(gè)疏水性氨基酸和176個(gè)極性氨基酸, 分別占37.89%和26.15%。該肽鏈的理論等電點(diǎn)為8.75, 脂肪指數(shù)為96.92, 平均親水性為–0.087。

SMART和TMHMM預(yù)測(cè)分析表明, 中華倒刺鲃的TPRV1蛋白含有5個(gè)錨蛋白結(jié)構(gòu)域(ANK)和6次跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域, 同時(shí)跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)形成離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道(Ion_trans)。SWISS-MODEL預(yù)測(cè)顯示,中華倒刺鲃TRPV1蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)可能由同源四聚體構(gòu)成(圖 2)。

圖2 中華倒刺鲃TRPV1蛋白二級(jí)(A)和三級(jí)(B)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Protein secondary (A) and tertiary (B) structure prediction of Spinibarbus denticulatus TRPV1

2.3 中倒刺鲃TRPV1組織表達(dá)譜及其在高溫和LPS刺激后的表達(dá)變化

中華倒刺鲃TRPV1基因具有較為廣泛的組織表達(dá), 在延腦及內(nèi)臟如腎、脾和腸等有較高量表達(dá),而在肌肉、皮膚、心臟和端腦表達(dá)量較低, 其他所檢測(cè)的組織如間腦和小腦則為中量表達(dá)(圖 3)。

圖3 中華倒刺鲃TRPV1基因的組織表達(dá)譜(N=6)Fig. 3 Tissue expression profile of TRPV1 in Spinibarbus denticulatus (N=6)

為判斷TRPV1的表達(dá)是否具有溫度和體內(nèi)炎癥敏感性, 利用RT-qPCR檢測(cè)了該基因分別在注射了PBS和LPS, 并于不同水溫(25℃和35℃)中處理1h、6h和24h后中華倒刺鲃間腦和延腦表達(dá)量的變化(圖 4)。結(jié)果顯示在間腦, 35℃處理組實(shí)驗(yàn)魚(yú)TRPV1表達(dá)量顯著低于25℃處理組; 當(dāng)水體溫度為25℃時(shí), 注射后6h的TRPV1基因表達(dá)量雖然相比較于注射后1h有顯著升高(P<0.0001), 但LPS組與PBS組無(wú)顯著差異; 注射后24h, LPS組實(shí)驗(yàn)魚(yú)間腦中TRPV1基因的表達(dá)量顯著高于PBS組(P<0.01);當(dāng)水體溫度為35℃時(shí), 注射LPS或PBS 1h和24h均未檢測(cè)到TRPV1基因的顯著變化(圖 4A)。延腦的結(jié)果與間腦相反。在水體溫度為25℃時(shí), 注射LPS與否對(duì)TRPV1基因的表達(dá)無(wú)顯著影響; 當(dāng)水體溫度為35℃時(shí), 注射6h后,TRPV1基因在LPS組中華倒刺鲃延腦的表達(dá)顯著高于PBS組, 而注射后24h, LPS組的表達(dá)量顯著低于PBS組(P<0.01; 圖 4B)。

圖4 溫度及LPS處理后在中華倒刺鲃TRPV1基因在間腦(A)和延腦(B)的表達(dá)Fig. 4 Relative expression levels of TRPV1 in the diencephalon (A) and medulla oblongata (B) of Spinibarbus denticulatus after temperature and LPS treatment (N=6; **P<0.01; ****P<0.0001)

3 討論

3.1 TRPV1蛋白的結(jié)構(gòu)分析

TRPV1蛋白是公認(rèn)的哺乳類動(dòng)物的熱溫感應(yīng)受體, 蛙類、爬行類和鳥(niǎo)類的TRPV1也被證實(shí)具有熱溫敏感性[9—11,18]。抑制爬行類動(dòng)物如鱷(Crocodylus porosus)、蜥蜴(Amphibolurus muricatus)及恒溫動(dòng)物鵪鶉(Coturnix chinensis)、斑胸草雀(Poephila guttata)的TRPV1可顯著改變他們?cè)诓煌瑴囟拳h(huán)境中的行為以及身體溫度模式[11]。除了感應(yīng)熱溫外,鳥(niǎo)類和哺乳類的TRPV1也具有感應(yīng)體內(nèi)炎癥的能力[4—18]。研究表明, 跨膜結(jié)構(gòu)域是TRPV1感應(yīng)各種外界刺激, 包括辣椒素、低pH、二價(jià)陽(yáng)離子和高溫[19]的功能結(jié)構(gòu)域; 而錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域具有動(dòng)態(tài)控制TRPV1溫度敏感性的功能[20], 因此這兩種結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥RPV1作為溫度感受器都至關(guān)重要。斑馬魚(yú)(Danio rerio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)等魚(yú)TRPV1蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果與哺乳類相似, 它們的TRPV1蛋白也能感應(yīng)熱溫, 并能調(diào)節(jié)熱溫誘導(dǎo)的行為[21,22]。中華倒刺鲃TRPV1蛋白預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)與也哺乳類TRPV1相似, 均含有離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道、6次跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)和錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域, 功能蛋白的組成上也與哺乳類TRPV1一致, 均為同源四聚體[23,24]。獨(dú)角雪冰魚(yú)(Chionodraco hamatus)和伯氏肩孔南極魚(yú)(Trematomus bernacchii)的TRPV1不能感應(yīng)外界溫度變化[11], 其跨膜結(jié)構(gòu)域無(wú)預(yù)測(cè)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道[12]。氨基酸組成差異是離子通道蛋白功能的種間差異的基礎(chǔ)。有研究表明, 僅一個(gè)氨基酸的改變都會(huì)導(dǎo)致如瞬時(shí)受體電位錨蛋白1(TRPA1)等離子通道蛋白巨大的種間溫度敏感差異[25], 獨(dú)角雪冰魚(yú)和伯氏肩孔南極魚(yú)的TRPV1溫度感應(yīng)功能的缺失也被認(rèn)為可能與其離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道的缺失有關(guān)[12]。因此根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果, 中華倒刺鲃TRPV1蛋白應(yīng)該具有溫度敏感性。

3.2 TRPV1基因的組織表達(dá)譜分析

TRPV1蛋白是一種可高效介導(dǎo)Ca2+流的非選擇性陽(yáng)離子通道受體, 廣泛表達(dá)于哺乳類下丘腦和外周神經(jīng)組織, 感覺(jué)神經(jīng)元是其表達(dá)的主要場(chǎng)所,然而在哺乳類腦的其他區(qū)域, 表達(dá)量卻有限[26,27]。雖然如此, 哺乳類的TRPV1仍被認(rèn)為同時(shí)具有能感知外界溫度和調(diào)節(jié)體內(nèi)溫度的功能。爬行類灣鱷(Crocodylus porosus)的TRPV1基因的表達(dá)能在肌肉、心臟和肝臟中檢測(cè)到, 也因此其蛋白被認(rèn)為同時(shí)具有感應(yīng)身體外部溫度和作為體內(nèi)溫度計(jì)的作用[11]。哺乳類的中樞體溫調(diào)控系統(tǒng)為視前核區(qū)域(Preoptic area, POA)-背內(nèi)側(cè)下丘腦(Dorsal medial hypothalamus, DMH), 當(dāng)感染或炎癥發(fā)生時(shí), POADMH被激活并發(fā)出提高代謝率、促進(jìn)產(chǎn)熱和減少皮膚組織熱量散失等生理和行為的指令, 進(jìn)而引起體溫升高的發(fā)熱現(xiàn)象[28]。雖然魚(yú)類的視前核、腦干和脊髓都參與了體溫調(diào)節(jié), 但溫度調(diào)控中樞仍然被認(rèn)為是下丘腦的視前核腦區(qū)[29]。相較于哺乳類,魚(yú)類TRPV1基因具有更為廣泛的組織表達(dá)譜, 如虹鱒的TRPV1在內(nèi)臟如腸道和腎臟高量表達(dá)量, 在腦的各部分區(qū)域如間腦、小腦、端腦、視頂蓋、松果體、垂體和視網(wǎng)膜等, 以及皮膚、血細(xì)胞和心臟等均有表達(dá)[30]; 鮭(Salmo salar)的TRPV1在端腦和視葉也有表達(dá), 且其表達(dá)量還與病毒誘導(dǎo)的致炎因子升高相關(guān)[22]; 南亞野鯪(Labeo rohita)的TRPV1在精子中有表達(dá), 并參與調(diào)節(jié)精子的溫度敏感性生理活動(dòng)[31]。中華倒刺鲃TRPV1的表達(dá)與虹鱒相似, 也具有廣泛的組織表達(dá)譜, 表現(xiàn)為在內(nèi)臟的表達(dá)量較高, 并在腦的各部分也有表達(dá), 但在間腦的表達(dá)量小于延腦。與哺乳類TRPV1神經(jīng)元發(fā)育較晚不同,斑馬魚(yú)的TRPV1神經(jīng)元起源于第一波體感神經(jīng)元發(fā)育, 對(duì)于魚(yú)類早期胚胎的存活具有重要調(diào)節(jié)作用[21]。這提示魚(yú)類TRPV1基因具有功能多樣性和復(fù)雜性。

3.3 魚(yú)類TRPV1蛋白的功能分析

體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)均已表明斑馬魚(yú)TRPV1蛋白具有感應(yīng)高于25℃的溫度, 并參與調(diào)節(jié)熱溫誘導(dǎo)的行為[21,22]。在病毒感染后, 鮭TRPV1在視前核區(qū)域(Pre-Optic Area, POA)的表達(dá)與致炎基因(IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2)的表達(dá)及血清中致炎因子的含量顯著相關(guān)[22]。在本研究中, 高溫并沒(méi)有致使中華倒刺鲃TRPV1在間腦這一溫度調(diào)控中心的表達(dá)量升高; 對(duì)于25℃和35℃組的同一取材時(shí)間點(diǎn), 高溫組實(shí)驗(yàn)魚(yú)間腦TRPV1的表達(dá)量反而低于低溫組, 但在延腦的表達(dá)變化情況正好相反, 這說(shuō)明水溫的變化可影響中華倒刺鲃TRPV1的表達(dá), 但不同組織的TRPV1響應(yīng)機(jī)制不同。腹腔注射可引起魚(yú)類的應(yīng)激反應(yīng), 表現(xiàn)為在處理24h后, 實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清的Cortisol含量升高[32]。在25℃組, 不論注射PBS還是LPS的6h和24h后, 中華倒刺鲃間腦TRPV1都顯著升高, 但35℃組無(wú)變化; 同時(shí)在延腦,TRPV1的顯著表達(dá)變化發(fā)生在35℃組的注射后6h和24h。這說(shuō)明注射這一行為導(dǎo)致的魚(yú)類應(yīng)激反應(yīng)也與TRPV1的表達(dá)有關(guān), 但具體的變化模式具有組織和溫度特異性。LPS為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分, 是重要的特異性抗原, 能引起魚(yú)類的炎癥發(fā)生。在注射24h后的間腦和注射后6h的延腦, LPS組比PBS組實(shí)驗(yàn)魚(yú)具有更高的TRPV1表達(dá)量, 提示中華倒刺鲃TRPV1基因的表達(dá)受到炎癥信號(hào)通路調(diào)控。值得注意的是, 間腦作為公認(rèn)的溫度調(diào)控中心,TRPV1的表達(dá)變化模式與在延腦相反, 這也說(shuō)明魚(yú)類TRPV1的功能具有組織差異性, 且魚(yú)類溫度調(diào)控機(jī)制也具有高度復(fù)雜性。