陶雪花 秦道建 岳夢(mèng)琦 方 玢 張士發(fā) （皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，蕪湖 241001）

全球每年約有1 500 萬早產(chǎn)兒出生，其中約有100 萬死亡，其出生時(shí)免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟、適應(yīng)性免疫“無經(jīng)驗(yàn)”［1］。新生兒期存在腸道微生物失衡和免疫功能低下，此“窗口期”宿主和共棲微生物間適宜的交互作用遭到破壞可能導(dǎo)致持續(xù)性，甚至不可逆的T 淋巴細(xì)胞亞群發(fā)育缺陷［2-4］。研究表明，益生菌是活的非致病性微生物，給予一定數(shù)量的益生菌可有效調(diào)節(jié)早產(chǎn)兒腸道微生物平衡適應(yīng)性免疫應(yīng)答［5-6］。在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，識(shí)別抗原后的T、B 淋巴細(xì)胞在協(xié)同刺激分子的參與下發(fā)生活化、增殖和分化，從而產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞、效應(yīng)分子和記憶細(xì)胞，其中T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中具有重要作用［7］。正性共刺激分子CD28和可誘導(dǎo)的協(xié)同刺激分子（inducible co-stimulator，ICOS，CD278）為T 細(xì)胞提供強(qiáng)烈的共刺激信號(hào)；負(fù)性共刺激分子B、T 淋巴細(xì)胞衰減分子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA，CD272）、細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4（cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4，CD152）、程序性細(xì)胞死亡-1（programmed death-1，PD-1，CD279）通過抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的增殖、限制T 細(xì)胞存活、促進(jìn)程序性T 細(xì)胞死亡或誘導(dǎo)適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞來下調(diào)T 細(xì)胞反應(yīng)，它們都屬于CD28 受體基因家族［8］。課題組的既往研究發(fā)現(xiàn)，早期補(bǔ)充酪酸菌和雙歧桿菌復(fù)合劑可有效促進(jìn)晚期早產(chǎn)兒新生兒期外周血CD4+T 細(xì)胞的增殖、分化，且 CD4+T 細(xì)胞表面 CD272 表達(dá)增高［9］。T 細(xì)胞表面表達(dá) CD152、CD279、CD28 和 CD278，CD28 以較高濃度存在于T 細(xì)胞表面，CD152 和CD279 多在活化后的 T 細(xì)胞上表達(dá)［10-11］。CD272 中的免疫受體氨基酸抑制基序表明了CD272 抑制性受體的功能［12］。這些正信號(hào)和負(fù)信號(hào)間的平衡決定了T 細(xì)胞反應(yīng)的幅度和水平，刺激和抑制信號(hào)的失衡可導(dǎo)致異常免疫應(yīng)答［13］。在早產(chǎn)兒免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟過程中，CD4+T 細(xì)胞表面表達(dá)何種協(xié)同刺激分子可能受腸道定植微生物群的影響，現(xiàn)階段尚不明確，本研究擬通過建立早產(chǎn)小鼠模型，應(yīng)用酪酸菌和雙歧桿菌復(fù)合劑調(diào)節(jié)早產(chǎn)小鼠腸道微生物群的定植，初步探討早產(chǎn)小鼠腸道定植微生物群的豐富度、多樣性及物種豐度改變對(duì)外周血CD4+T細(xì)胞協(xié)同刺激因子 CD28、CD278、CD152、CD279、CD272表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~8周齡健康成年SPF級(jí)BALB/c雌、雄小鼠，體質(zhì)量18~22 g，由江蘇常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010，合格證編號(hào)：202016816。飼養(yǎng)于皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室SPF 級(jí)動(dòng)物房，IVC 系統(tǒng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.1.2 主要試劑 米菲司酮（RU486，北京紫竹藥業(yè)有限公司）；常樂康（酪酸梭菌活菌數(shù)1.0×107CFU/ml、雙歧桿菌 1.0×106CFU/ml，山東科興生物制品公司）；小鼠紅細(xì)胞裂解液（BL503A，Biosharp公司）；FITC Hamster Anti-mouse CD3e、PE-CYTM5Rat Anti-Mouse CD4、PE-CYTM7Rat Anti-Mouse CD8a 及PE Hamster Anti-mouse CD28、CD278、CD279（美國BD PharmingenTM公司）；PE Anti-Mouse CD152、CD272（美國eBioscience公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及分組 參照文獻(xiàn)［14］，隨機(jī)選擇雌、雄小鼠采用2∶1 配對(duì)飼養(yǎng)，傍晚合籠，次晨分籠，隨機(jī)選擇孕18 d 的小鼠，腹腔一次性注射米非司酮（劑量0.15 mg/kg，提前溶于蓖麻油中）誘導(dǎo)早產(chǎn)，獲得胎齡小于20 d 的崽鼠為早產(chǎn)新生小鼠，隨機(jī)分為早產(chǎn)組和實(shí)驗(yàn)組，每組6 只；其余孕鼠不進(jìn)行干預(yù)，待其自然分娩，獲得胎齡大于20 d 的仔鼠為足月新生小鼠，隨機(jī)選取6 只為足月組。各組新生小鼠返回母鼠身邊常規(guī)飼養(yǎng)，僅實(shí)驗(yàn)組于出生后第 1 天（postnatal day 1，P1）口服給予常樂康，2次/d，每次10 ml/kg，連用21 d［15］。

1.2.2 標(biāo)本制備 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各組小鼠于P7、P14 分別取外周血 0.1 ml，EDTA-K2抗凝備用；至P21，各組小鼠取外周血后，于75%乙醇中浸泡20 min，無菌剖腹，提取空腸、回腸及結(jié)腸內(nèi)糞便（主要以結(jié)腸內(nèi)糞便為主）于5 ml 滅菌EP 管中，石蠟封口膜封口，迅速轉(zhuǎn)移至液氮瓶中速凍，24 h 后取出，放入-80 ℃冰箱中保存。以上所有操作均在無菌通風(fēng)櫥及酒精燈旁完成，所有器械均進(jìn)行滅菌處理。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo) ①腸道微生物分類、豐度和多樣性：采用高通量測(cè)序系統(tǒng)（BGISEQ-500），糞便標(biāo)本提取細(xì)菌總DNA 后，對(duì)細(xì)菌的16S rRNA 基因進(jìn)行高通量測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過 Illumina 平臺(tái)（Hiseq 或者 Miseq）進(jìn)行 Pairedend測(cè)序，去除低質(zhì)量reads，獲得Clean Data，使用軟件 FLASH［2］（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11）進(jìn)行序列拼接，得到高變區(qū)的Tags。利用軟件 USEARCH（v7.0.1090）將拼接好的Tags 聚類為OTU，得到OTU 代表序列后，通過RDP classifer（v2.2）軟件將OTU 代表序列與數(shù)據(jù)庫比對(duì)進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.8（武漢華大基因科技有限公司高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)室協(xié)助完成）；②協(xié)同刺激因子：采用Beckman Coulter FC500 型流式細(xì)胞儀及 Epics Software 檢測(cè) CD28、CD278、CD152、CD279及CD272 陽性輔助性T 淋巴細(xì)胞（T helper lympho-cyte，Th；CD3+CD4+）百分比及其在CD3+CD4+T 細(xì)胞表面表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)除非另外注明，否則都進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。使用SPSS10.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)。Alpha 多樣性指數(shù)和不同物種所占的比例均以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組新生小鼠P21腸道菌群Alpha多樣性 實(shí)驗(yàn)組和足月組小鼠腸道菌群Alpha 多樣性Sobs、Chao、Ace、Ahannon 指數(shù)均高于早產(chǎn)組，Simpson 指數(shù)明顯低于早產(chǎn)組，且在三組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；表明足月組和實(shí)驗(yàn)組腸道菌群的豐富度和多樣性高于早產(chǎn)組（表1）。

表1 新生小鼠P21腸道菌群Alpha多樣性分析Tab.1 Alpha diversity analysis of intestinal flora of newborn mice P21

2.2 三組新生小鼠P21 腸道物種分類學(xué)屬水平P21，三組間屬水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的菌屬共24屬（圖1）。

圖1 三組新生小鼠在P21腸道菌群屬水平的豐度Fig.1 Abundance of P21 intestinal flora among three groups of newborn mice

2.3 各組新生小鼠外周血CD4+T 細(xì)胞共刺激分子表達(dá) P7，實(shí)驗(yàn)組CD4+CD28+T 細(xì)胞百分比明顯低于早產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），和足月組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD4+CD278+T 細(xì)胞百分比明顯高于早產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），和足月組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD4+CD152+及CD4+CD272+T 細(xì)胞百分比低于早產(chǎn)組和足月組，CD4+CD279+T 細(xì)胞百分比明顯高于早產(chǎn)組和足月組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD4+T 細(xì)胞表達(dá)的 CD28、CD278、CD152、CD279 及CD272 MFI 在三組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。P14，實(shí)驗(yàn)組 CD4+CD28+T 細(xì)胞百分比顯著高于早產(chǎn)組和足月組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD4+CD278+T 細(xì)胞百分比低于足月組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），和早產(chǎn)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD4+CD152+及CD4+CD279+T 細(xì)胞百分比顯著高于早產(chǎn)組和足月組，而CD4+CD272+T細(xì)胞百分比低于早產(chǎn)組和足月組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD4+T 細(xì)胞表達(dá)的 CD28、CD279 MFI 顯著高于早產(chǎn)組和足月組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD272 MFI 低于早產(chǎn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而CD278、CD152 MFI 在三組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。P21，實(shí)驗(yàn)組CD4+CD28+T 細(xì)胞百分比顯著高于早產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同足月組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD4+CD278+T 細(xì)胞百分比在三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD4+CD152+T細(xì)胞百分比和早產(chǎn)組比較差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），但均高于足月組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD4+CD279+T細(xì)胞的百分比低于早產(chǎn)組和足月組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD4+CD272+T細(xì)胞百分比高于早產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD4+T 細(xì)胞表達(dá)的 CD28、CD272 MFI 高于早產(chǎn)組和足月組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD279 MFI 低于早產(chǎn)組和足月組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD152 MFI 和早產(chǎn)組比較差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），但高于足月組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD278 MFI 在三組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明酪酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌對(duì)早產(chǎn)鼠外周血CD4+T細(xì)胞共刺激分子表達(dá)的影響和益生菌使用的時(shí)間密切相關(guān)（圖2）。

圖2 各組小鼠外周血CD4+T細(xì)胞共刺激分子表達(dá)Fig.2 Expressions of co-stimulating molecules in CD4+T cells in peripheral blood of mice in each group

3 討論

新生兒出生后腸道最初定植的第一種微生物是由其所暴露環(huán)境中細(xì)菌機(jī)會(huì)性定植產(chǎn)生的，而早產(chǎn)兒受出生后時(shí)間、胎齡、出生體重、環(huán)境和營養(yǎng)等因素影響，早期腸道定植共棲微生物不穩(wěn)定，腸球菌屬和雙歧桿菌屬等厭氧菌的定植被延遲，且定植物中的數(shù)量、豐度和多樣性等明顯低于足月兒，如此異常腸道定植可能影響早產(chǎn)兒近期和遠(yuǎn)期的免疫功能［16-19］。長(zhǎng)雙歧桿菌可有效促進(jìn)健康足月新生兒腸道菌群的建立，補(bǔ)充長(zhǎng)雙歧桿菌可有效提高健康新生兒腸道雙歧桿菌數(shù)及與腸桿菌的比值［19］。本研究結(jié)果也證實(shí)：補(bǔ)充酪酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌可有效改善早產(chǎn)小鼠腸道定植微生物群的豐富度、多樣性及物種豐度，尤其增加腸道益生菌的定植。

多項(xiàng)研究表明，腸道定植的共棲微生物群強(qiáng)烈影響宿主的免疫系統(tǒng)，出生后第1 年腸道微生物群的成熟程度是決定宿主后期是否發(fā)生免疫介導(dǎo)性疾病的關(guān)鍵因素［2，4，20］。T 淋巴細(xì)胞，尤其是 CD4+T細(xì)胞，不僅參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答（包括體液和細(xì)胞介導(dǎo)的）的調(diào)節(jié)，其在固有免疫應(yīng)答的調(diào)控中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用，因此通常作為總體免疫功能的標(biāo)記。新生兒，特別是早產(chǎn)兒出生后CD4+T 細(xì)胞活化能力較低且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)［7］。T 細(xì)胞活化依賴于雙信號(hào)，第一信號(hào)源于T 細(xì)胞受體（TCR）和主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ、Ⅱ類分子提呈抗原肽的特異性結(jié)合，其中抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）與 T 細(xì)胞表面多對(duì)協(xié)同刺激分子相互作用產(chǎn)生T細(xì)胞活化的第二信號(hào)在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中具有重要作用，可有效調(diào)節(jié)T細(xì)胞適度的免疫應(yīng)答［13］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)小鼠連續(xù)使用酪酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌可導(dǎo)致多種共刺激因子表達(dá)水平的改變。外周血CD3+CD4+CD28+T 細(xì)胞百分比在7 d 時(shí)顯著低于早產(chǎn)組（P＜0.05），在14 d 和21 d時(shí)顯著高于早產(chǎn)組（P＜0.05），均高于足月組（僅14 d 時(shí)P＜0.05）；CD3+CD4+T 細(xì)胞表面 CD28 的表達(dá)在7 d 時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在14 d 和21 d 時(shí)顯著高于早產(chǎn)組和實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。外周血CD3+CD4+CD278+T 細(xì)胞百分比在7 d 時(shí)高于早產(chǎn)組和足月組（P＜0.05），14 d 時(shí)低于足月組（P＜0.05），但與早產(chǎn)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，21 d 時(shí)三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD3+CD4+T 細(xì)胞表面CD278 的表達(dá)在7 d、14 d 和21 d 時(shí)三組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。外周血CD3+CD4+CD152+T 細(xì)胞百分比在7 d 時(shí)低于早產(chǎn)組和足月組（P＜0.05），14 d 時(shí)高于早產(chǎn)組和實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），21 d 時(shí)顯著高于足月組（P＜0.05），但與早產(chǎn)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD3+CD4+T 細(xì)胞表面CD152 的表達(dá)在7 d 和14 d 時(shí)三組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，21 d 時(shí)高于足月組（P＜0.05）。外周血 CD3+CD4+CD279+T 細(xì)胞百分比在 7 d 和 14 d 時(shí)高于早產(chǎn)組和足月組（P＜0.05），21 d 時(shí)顯著低于早產(chǎn)組和足月組（P＜0.05）；CD3+CD4+T 細(xì)胞表面CD279的表達(dá)在7 d時(shí)三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，14 d時(shí)高于早產(chǎn)組和足月組（P＜0.05），21 d 低于早產(chǎn)組和足月組（P＜0.05）。外周血CD3+CD4+CD272+T 細(xì)胞百分比在7 d 和14 d 時(shí)均低于早產(chǎn)組和足月組（P＜0.05），21 d 時(shí)高于早產(chǎn)組和足月組（P＜0.05）；CD3+CD4+T 細(xì)胞表面CD272 的表達(dá)在7 d 時(shí)三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，14 d 時(shí)低于早產(chǎn)組（P＜0.05），21 d 時(shí)高于早產(chǎn)組（P＜0.05）。表明早產(chǎn)小鼠腸道定植微生物群豐富度、多樣性及物種豐度的改變?cè)谠缙谥饕ㄟ^上調(diào)CD4+T 細(xì)胞共刺激分子CD28、CD279 和下調(diào)CD272 表達(dá)，在晚期主要通過上調(diào)CD4+T 細(xì)胞共刺激分子 CD28、CD272 和下調(diào) CD272表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)控作用。

正性共刺激分子CD28 是免疫球蛋白超家族成員，表達(dá)于嚙齒動(dòng)物所有T細(xì)胞，在人類外周血絕大多數(shù)CD4+T 和半數(shù)CD8+T 表面均有表達(dá)，是T 細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中至關(guān)重要的共刺激分子。CD28 和 APC 表面 CD80（B7-1）、CD86（B7-2）配體相互作用產(chǎn)生的共刺激信號(hào)可有效防止異常（抗自身）免疫，觸發(fā)必要的（抗菌）免疫應(yīng)答，缺乏該信號(hào)可能導(dǎo)致 T 細(xì)胞無能［21］。此外，CD28 促進(jìn) IL-2 基因轉(zhuǎn)錄、增強(qiáng)IL-2 mRNA 的穩(wěn)定性，促進(jìn)IL-2 的合成、分泌以誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖和分化及IFN-γ 的產(chǎn)生，避免發(fā)生 Th2 免疫應(yīng)答偏移［22］。KUMAR 等［23］應(yīng)用動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）早產(chǎn)小鼠肺組織CD3+CD4+T 細(xì)胞表面CD28 表達(dá)顯著下調(diào)。PD-1（CD279）是CD28家族成員，主要表達(dá)于活化的CD3+CD4+、CD8+T 細(xì)胞表面、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞及一些樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）亞群，與其相應(yīng)配體 PD-L1（B7-H1，CD274）、PD-L2（B7-DC，CD273）相互作用產(chǎn)生抑制信號(hào)維持免疫耐受、抑制自身免疫應(yīng)答（防止T 細(xì)胞極度活化）［24］?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，膿毒性休克早產(chǎn)兒表達(dá)PD-1 的單核細(xì)胞的百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著增高，調(diào)節(jié)和/或暫時(shí)抑制PD-1 受體可能會(huì)為治療嚴(yán)重感染性疾病如新生兒敗血癥提供新的治療方法［25］。BTLA（CD272）是一種含糖蛋白結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，在T 細(xì)胞、靜息的B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC 及少數(shù)NK細(xì)胞均有表達(dá)。T細(xì)胞表達(dá)的BTLA 和APCs表面的皰疹病毒進(jìn)入中介體（herpes virus entry mediator，HVEM）相互作用產(chǎn)生抑制信號(hào)，抑制T 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，和正性共刺激分子共同作用可有效調(diào)節(jié)適度的免疫應(yīng)答。BTLA 缺陷可導(dǎo)致自身免疫性疾病，高表達(dá)時(shí)導(dǎo)致免疫耐受［13，26］。BTLA 在固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮不同功能，研究發(fā)現(xiàn)，敗血癥早期階段低CD3+CD4+CD272+T 細(xì)胞百分比與敗血癥嚴(yán)重程度和死亡率密切相關(guān)［27］。BTLA-/-小鼠易發(fā)生自身免疫性疾病，如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎［28］。

總之，本研究初步表明酪酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌可有效改善早產(chǎn)小鼠腸道定植微生物群豐富度、多樣性及物種豐度；腸道定植微生物群豐富度、多樣性及物種豐度的改變?cè)诓煌瑫r(shí)期可能通過上調(diào)/下調(diào) CD4+T 細(xì)胞共刺激分子 CD28、CD272 和CD279 表達(dá)，在早產(chǎn)小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟中發(fā)揮重要作用。