陶雪花 秦道建 岳夢琦 方 玢 張士發(fā) （皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒科，蕪湖 241001）

全球每年約有1 500 萬早產兒出生，其中約有100 萬死亡，其出生時免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟、適應性免疫“無經(jīng)驗”［1］。新生兒期存在腸道微生物失衡和免疫功能低下，此“窗口期”宿主和共棲微生物間適宜的交互作用遭到破壞可能導致持續(xù)性，甚至不可逆的T 淋巴細胞亞群發(fā)育缺陷［2-4］。研究表明，益生菌是活的非致病性微生物，給予一定數(shù)量的益生菌可有效調節(jié)早產兒腸道微生物平衡適應性免疫應答［5-6］。在適應性免疫應答中，識別抗原后的T、B 淋巴細胞在協(xié)同刺激分子的參與下發(fā)生活化、增殖和分化，從而產生相應的效應細胞、效應分子和記憶細胞，其中T 淋巴細胞介導的免疫應答在免疫系統(tǒng)的調節(jié)中具有重要作用［7］。正性共刺激分子CD28和可誘導的協(xié)同刺激分子（inducible co-stimulator，ICOS，CD278）為T 細胞提供強烈的共刺激信號；負性共刺激分子B、T 淋巴細胞衰減分子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA，CD272）、細胞毒性 T 淋巴細胞相關蛋白-4（cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4，CD152）、程序性細胞死亡-1（programmed death-1，PD-1，CD279）通過抑制細胞因子介導的增殖、限制T 細胞存活、促進程序性T 細胞死亡或誘導適應性調節(jié)性T 細胞來下調T 細胞反應，它們都屬于CD28 受體基因家族［8］。課題組的既往研究發(fā)現(xiàn)，早期補充酪酸菌和雙歧桿菌復合劑可有效促進晚期早產兒新生兒期外周血CD4+T 細胞的增殖、分化，且 CD4+T 細胞表面 CD272 表達增高［9］。T 細胞表面表達 CD152、CD279、CD28 和 CD278，CD28 以較高濃度存在于T 細胞表面，CD152 和CD279 多在活化后的 T 細胞上表達［10-11］。CD272 中的免疫受體氨基酸抑制基序表明了CD272 抑制性受體的功能［12］。這些正信號和負信號間的平衡決定了T 細胞反應的幅度和水平，刺激和抑制信號的失衡可導致異常免疫應答［13］。在早產兒免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟過程中，CD4+T 細胞表面表達何種協(xié)同刺激分子可能受腸道定植微生物群的影響，現(xiàn)階段尚不明確，本研究擬通過建立早產小鼠模型，應用酪酸菌和雙歧桿菌復合劑調節(jié)早產小鼠腸道微生物群的定植，初步探討早產小鼠腸道定植微生物群的豐富度、多樣性及物種豐度改變對外周血CD4+T細胞協(xié)同刺激因子 CD28、CD278、CD152、CD279、CD272表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6~8周齡健康成年SPF級BALB/c雌、雄小鼠，體質量18~22 g，由江蘇常州卡文斯實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（蘇）2016-0010，合格證編號：202016816。飼養(yǎng)于皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中心實驗室SPF 級動物房，IVC 系統(tǒng)，自由進食、飲水。

1.1.2 主要試劑 米菲司酮（RU486，北京紫竹藥業(yè)有限公司）；常樂康（酪酸梭菌活菌數(shù)1.0×107CFU/ml、雙歧桿菌 1.0×106CFU/ml，山東科興生物制品公司）；小鼠紅細胞裂解液（BL503A，Biosharp公司）；FITC Hamster Anti-mouse CD3e、PE-CYTM5Rat Anti-Mouse CD4、PE-CYTM7Rat Anti-Mouse CD8a 及PE Hamster Anti-mouse CD28、CD278、CD279（美國BD PharmingenTM公司）；PE Anti-Mouse CD152、CD272（美國eBioscience公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組 參照文獻［14］，隨機選擇雌、雄小鼠采用2∶1 配對飼養(yǎng)，傍晚合籠，次晨分籠，隨機選擇孕18 d 的小鼠，腹腔一次性注射米非司酮（劑量0.15 mg/kg，提前溶于蓖麻油中）誘導早產，獲得胎齡小于20 d 的崽鼠為早產新生小鼠，隨機分為早產組和實驗組，每組6 只；其余孕鼠不進行干預，待其自然分娩，獲得胎齡大于20 d 的仔鼠為足月新生小鼠，隨機選取6 只為足月組。各組新生小鼠返回母鼠身邊常規(guī)飼養(yǎng)，僅實驗組于出生后第 1 天（postnatal day 1，P1）口服給予常樂康，2次/d，每次10 ml/kg，連用21 d［15］。

1.2.2 標本制備 按照實驗設計，各組小鼠于P7、P14 分別取外周血 0.1 ml，EDTA-K2抗凝備用；至P21，各組小鼠取外周血后，于75%乙醇中浸泡20 min，無菌剖腹，提取空腸、回腸及結腸內糞便（主要以結腸內糞便為主）于5 ml 滅菌EP 管中，石蠟封口膜封口，迅速轉移至液氮瓶中速凍，24 h 后取出，放入-80 ℃冰箱中保存。以上所有操作均在無菌通風櫥及酒精燈旁完成，所有器械均進行滅菌處理。

1.2.3 檢測指標 ①腸道微生物分類、豐度和多樣性：采用高通量測序系統(tǒng)（BGISEQ-500），糞便標本提取細菌總DNA 后，對細菌的16S rRNA 基因進行高通量測序，將測序結果進行生物信息學分析。通過 Illumina 平臺（Hiseq 或者 Miseq）進行 Pairedend測序，去除低質量reads，獲得Clean Data，使用軟件 FLASH［2］（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11）進行序列拼接，得到高變區(qū)的Tags。利用軟件 USEARCH（v7.0.1090）將拼接好的Tags 聚類為OTU，得到OTU 代表序列后，通過RDP classifer（v2.2）軟件將OTU 代表序列與數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋，置信度閾值設置為0.8（武漢華大基因科技有限公司高通量測序實驗室協(xié)助完成）；②協(xié)同刺激因子：采用Beckman Coulter FC500 型流式細胞儀及 Epics Software 檢測 CD28、CD278、CD152、CD279及CD272 陽性輔助性T 淋巴細胞（T helper lympho-cyte，Th；CD3+CD4+）百分比及其在CD3+CD4+T 細胞表面表達的平均熒光強度（MFI）。所有實驗嚴格按照操作說明進行。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有實驗除非另外注明，否則都進行3 次獨立實驗。使用SPSS10.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗。Alpha 多樣性指數(shù)和不同物種所占的比例均以均數(shù)和標準差表示，三組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組新生小鼠P21腸道菌群Alpha多樣性 實驗組和足月組小鼠腸道菌群Alpha 多樣性Sobs、Chao、Ace、Ahannon 指數(shù)均高于早產組，Simpson 指數(shù)明顯低于早產組，且在三組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；表明足月組和實驗組腸道菌群的豐富度和多樣性高于早產組（表1）。

表1 新生小鼠P21腸道菌群Alpha多樣性分析Tab.1 Alpha diversity analysis of intestinal flora of newborn mice P21

2.2 三組新生小鼠P21 腸道物種分類學屬水平P21，三組間屬水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）的菌屬共24屬（圖1）。

圖1 三組新生小鼠在P21腸道菌群屬水平的豐度Fig.1 Abundance of P21 intestinal flora among three groups of newborn mice

2.3 各組新生小鼠外周血CD4+T 細胞共刺激分子表達 P7，實驗組CD4+CD28+T 細胞百分比明顯低于早產組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），和足月組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CD4+CD278+T 細胞百分比明顯高于早產組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），和足月組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CD4+CD152+及CD4+CD272+T 細胞百分比低于早產組和足月組，CD4+CD279+T 細胞百分比明顯高于早產組和足月組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CD4+T 細胞表達的 CD28、CD278、CD152、CD279 及CD272 MFI 在三組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。P14，實驗組 CD4+CD28+T 細胞百分比顯著高于早產組和足月組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CD4+CD278+T 細胞百分比低于足月組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），和早產組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CD4+CD152+及CD4+CD279+T 細胞百分比顯著高于早產組和足月組，而CD4+CD272+T細胞百分比低于早產組和足月組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CD4+T 細胞表達的 CD28、CD279 MFI 顯著高于早產組和足月組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CD272 MFI 低于早產組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而CD278、CD152 MFI 在三組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。P21，實驗組CD4+CD28+T 細胞百分比顯著高于早產組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同足月組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CD4+CD278+T 細胞百分比在三組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CD4+CD152+T細胞百分比和早產組比較差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05），但均高于足月組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CD4+CD279+T細胞的百分比低于早產組和足月組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CD4+CD272+T細胞百分比高于早產組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CD4+T 細胞表達的 CD28、CD272 MFI 高于早產組和足月組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CD279 MFI 低于早產組和足月組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CD152 MFI 和早產組比較差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05），但高于足月組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CD278 MFI 在三組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明酪酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌對早產鼠外周血CD4+T細胞共刺激分子表達的影響和益生菌使用的時間密切相關（圖2）。

圖2 各組小鼠外周血CD4+T細胞共刺激分子表達Fig.2 Expressions of co-stimulating molecules in CD4+T cells in peripheral blood of mice in each group

3 討論

新生兒出生后腸道最初定植的第一種微生物是由其所暴露環(huán)境中細菌機會性定植產生的，而早產兒受出生后時間、胎齡、出生體重、環(huán)境和營養(yǎng)等因素影響，早期腸道定植共棲微生物不穩(wěn)定，腸球菌屬和雙歧桿菌屬等厭氧菌的定植被延遲，且定植物中的數(shù)量、豐度和多樣性等明顯低于足月兒，如此異常腸道定植可能影響早產兒近期和遠期的免疫功能［16-19］。長雙歧桿菌可有效促進健康足月新生兒腸道菌群的建立，補充長雙歧桿菌可有效提高健康新生兒腸道雙歧桿菌數(shù)及與腸桿菌的比值［19］。本研究結果也證實：補充酪酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌可有效改善早產小鼠腸道定植微生物群的豐富度、多樣性及物種豐度，尤其增加腸道益生菌的定植。

多項研究表明，腸道定植的共棲微生物群強烈影響宿主的免疫系統(tǒng)，出生后第1 年腸道微生物群的成熟程度是決定宿主后期是否發(fā)生免疫介導性疾病的關鍵因素［2，4，20］。T 淋巴細胞，尤其是 CD4+T細胞，不僅參與適應性免疫應答（包括體液和細胞介導的）的調節(jié)，其在固有免疫應答的調控中也發(fā)揮至關重要的作用，因此通常作為總體免疫功能的標記。新生兒，特別是早產兒出生后CD4+T 細胞活化能力較低且持續(xù)時間較長［7］。T 細胞活化依賴于雙信號，第一信號源于T 細胞受體（TCR）和主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ、Ⅱ類分子提呈抗原肽的特異性結合，其中抗原遞呈細胞（antigen-presenting cell，APC）與 T 細胞表面多對協(xié)同刺激分子相互作用產生T細胞活化的第二信號在適應性免疫應答中具有重要作用，可有效調節(jié)T細胞適度的免疫應答［13］。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，早產小鼠連續(xù)使用酪酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌可導致多種共刺激因子表達水平的改變。外周血CD3+CD4+CD28+T 細胞百分比在7 d 時顯著低于早產組（P＜0.05），在14 d 和21 d時顯著高于早產組（P＜0.05），均高于足月組（僅14 d 時P＜0.05）；CD3+CD4+T 細胞表面 CD28 的表達在7 d 時差異無統(tǒng)計學意義，在14 d 和21 d 時顯著高于早產組和實驗組（P＜0.05）。外周血CD3+CD4+CD278+T 細胞百分比在7 d 時高于早產組和足月組（P＜0.05），14 d 時低于足月組（P＜0.05），但與早產組相比差異無統(tǒng)計學意義，21 d 時三組間比較差異無統(tǒng)計學意義；CD3+CD4+T 細胞表面CD278 的表達在7 d、14 d 和21 d 時三組間差異均無統(tǒng)計學意義。外周血CD3+CD4+CD152+T 細胞百分比在7 d 時低于早產組和足月組（P＜0.05），14 d 時高于早產組和實驗組（P＜0.05），21 d 時顯著高于足月組（P＜0.05），但與早產組相比差異無統(tǒng)計學意義；CD3+CD4+T 細胞表面CD152 的表達在7 d 和14 d 時三組間差異均無統(tǒng)計學意義，21 d 時高于足月組（P＜0.05）。外周血 CD3+CD4+CD279+T 細胞百分比在 7 d 和 14 d 時高于早產組和足月組（P＜0.05），21 d 時顯著低于早產組和足月組（P＜0.05）；CD3+CD4+T 細胞表面CD279的表達在7 d時三組間差異無統(tǒng)計學意義，14 d時高于早產組和足月組（P＜0.05），21 d 低于早產組和足月組（P＜0.05）。外周血CD3+CD4+CD272+T 細胞百分比在7 d 和14 d 時均低于早產組和足月組（P＜0.05），21 d 時高于早產組和足月組（P＜0.05）；CD3+CD4+T 細胞表面CD272 的表達在7 d 時三組間差異無統(tǒng)計學意義，14 d 時低于早產組（P＜0.05），21 d 時高于早產組（P＜0.05）。表明早產小鼠腸道定植微生物群豐富度、多樣性及物種豐度的改變在早期主要通過上調CD4+T 細胞共刺激分子CD28、CD279 和下調CD272 表達，在晚期主要通過上調CD4+T 細胞共刺激分子 CD28、CD272 和下調 CD272表達發(fā)揮免疫調控作用。

正性共刺激分子CD28 是免疫球蛋白超家族成員，表達于嚙齒動物所有T細胞，在人類外周血絕大多數(shù)CD4+T 和半數(shù)CD8+T 表面均有表達，是T 細胞介導的適應性免疫應答中至關重要的共刺激分子。CD28 和 APC 表面 CD80（B7-1）、CD86（B7-2）配體相互作用產生的共刺激信號可有效防止異常（抗自身）免疫，觸發(fā)必要的（抗菌）免疫應答，缺乏該信號可能導致 T 細胞無能［21］。此外，CD28 促進 IL-2 基因轉錄、增強IL-2 mRNA 的穩(wěn)定性，促進IL-2 的合成、分泌以誘導T 細胞增殖和分化及IFN-γ 的產生，避免發(fā)生 Th2 免疫應答偏移［22］。KUMAR 等［23］應用動物模型研究發(fā)現(xiàn)，支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）早產小鼠肺組織CD3+CD4+T 細胞表面CD28 表達顯著下調。PD-1（CD279）是CD28家族成員，主要表達于活化的CD3+CD4+、CD8+T 細胞表面、B 細胞、NK 細胞、單核細胞及一些樹突狀細胞（dendritic cell，DC）亞群，與其相應配體 PD-L1（B7-H1，CD274）、PD-L2（B7-DC，CD273）相互作用產生抑制信號維持免疫耐受、抑制自身免疫應答（防止T 細胞極度活化）［24］?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，膿毒性休克早產兒表達PD-1 的單核細胞的百分比和絕對計數(shù)顯著增高，調節(jié)和/或暫時抑制PD-1 受體可能會為治療嚴重感染性疾病如新生兒敗血癥提供新的治療方法［25］。BTLA（CD272）是一種含糖蛋白結構域的免疫球蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，在T 細胞、靜息的B 細胞、巨噬細胞、DC 及少數(shù)NK細胞均有表達。T細胞表達的BTLA 和APCs表面的皰疹病毒進入中介體（herpes virus entry mediator，HVEM）相互作用產生抑制信號，抑制T 細胞增殖和細胞因子產生，和正性共刺激分子共同作用可有效調節(jié)適度的免疫應答。BTLA 缺陷可導致自身免疫性疾病，高表達時導致免疫耐受［13，26］。BTLA 在固有和適應性免疫應答中發(fā)揮不同功能，研究發(fā)現(xiàn)，敗血癥早期階段低CD3+CD4+CD272+T 細胞百分比與敗血癥嚴重程度和死亡率密切相關［27］。BTLA-/-小鼠易發(fā)生自身免疫性疾病，如實驗性自身免疫性腦脊髓炎［28］。

總之，本研究初步表明酪酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌可有效改善早產小鼠腸道定植微生物群豐富度、多樣性及物種豐度；腸道定植微生物群豐富度、多樣性及物種豐度的改變在不同時期可能通過上調/下調 CD4+T 細胞共刺激分子 CD28、CD272 和CD279 表達，在早產小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟中發(fā)揮重要作用。