王 娜 柴向斌 （山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，太原 030001）

慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是一種以炎癥調(diào)節(jié)失衡為特征的異質(zhì)性、多因素慢性疾病，是鼻-鼻竇黏膜急性炎癥免疫應(yīng)答失調(diào)而導(dǎo)致的長(zhǎng)期炎癥狀態(tài)，其主要臨床表現(xiàn)為鼻塞、流涕，部分伴有嗅覺(jué)障礙和耳面部癥狀等［1-4］。流行病學(xué)研究表明，CRS 在北美和歐洲的發(fā)病率為4.5%~12%，我國(guó)15~75歲人群中CRS發(fā)病率高達(dá)8.2%，且近年發(fā)病率及復(fù)發(fā)率呈逐年升高趨勢(shì)，而長(zhǎng)期鼻塞、流涕嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，因此CRS 發(fā)病機(jī)制、預(yù)防及治療仍是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題［5-6］。

CRS 一般分為兩個(gè)亞型：慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉（CRS without nasal polyps，CRSsNP）和慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉（CRS with nasal polyps，CRSwNP）［6］。杯狀細(xì)胞化生、黏液高分泌和黏液清除不足是CRS的重要病理生理特征，也是導(dǎo)致鼻漏和鼻塞等常見(jiàn)癥狀的原因［7-10］。黏蛋白（mucoprotein，MUC）是黏液重要組成，賦予黏液一定黏性和彈性，而MUC5AC是分泌性黏蛋白的主要成分［11］。正常生理情況下，杯狀細(xì)胞分泌的MUC5AC 具有構(gòu)成氣道黏液屏障、參與形成黏膜固有免疫的功能，而當(dāng)鼻-鼻竇黏膜受刺激時(shí)，會(huì)促進(jìn)杯狀細(xì)胞過(guò)度活化增生產(chǎn)生過(guò)多MUC5AC，導(dǎo)致鼻腔竇口引流障礙，對(duì)CRS發(fā)病率和患者生活質(zhì)量影響較大［10-13］。目前，對(duì)杯狀細(xì)胞增殖分化和黏液高分泌尚無(wú)特效治療方法，需進(jìn)一步了解黏蛋白過(guò)度產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制［14］。近年人前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）在眾多研究中均被發(fā)現(xiàn)與哮喘和肺部疾病杯狀細(xì)胞增生和MUC5AC 過(guò)度產(chǎn)生密切相關(guān)，AGR2 可能是調(diào)節(jié)黏液高分泌的關(guān)鍵因子，但AGR2 在CRS 患者中的表達(dá)和調(diào)控尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道［15-16］。本研究通過(guò)觀察AGR2 在CRS 患者鼻竇黏膜中的表達(dá)與分布及其與MUC5AC 的關(guān)系，初步探討CRS 的黏液高分泌免疫調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 選取 2019 年 8 月至 2020 年 1 月于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者組織標(biāo)本45例，其中以15例CRSsNP患者的下鼻甲黏膜為CRSsNP 組，男5 例，女10 例，年齡 18~65 歲，平均（44.73±15.22）歲；以 15 例CRSwNP 患者鼻息肉組織為 CRSwNP 組，男 8 例，女7 例，年齡27~66 歲，平均（49.93±13.98）歲；以15 例鼻中隔偏曲或鼻外傷患者下鼻甲黏膜組織為正常對(duì)照組，男 11 例，女 4 例，年齡 18~67 歲，平均（42.50±13.54）歲。手術(shù)中取出標(biāo)本后分為兩份，一份立即存放于RNAlater試劑，?80 ℃保存，用于定量mRNA 檢測(cè)；另一份立即于4%多聚甲醛固定，用于HE 染色、AB-PAS 染色及IHC 檢測(cè)。本研究中CRSwNP 和CRSsNP 診斷基于患者臨床病史和前鼻鏡、鼻內(nèi)窺鏡及鼻竇CT 結(jié)果，符合EPOS 2012 和中國(guó)慢性鼻竇炎診斷和治療指南（2018）［2，6，17］。對(duì)照組均無(wú)鼻部癥狀，無(wú)特應(yīng)性疾病病史，對(duì)常見(jiàn)過(guò)敏原的皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)前4周內(nèi)接受過(guò)抗生素和糖皮質(zhì)激素治療；②患有囊性纖維化、阿司匹林耐受不良、腫瘤、免疫缺陷或其他遺傳性疾病。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.1.2 試劑與儀器 愛(ài)先藍(lán)-糖原染色（AB-PAS染色）試劑盒（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；兔抗人-AGR2單克隆抗體、兔抗人-MUC5AC單克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司）；即用型免疫組化SP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；TRIzol 試劑（北京索萊寶科技有限公司）；RT-PCR 試劑盒（RR820A，日本TaKaRa 公 司）；RT-PCR 引 物（AGR2、MUC5AC、GAPDH，上海生工）；PCR 儀（ABI7500，美國(guó)Applied Biosystems 公司）；醫(yī)學(xué)圖像采集系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 HE 染色 將甲醛固定的標(biāo)本常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片（4 μm），各標(biāo)本4~6 張切片。取2 張切片脫蠟至水，蘇木精染色10 min，沖洗，伊紅染色5 min，脫水透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察鼻黏膜上皮及黏膜下腺體病理變化，采集圖像分析。

1.2.2 AB-PAS 染色 將所用標(biāo)本常規(guī)脫水，包埋，切片，烘干，脫蠟至水，蒸餾水清洗，行AB-PAS染色（先用AB染液染15 min，水洗，高碘酸溶液氧化10 min，蒸餾水沖洗，雪夫試劑染10 min，流水沖洗；蘇木素染核2 min，流水沖洗，脫水透明，中性樹(shù)膠封片）。光學(xué)顯微鏡下觀察酸性黏蛋白MUC陽(yáng)性表達(dá)及分布（主要為藍(lán)色區(qū)域），圖像采集分析，400 倍視野下隨機(jī)選取5處不重疊的著色視野進(jìn)行觀察，最后在同一條件下采用Image Pro Plu 6.0 軟件測(cè)定陽(yáng)性染色區(qū)域累積光密度（integrating optical density，IOD）與黏膜上皮總面積（Area）百分比，即平均光密度（IOD/Area）。

1.2.3 IHC 檢測(cè) 將石蠟切片烘干，按順序進(jìn)行常規(guī)脫蠟水洗，枸櫞酸鈉抗原修復(fù)，嚴(yán)格按照SP 試劑盒說(shuō)明書(shū)阻斷過(guò)氧化物酶，加入非特異性染色阻斷劑，滴加一抗（兔抗人-AGR2 單克隆抗體1∶300、兔抗人-MUC5AC 單克隆抗體1∶500），每片滴加 30 μl抗體37 ℃孵育60 min，PBS 沖洗，加二抗（羊抗兔抗體 1∶100）37 ℃孵育 20 min，PBS 沖洗后 DAB 顯色，顯微鏡下觀察染色至適度時(shí)終止。蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水封片，常規(guī)光鏡下分別觀察AGR2和MUC5AC 陽(yáng)性表達(dá)（AGR2 蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色；MUC5AC 陽(yáng)性細(xì)胞為黃色或棕黃色顆粒）。400 倍視野下隨機(jī)選取5處不重疊的著色視野進(jìn)行觀測(cè)，Image Pro Plus 6.0 軟件統(tǒng)一條件下測(cè)定陽(yáng)性染色（AGR2 和MUC5AC）區(qū)域平均光密度（IOD/Area）。

1.2.4 qRT-PCR 將組織剪碎研磨，TRIzol 試劑提取總RNA，RNA 逆轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照試劑盒20μl PCR反應(yīng)體系實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行PCR 反應(yīng)，以GAPDH 為內(nèi)參，2?ΔΔCt計(jì)算人鼻腔鼻竇黏膜中 AGR2 與 MUC5AC相對(duì)表達(dá)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0 軟件和Graph-Pad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示；對(duì)非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)和Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，兩變量相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)檢驗(yàn)，雙側(cè)顯著性水平α 為0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 45 例入組患者年齡、性別資料如表2，三組患者性別、年齡特征差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），因此可排除因性別及年齡對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

表2 三組患者性別及年齡差異比較Tab.2 Comparison of gender and age differences among three groups of patients

2.2 HE染色及AB-PAS染色結(jié)果

2.2.1 HE 染色 光學(xué)顯微鏡下正常組黏膜上皮可見(jiàn)假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，CRSsNP組和CRSwNP組患者鼻黏膜上皮明顯增厚，杯狀細(xì)胞明顯增生，其中有漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。

2.2.2 AB-PAS 染色 所有患者酸性MUC 廣泛表達(dá)于鼻黏膜上皮杯狀細(xì)胞，呈較強(qiáng)藍(lán)色，其中CRSsNP 和CRSwNP 患者上皮MUC 平均光密度百分比均顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），而兩者陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1、表3）。

2.3 IHC結(jié)果

2.3.1 MUC5AC 染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)MUC5AC 在 CRSsNP 組和 CRSwNP 組黏膜上皮染色較多，主要位于杯狀細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃色或棕黃色顆粒，較對(duì)照組明顯增多（P<0.05），但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1、表3）。

2.3.2 AGR2 染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下觀察到AGR2主要定位于CRSsNP或CRSwNP黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃或棕褐色顆粒，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但 CRSsNP 和 CRSwNP兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1、表3）。

表3 3 組鼻黏膜組織 MUC、MUC5AC 和 AGR2 IOD/Area比較（）Tab.3 Comparison of IOD/Area of MUC，MUC5AC and AGR2 in three groups of nasal mucosa（）

表3 3 組鼻黏膜組織 MUC、MUC5AC 和 AGR2 IOD/Area比較（）Tab.3 Comparison of IOD/Area of MUC，MUC5AC and AGR2 in three groups of nasal mucosa（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05.

AGR2 3.76±1.95 20.26±2.971）23.87±6.381）Groups Control CRSsNP CRSwNP MUC 3.98±1.74 14.70±2.851）17.01±3.621）MUC5AC 2.78±1.34 16.18±5.881）19.60±4.261）

圖1 各組組織黏膜病理染色情況（×400）Fig.1 Pathological staining of tissue mucosa in each group（×400）

2.4 qRT-PCR 結(jié)果 qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，所有病例均檢測(cè)到AGR2 和MUC5AC mRNA 表達(dá)。CRSsNP 組和 CRSwNP 組 AGR2 和 MUC5A mRNA 表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高（均P<0.05）。CRSsNP 和CRSwNP 兩組間 AGR2 和 MUC5AC mRNA 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2）。

圖2 正常鼻黏膜、CRSsNP 組鼻黏膜和NP組織MUC5AC、AGR2 mRNA表達(dá)比較Fig.2 Comparison of mRNA expressions of MUC5AC and AGR2 in normal nasal mucosa，CRSsNP group and NP tissue

2.5 CRSsNP 組 和 CRSwNP 組 AGR2、MUC5AC RNA 表達(dá)相關(guān)性分析 CRSsNP 組和 CRSwNP 組AGR2 和MUC5AC mRNA 表達(dá)均呈正相關(guān)（r=0.68、0.73，P<0.05），進(jìn)一步提示AGR2 表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)MUC5AC產(chǎn)生。

3 討論

CRS 屬于鼻-鼻竇黏膜的一種慢性炎癥性疾病，鼻腔屏障功能、黏液纖毛清除、模式識(shí)別受體等先天免疫機(jī)制失調(diào)及嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和先天淋巴樣細(xì)胞等先天免疫細(xì)胞可能參與CRS 發(fā)?。?8］。研究表明CRSwNP 特征為息肉和嗜酸性炎癥浸潤(rùn)，而CRSsNP 特征為與中性粒細(xì)胞聚集、組織重塑和纖維化相關(guān)的非嗜酸性炎癥［19］。CRS的中心是失調(diào)的持續(xù)性炎癥，這種炎癥可能由先天免疫機(jī)制和獲得性免疫機(jī)制共同維持。先天免疫系統(tǒng)不依賴于先前的暴露，并提供最初的炎癥抗菌反應(yīng)。上皮細(xì)胞層通過(guò)物理屏障功能、黏液分泌及黏液-纖毛清除對(duì)鼻腔先天免疫有很大貢獻(xiàn)［18，20］。

觀察到在HE 染色及AB-PAS 染色中，CRSsNP和CRSwNP兩組與正常對(duì)照組相比鼻黏膜上皮明顯增厚，杯狀細(xì)胞大量增生，MUC 過(guò)度分泌。黏液主要來(lái)源于杯狀細(xì)胞，MUC5AC 是黏液的主要蛋白成分，是宿主抵抗吸入性病原體的第一道防線［21］。但病理?xiàng)l件下，各種急、慢性炎癥刺激可增加產(chǎn)生黏液的杯狀細(xì)胞數(shù)量和活性，引起MUC過(guò)度表達(dá)和黏液高分泌，影響氣道內(nèi)正常的黏液-纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和天然免疫功能，從而導(dǎo)致慢性鼻引流障礙和鼻塞，嚴(yán)重影響CRS 患者生活質(zhì)量［21-22］。因此，黏蛋白高分泌的分子機(jī)制研究非常重要。

AGR2 是一種胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticu?lum，ER）蛋白，屬于伴侶蛋白二硫鍵異構(gòu)酶家族（protein disulfide bond isomerase，PDI），可促進(jìn)分泌途徑蛋白折疊等［23］。ZHEN 等［24］通過(guò)序列比較發(fā)現(xiàn)AGR2 具有蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性，可利用硫氧還原蛋白樣結(jié)構(gòu)域中的活性位點(diǎn)促進(jìn)通過(guò)ER 錯(cuò)誤折疊的底物蛋白中二硫鍵重排，而多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵正確形成對(duì)穩(wěn)定分泌蛋白、膜蛋白等天然構(gòu)象非常重要。近年越來(lái)越多研究證實(shí)，AGR2 與氣道黏液分泌相關(guān)，CHEN 等［23］通過(guò)免疫共沉淀研究發(fā)現(xiàn)，黏液化生過(guò)程中AGR2 能夠誘導(dǎo)啟動(dòng)未成熟黏蛋白鏈內(nèi)和鏈間的二硫鍵重排進(jìn)而形成穩(wěn)定的分泌蛋白，此外MUC成熟還要通過(guò)一系列翻譯后修飾促進(jìn)ER 未成熟黏蛋白折疊和多聚化，這些都需要 AGR2 參與。SCHROEDER 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織中AGR2 基因表達(dá)明顯上調(diào)，而AGR2基因缺陷的哮喘小鼠MUC5AC 表達(dá)明顯下調(diào)，提示AGR2 在氣道MUC5AC 加工過(guò)程中起直接作用，參與哮喘氣道黏液高分泌調(diào)控［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，CRS患者鼻黏膜上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和黏膜下腺體中AGR2 和MUC5AC 蛋白及mRNA 表達(dá)均顯著上調(diào)，且兩者存在明顯相關(guān)性，提示AGR2 可能參與CRS黏液高分泌調(diào)控，擴(kuò)大了對(duì)CRSwNP 病理生理學(xué)的理解。

天然免疫效應(yīng)細(xì)胞包括樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，可能參與CRS 病理生理過(guò)程。樹(shù)突狀細(xì)胞吞噬淋巴細(xì)胞并向淋巴細(xì)胞呈遞抗原，有助于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及B 細(xì)胞分泌表型［27］。西方人群中持續(xù)的 T 輔助細(xì)胞 2（Th2）偏斜的炎癥狀態(tài)與CRSwNP 有關(guān)，而在Th2 偏斜炎癥中，Th2 淋巴細(xì)胞是 IL-4、IL-5 和 IL-13 的主要來(lái)源，其中IL-5招募嗜酸性粒細(xì)胞聚集，IL-13作用于上皮誘導(dǎo)黏液分泌［28］。最新研究顯示，IL-13和表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路均是黏液產(chǎn)生所必需的，這些信號(hào)通路對(duì)不同類型黏液產(chǎn)生細(xì)胞有不同調(diào)節(jié)作用［24］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-13 誘導(dǎo)下 SPDEF 可激活 AGR2基因啟動(dòng)子，增加MUC5AC 基因表達(dá)和蛋白產(chǎn)量，而特異性敲除SPDEF 基因，MUC5AC 表達(dá)明顯降低，說(shuō)明AGR2 誘導(dǎo)MUC5AC 合成的過(guò)程依賴于SPDEF 調(diào)控［29-30］。2013 年，ZHOU 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織中AGR2蛋白上調(diào)與MUC5AC蛋白和IL-13 表達(dá)顯著相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)地塞米松可下調(diào)AGR2 蛋白表達(dá)，改善MUC5AC 介導(dǎo)的黏液高分泌。2019 年，XU 等［26］在低氧小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，AGR2 可通過(guò)增加HIF-1α 穩(wěn)定性，缺氧誘導(dǎo)的氣道MUC5AC高分泌中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，因此AGR2 可能成為治療缺氧誘導(dǎo)的氣道高分泌的潛在靶點(diǎn)。

綜上，黏蛋白過(guò)度產(chǎn)生除與AGR2 表達(dá)上調(diào)有關(guān)外，還有多種調(diào)控因子參與。因此，AGR2 及其上游信號(hào)通路可能是與鼻黏蛋白高分泌相關(guān)炎癥和修復(fù)過(guò)程的重要調(diào)節(jié)物。本研究證明了AGR2 和MUC5AC 在CRS 中高表達(dá)，且兩者呈一定正相關(guān)，可能為黏液高分泌疾病發(fā)病機(jī)制提供新的方向，為未來(lái)CRS 黏液高分泌的靶向治療提供新的思路。而有關(guān)AGR2及其上游信號(hào)通路如何調(diào)控CRS患者黏蛋白過(guò)度分泌仍需進(jìn)一步探討。