游麗嬌 楊小芳 耿 歡 孟佳磊 馬宇慧 雷 鳴 王韞瑾

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200137）

梔子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，性寒，味苦，歸心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效，臨床應(yīng)用廣泛，主要有效成分包括梔子苷、藏紅花素、綠原酸等［1］。其中最主要活性成分梔子苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗內(nèi)毒素、保肝利膽、抗氧化、腦缺血保護(hù)、降血壓、抗糖尿病等多種藥理作用［2］。細(xì)菌感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征（sys?temic inflammatory response syndrome，SIRS）、膿毒癥、感染性休克等是臨床危急重癥，抗感染、減輕炎癥反應(yīng)是救治的基礎(chǔ)，中藥抗菌、抗炎作用因抗生素的毒副作用及耐藥性受到重視，常用中藥制劑，如清開(kāi)靈、熱毒寧注射液和安宮牛黃丸等，均含有梔子，其在感染性疾病方面的應(yīng)用受到廣泛重視。研究對(duì)梔子及梔子苷的抗炎作用與機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究，包括通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子水平發(fā)揮抗感染及免疫調(diào)節(jié)作用，證實(shí)其可通過(guò)TLR4/NF-κB 信號(hào)途徑和MAPK/ERK 信號(hào)通路發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用［3-4］。

胱天蛋白酶1（Caspase-1）除參與炎癥調(diào)控外，其通過(guò)炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑是經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑，細(xì)菌、病毒侵襲機(jī)體時(shí)，被天然免疫受體Caspase-1識(shí)別，Caspase-1剪切Gasdermin D（GSDMD）蛋白，釋放打孔膜活性，執(zhí)行細(xì)胞焦亡，引發(fā)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥因子釋放，產(chǎn)生炎癥性損傷［5-6］。脂多糖（LPS）是一種常見(jiàn)的內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，革蘭氏陰性桿菌是引起SIRS、膿毒癥、感染性休克的常見(jiàn)病因［7］。機(jī)體受細(xì)菌病毒侵襲時(shí)往往最先驅(qū)動(dòng)免疫保護(hù)，即作為先天免疫細(xì)胞的巨噬細(xì)胞［8］。在調(diào)控炎癥反應(yīng)方面，其中心細(xì)胞是激活的巨噬細(xì)胞，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放多種炎癥因子。以LPS 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7 作為研究靶點(diǎn)，通過(guò)中藥單體的抗炎機(jī)制可進(jìn)一步了解炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制并找到有效防治策略［9］。本研究以 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞為主要炎癥模型，觀察梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的影響，同時(shí)檢測(cè)Caspase-1 細(xì)胞焦亡信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白及其下游炎癥因子表達(dá)和分泌情況，進(jìn)一步闡明梔子苷抗炎作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7 細(xì)胞株（上海中科院細(xì)胞庫(kù)）；梔子苷（成都普菲德，批號(hào)：19101705）；地塞米松（羅恩，批號(hào)：R010148）；LPS 粉末（Sigma 公司，O111：B4）；DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：MA0212）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：PWL001）、CCK-8 試劑盒（批號(hào)：MAO218）、DAPI（批號(hào)：MB3204）和蛋白酶抑制劑PMSF（批號(hào)：MA0001）均購(gòu)自大連美侖生物；LDH試劑盒（上海翊圣，批號(hào)：40209）；PI 試劑盒（BD 公司，批 號(hào) ：556547）；小 鼠 IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒（達(dá)科為，批號(hào)：1210122、E04609m、217202、1210602）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo，批號(hào)：23227）；兔抗NLRP3 單克隆抗體、鼠抗IL-1β單克隆抗體、兔抗IL-18 單克隆抗體、兔抗β-actin（CST，批號(hào)：15101S、12703S、57058S、8457S）；兔抗GSDMD 單克隆抗體、兔抗Caspase-1 單克隆抗體（Abcam，批號(hào)：ab219800、ab179515）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海雅酶，批號(hào)：014711000）；儀器顯微鏡（德國(guó)徠卡）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛）；超凈工作臺(tái)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；純水儀（美國(guó)Milli?pore 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular devices公司，MQ05267）；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Amersham Imager 600 蛋白成像儀（美國(guó)GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8 檢測(cè)梔子苷對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/ml 鋪于96 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，加入0、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L梔子苷處理24 h，采用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率（%）=（檢測(cè)孔OD 值?本底OD 值）/（對(duì)照組OD 值?空白孔OD值）×100%。選擇不影響細(xì)胞存活率的濃度為最大濃度，并以此濃度按倍數(shù)稀釋中、低濃度。

1.2.3 乳酸脫氫酶（LDH）釋放檢測(cè) 將細(xì)胞按5×103個(gè)/孔鋪于 96 孔板，200 μl/孔加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，倒掉完全培養(yǎng)基，加入新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基，過(guò)夜后分為對(duì)照組、模型組、梔子苷組和地塞米松組。對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無(wú)血清），模型組給予含10 μg/ml LPS 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，梔子苷低、中、高濃度組和地塞米松組（5 μmol/L）于造模后1 h 給藥（200 μl/孔），處理24 h 后按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 細(xì)胞上清中炎癥因子分泌水平檢測(cè) 按1.2.3 進(jìn)行細(xì)胞分組處理，加藥24 h 后取細(xì)胞上清，ELISA 試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6分泌，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 PI 染色觀察細(xì)胞焦亡 參照文獻(xiàn)［10］，細(xì)胞按1.0×105個(gè)/孔鋪于24 孔板（1 ml/孔），分組及處理方式同1.2.3，細(xì)胞加藥處理24 h 后（避光操作），PBS 洗 2 遍，1 ml/孔加入 PBS（含 1∶1 000 DAPI 和1∶20 PI）室溫避光孵育30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)Caspase-1 細(xì)胞焦亡通路蛋白表達(dá) 細(xì)胞以 4.0×105個(gè)/孔接種于 6 孔板（2 ml/孔），按1.2.3 分組，加藥處理24 h 后，4 ℃下PBS洗2遍，加入RIPA（100μl/孔）和PMSF（1μl/孔）冰上裂解30 min 后收集，4 ℃離心15 min 后取上清，BCA 蛋白定量，95 ℃ 5 min 蛋白變性、SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h 后分別加入一抗稀釋液稀釋后的抗體4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加二抗室溫孵育，顯影，Image J軟件處理蛋白灰度值，得出相對(duì)蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以表示，單因素方差分析比較組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率 CCK-8 顯示，梔子苷160μmol/L組細(xì)胞存活率低于對(duì)照組（P<0.05），故選擇80 μmol/L 作為梔子苷高濃度組，按倍數(shù)稀釋計(jì)算中濃度為40μmol/L，低濃度為20μmol/L（圖1）。

圖1 梔子苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of Geniposide on survival rate of RAW264.7 cells

2.2 梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞LDH 釋放的影響 與正常對(duì)照組相比，LPS 組細(xì)胞LDH 釋放量顯著增加（P<0.01）；梔子苷各濃度組和地塞米松組可有效降低細(xì)胞上清中LDH釋放（P<0.01，圖2）。

圖2 梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞LDH 釋放的影響Fig.2 Effect of Geniposide on LDH release in LPS induced RAW264.7 cells

2.3 梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α 和 IL-6 分泌的影響 與對(duì)照組相比，LPS 組細(xì)胞上清中 IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6水平上調(diào)（P<0.01），梔子苷各濃度組和地塞米松組IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6 水平均低于模型組（P<0.05，P<0.01，表1）。

表1 梔子苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清中炎癥因子的影響（，n=3，pg/ml）Tab.1 Effects of Geniposide on inflammatory factors in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3，pg/ml）

表1 梔子苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清中炎癥因子的影響（，n=3，pg/ml）Tab.1 Effects of Geniposide on inflammatory factors in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P<0.01；compared with LPS group，2）P<0.05，3）P<0.01.

IL-6 39.53±14.34 577.01±24.691）413.06±48.522）258.33±45.392）99.54±32.943）162.70±31.103）Groups Control LPS Gen 20μmol/L Gen 40μmol/L Gen 80μmol/L Dex 5μmol/L IL-1β 26.00±3.92 80.89±0.951）35.43±2.983）34.16±0.383）32.97±3.283）44.93±3.083）IL-18 32.55±2.06 145.19±5.891）77.51±7.013）75.83±9.783）61.96±5.903）72.27±4.023）TNF-α 55.84±0.51 361.05±13.441）171.68±2.442）102.22±0.363）74.87±0.963）122.15±3.183）

2.4 PI 染色檢測(cè)梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的影響 與對(duì)照組相比，LPS 組被PI 染色的細(xì)胞核明顯增多，梔子苷各濃度組和地塞米松組中PI染色數(shù)顯著減少（圖3）。

圖3 PI 染色檢測(cè)梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的影響Fig.3 PI staining to detect effect of Geniposide on RAW264.7 cells induced by LPS

2.5 梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)典細(xì)胞焦亡通路中蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，LPS組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18 表達(dá)顯著增加（P<0.01）；與LPS 組相比，梔子苷組和地塞米松組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β 和IL-18 表達(dá)顯著降低（P<0.01，圖4、表2）。

表2 梔子苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表達(dá)的影響（，n=3）Tab.2 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3，Caspase-1，GSDMD，GSDMD-NT，IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3）

表2 梔子苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表達(dá)的影響（，n=3）Tab.2 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3，Caspase-1，GSDMD，GSDMD-NT，IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3）

Note：Compared with control group，1）P<0.01；compared with LPS group，2）P<0.01.

IL-18 0.420±0.105 0.984±0.0541）0.882±0.110 0.749±0.0282）0.335±0.0732）0.325±0.0862）Groups Control LPS Gen 20μmol/L Gen 40μmol/L Gen 80μmol/L Dex 5μmol/L NLRP3 0.091±0.035 1.250±0.0641）0.364±0.0732）0.145±0.0332）0.106±0.0172）0.101±0.0312）Caspase-1 0.293±0.002 1.334±0.0651）1.067±0.041 0.450±0.0102）0.298±0.0312）0.302±0.0212）Caspase-1 P10 0.593±0.096 1.301±0.0621）1.192±0.032 1.051±0.030 0.845±0.0182）0.302±0.0212）GSDMD 0.228±0.038 1.230±0.0901）0.678±0.1152）0.603±0.0172）0.334±0.0512）0.264±0.0452）GSDMD-NT 0.127±0.011 1.142±0.0911）0.461±0.2332）0.387±0.0702）0.198±0.0582）0.146±0.0872）IL-1β 0.726±0.060 1.080±0.0201）0.826±0.0362）0.776±0.0432）0.746±0.0162）0.738±0.0982）

圖4 梔子苷對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞 NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β 和 IL-18表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3，Caspase-1，GSDMD，GSDMD-NT，IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS

3 討論

膿毒癥是感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)、危及生命的癥候群，其本質(zhì)是感染引起的SIRS，炎癥反應(yīng)具有“細(xì)胞因子風(fēng)暴”式級(jí)聯(lián)反應(yīng)特征，可導(dǎo)致循環(huán)、細(xì)胞和代謝異常，病死率顯著提高，即感染性休克；早期治療除抗感染外，發(fā)現(xiàn)及阻斷炎癥反應(yīng)也是重要的救治措施，使體內(nèi)炎癥反應(yīng)恢復(fù)平穩(wěn)，其治療方式包括激素、抗生素及中藥制劑，中藥不影響抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的消除作用，且副作用少，是目前臨床關(guān)注熱點(diǎn)［11-13］。

中醫(yī)將膿毒癥等歸為“外感熱病”“脫證”“神昏”等范疇，由于邪之所湊，其氣必虛，外邪入侵，入里化熱，毒邪內(nèi)蘊(yùn)，絡(luò)脈氣血運(yùn)行不暢，導(dǎo)致毒熱、瘀血、痰濁內(nèi)阻，瘀阻脈絡(luò)，進(jìn)而令各臟器損傷，因此臨床多以清熱解毒、通腑泄熱、活血涼血及扶正固本為主［11，14］。指南推薦用于膿毒癥毒熱證的中成藥，如熱毒寧注射液、清開(kāi)靈注射液、醒腦靜注射液和安宮牛黃丸等，均為含梔子成分產(chǎn)品，梔子作為清熱解毒、涼血瀉火中藥受到臨床廣泛認(rèn)可［9］。

梔子苷是梔子主要活性成分環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物的代表，其含量最高，可達(dá)3%~5%［1］。藥理研究證實(shí)梔子苷可能通過(guò)與Lipid A 結(jié)合中和LPS 活性，抑制LPS介導(dǎo)的細(xì)胞活化，減少細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而保護(hù)膿毒癥模型小鼠［15］。梔子苷通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠具有保護(hù)作用，能夠改善膿毒癥小鼠皮質(zhì)醇異常增高現(xiàn)象，調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素下游基因表達(dá)［16］。梔子苷可降低促炎因子，IL-1β、IL-4、IL-5、TNF-α、IL-8、細(xì)胞黏附分子（VCAM-1）等表達(dá)，提高IL-10等抗炎因子水平，并能激活T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞前炎癥因子釋放，發(fā)揮免疫-炎癥調(diào)節(jié)效應(yīng)［3-4］。

當(dāng)內(nèi)毒素侵入人體，識(shí)別病原相關(guān)分子受體和危險(xiǎn)相關(guān)分子受體并通過(guò)銜接蛋白方式與胞質(zhì)蛋白復(fù)合體-NLRP3 炎癥小體結(jié)合，NLRP3 炎癥小體是激活 Caspase-1 的胞質(zhì)傳感器［17］。Caspase-1 一旦被激活，會(huì)將Pro-IL-1β和Pro-IL-18分解為具有生物活性的成熟形態(tài)（IL-1β 和 IL-18），同時(shí)被激活的Caspase-1 切割為 GSDMD，剪切出 GSDMD 的氮端（GSDMD-NT）聚集至細(xì)胞膜，形成細(xì)胞膜孔隙，導(dǎo)致炎癥因子由此空隙釋放和最終死亡，是焦亡的經(jīng)典途徑［18-19］。焦亡的過(guò)度激活可能是導(dǎo)致膿毒癥、感染性休克重要機(jī)制之一，LPS 是激活Caspase-1 的重要模式分子，LPS 可激活細(xì)胞質(zhì)Lipid A，從而激活Caspase-1，使其表達(dá)增加，從而引發(fā)焦亡［20］。因而阻斷Caspase-1 細(xì)胞焦亡信號(hào)通路可阻斷炎癥反應(yīng)及焦亡，從而減輕炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的損傷，有利于膿毒癥等控制。

LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞后，通過(guò) LDH 釋放和PI 染色觀察細(xì)胞死亡情況，結(jié)果顯示模型組細(xì)胞LDH 釋放量和PI攝取明顯高于正常對(duì)照組，而梔子苷各組均顯著減少了LDH 釋放和PI 攝取，且在LPS誘導(dǎo)下，NLRP3炎癥小體和Caspase-1細(xì)胞焦亡信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白及其下游蛋白表達(dá)明顯升高，細(xì)胞上清中炎癥因子IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6 明顯上調(diào)，表明LPS 激活了Caspase-1 細(xì)胞焦亡的信號(hào)通路。梔子苷各組抑制了NLRP3炎癥小體和Caspase-1細(xì)胞焦亡信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白及其下游蛋白表達(dá)，且減少了炎癥因子 IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6分泌，說(shuō)明梔子苷對(duì)Caspase-1細(xì)胞焦亡信號(hào)通路具有抑制作用。

綜上所述，梔子苷可能通過(guò)下調(diào)NLRP3 炎癥小體表達(dá)，從而抑制Caspase-1 細(xì)胞焦亡信號(hào)通路激活，進(jìn)一步減少炎癥因子釋放和細(xì)胞死亡，故梔子苷為臨床炎癥性疾病治療提供了新思路，值得進(jìn)一步研究。