游麗嬌 楊小芳 耿 歡 孟佳磊 馬宇慧 雷 鳴 王韞瑾
(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,上海 200137)
梔子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品,性寒,味苦,歸心、肺、三焦經(jīng),具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效,臨床應(yīng)用廣泛,主要有效成分包括梔子苷、藏紅花素、綠原酸等[1]。其中最主要活性成分梔子苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗內(nèi)毒素、保肝利膽、抗氧化、腦缺血保護(hù)、降血壓、抗糖尿病等多種藥理作用[2]。細(xì)菌感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(sys?temic inflammatory response syndrome,SIRS)、膿毒癥、感染性休克等是臨床危急重癥,抗感染、減輕炎癥反應(yīng)是救治的基礎(chǔ),中藥抗菌、抗炎作用因抗生素的毒副作用及耐藥性受到重視,常用中藥制劑,如清開(kāi)靈、熱毒寧注射液和安宮牛黃丸等,均含有梔子,其在感染性疾病方面的應(yīng)用受到廣泛重視。研究對(duì)梔子及梔子苷的抗炎作用與機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究,包括通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子水平發(fā)揮抗感染及免疫調(diào)節(jié)作用,證實(shí)其可通過(guò)TLR4/NF-κB 信號(hào)途徑和MAPK/ERK 信號(hào)通路發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用[3-4]。
胱天蛋白酶1(Caspase-1)除參與炎癥調(diào)控外,其通過(guò)炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑是經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑,細(xì)菌、病毒侵襲機(jī)體時(shí),被天然免疫受體Caspase-1識(shí)別,Caspase-1剪切Gasdermin D(GSDMD)蛋白,釋放打孔膜活性,執(zhí)行細(xì)胞焦亡,引發(fā)炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)炎癥因子釋放,產(chǎn)生炎癥性損傷[5-6]。脂多糖(LPS)是一種常見(jiàn)的內(nèi)毒素,是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分,革蘭氏陰性桿菌是引起SIRS、膿毒癥、感染性休克的常見(jiàn)病因[7]。機(jī)體受細(xì)菌病毒侵襲時(shí)往往最先驅(qū)動(dòng)免疫保護(hù),即作為先天免疫細(xì)胞的巨噬細(xì)胞[8]。在調(diào)控炎癥反應(yīng)方面,其中心細(xì)胞是激活的巨噬細(xì)胞,由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放多種炎癥因子。以LPS 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7 作為研究靶點(diǎn),通過(guò)中藥單體的抗炎機(jī)制可進(jìn)一步了解炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制并找到有效防治策略[9]。本研究以 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞為主要炎癥模型,觀察梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的影響,同時(shí)檢測(cè)Caspase-1 細(xì)胞焦亡信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白及其下游炎癥因子表達(dá)和分泌情況,進(jìn)一步闡明梔子苷抗炎作用的分子機(jī)制。
1.1 材料 RAW264.7 細(xì)胞株(上海中科院細(xì)胞庫(kù));梔子苷(成都普菲德,批號(hào):19101705);地塞米松(羅恩,批號(hào):R010148);LPS 粉末(Sigma 公司,O111:B4);DMEM 培養(yǎng)基(批號(hào):MA0212)、胎牛血清(FBS,批號(hào):PWL001)、CCK-8 試劑盒(批號(hào):MAO218)、DAPI(批號(hào):MB3204)和蛋白酶抑制劑PMSF(批號(hào):MA0001)均購(gòu)自大連美侖生物;LDH試劑盒(上海翊圣,批號(hào):40209);PI 試劑盒(BD 公司,批 號(hào) :556547);小 鼠 IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒(達(dá)科為,批號(hào):1210122、E04609m、217202、1210602);BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo,批號(hào):23227);兔抗NLRP3 單克隆抗體、鼠抗IL-1β單克隆抗體、兔抗IL-18 單克隆抗體、兔抗β-actin(CST,批號(hào):15101S、12703S、57058S、8457S);兔抗GSDMD 單克隆抗體、兔抗Caspase-1 單克隆抗體(Abcam,批號(hào):ab219800、ab179515);ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海雅酶,批號(hào):014711000);儀器顯微鏡(德國(guó)徠卡);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛);超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo Scientific 公司);純水儀(美國(guó)Milli?pore 公司);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular devices公司,MQ05267);電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Amersham Imager 600 蛋白成像儀(美國(guó)GE公司)。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。
1.2.2 CCK-8 檢測(cè)梔子苷對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/ml 鋪于96 孔板,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,加入0、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L梔子苷處理24 h,采用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率(%)=(檢測(cè)孔OD 值?本底OD 值)/(對(duì)照組OD 值?空白孔OD值)×100%。選擇不影響細(xì)胞存活率的濃度為最大濃度,并以此濃度按倍數(shù)稀釋中、低濃度。
1.2.3 乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測(cè) 將細(xì)胞按5×103個(gè)/孔鋪于 96 孔板,200 μl/孔加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,倒掉完全培養(yǎng)基,加入新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基,過(guò)夜后分為對(duì)照組、模型組、梔子苷組和地塞米松組。對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)血清),模型組給予含10 μg/ml LPS 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,梔子苷低、中、高濃度組和地塞米松組(5 μmol/L)于造模后1 h 給藥(200 μl/孔),處理24 h 后按試劑盒說(shuō)明檢測(cè),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
1.2.4 細(xì)胞上清中炎癥因子分泌水平檢測(cè) 按1.2.3 進(jìn)行細(xì)胞分組處理,加藥24 h 后取細(xì)胞上清,ELISA 試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6分泌,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
1.2.5 PI 染色觀察細(xì)胞焦亡 參照文獻(xiàn)[10],細(xì)胞按1.0×105個(gè)/孔鋪于24 孔板(1 ml/孔),分組及處理方式同1.2.3,細(xì)胞加藥處理24 h 后(避光操作),PBS 洗 2 遍,1 ml/孔加入 PBS(含 1∶1 000 DAPI 和1∶20 PI)室溫避光孵育30 min,倒置熒光顯微鏡下觀察,拍照記錄。
1.2.6 Western blot 檢測(cè)Caspase-1 細(xì)胞焦亡通路蛋白表達(dá) 細(xì)胞以 4.0×105個(gè)/孔接種于 6 孔板(2 ml/孔),按1.2.3 分組,加藥處理24 h 后,4 ℃下PBS洗2遍,加入RIPA(100μl/孔)和PMSF(1μl/孔)冰上裂解30 min 后收集,4 ℃離心15 min 后取上清,BCA 蛋白定量,95 ℃ 5 min 蛋白變性、SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h 后分別加入一抗稀釋液稀釋后的抗體4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜后加二抗室溫孵育,顯影,Image J軟件處理蛋白灰度值,得出相對(duì)蛋白表達(dá)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以表示,單因素方差分析比較組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 細(xì)胞存活率 CCK-8 顯示,梔子苷160μmol/L組細(xì)胞存活率低于對(duì)照組(P<0.05),故選擇80 μmol/L 作為梔子苷高濃度組,按倍數(shù)稀釋計(jì)算中濃度為40μmol/L,低濃度為20μmol/L(圖1)。
圖1 梔子苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of Geniposide on survival rate of RAW264.7 cells
2.2 梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞LDH 釋放的影響 與正常對(duì)照組相比,LPS 組細(xì)胞LDH 釋放量顯著增加(P<0.01);梔子苷各濃度組和地塞米松組可有效降低細(xì)胞上清中LDH釋放(P<0.01,圖2)。
圖2 梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞LDH 釋放的影響Fig.2 Effect of Geniposide on LDH release in LPS induced RAW264.7 cells
2.3 梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α 和 IL-6 分泌的影響 與對(duì)照組相比,LPS 組細(xì)胞上清中 IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6水平上調(diào)(P<0.01),梔子苷各濃度組和地塞米松組IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6 水平均低于模型組(P<0.05,P<0.01,表1)。
表1 梔子苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清中炎癥因子的影響(,n=3,pg/ml)Tab.1 Effects of Geniposide on inflammatory factors in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS(,n=3,pg/ml)
表1 梔子苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清中炎癥因子的影響(,n=3,pg/ml)Tab.1 Effects of Geniposide on inflammatory factors in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS(,n=3,pg/ml)
Note:Compared with control group,1)P<0.01;compared with LPS group,2)P<0.05,3)P<0.01.
IL-6 39.53±14.34 577.01±24.691)413.06±48.522)258.33±45.392)99.54±32.943)162.70±31.103)Groups Control LPS Gen 20μmol/L Gen 40μmol/L Gen 80μmol/L Dex 5μmol/L IL-1β 26.00±3.92 80.89±0.951)35.43±2.983)34.16±0.383)32.97±3.283)44.93±3.083)IL-18 32.55±2.06 145.19±5.891)77.51±7.013)75.83±9.783)61.96±5.903)72.27±4.023)TNF-α 55.84±0.51 361.05±13.441)171.68±2.442)102.22±0.363)74.87±0.963)122.15±3.183)
2.4 PI 染色檢測(cè)梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的影響 與對(duì)照組相比,LPS 組被PI 染色的細(xì)胞核明顯增多,梔子苷各濃度組和地塞米松組中PI染色數(shù)顯著減少(圖3)。
圖3 PI 染色檢測(cè)梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的影響Fig.3 PI staining to detect effect of Geniposide on RAW264.7 cells induced by LPS
2.5 梔子苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)典細(xì)胞焦亡通路中蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,LPS組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18 表達(dá)顯著增加(P<0.01);與LPS 組相比,梔子苷組和地塞米松組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β 和IL-18 表達(dá)顯著降低(P<0.01,圖4、表2)。
表2 梔子苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表達(dá)的影響(,n=3)Tab.2 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3,Caspase-1,GSDMD,GSDMD-NT,IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS(,n=3)
表2 梔子苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表達(dá)的影響(,n=3)Tab.2 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3,Caspase-1,GSDMD,GSDMD-NT,IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS(,n=3)
Note:Compared with control group,1)P<0.01;compared with LPS group,2)P<0.01.
IL-18 0.420±0.105 0.984±0.0541)0.882±0.110 0.749±0.0282)0.335±0.0732)0.325±0.0862)Groups Control LPS Gen 20μmol/L Gen 40μmol/L Gen 80μmol/L Dex 5μmol/L NLRP3 0.091±0.035 1.250±0.0641)0.364±0.0732)0.145±0.0332)0.106±0.0172)0.101±0.0312)Caspase-1 0.293±0.002 1.334±0.0651)1.067±0.041 0.450±0.0102)0.298±0.0312)0.302±0.0212)Caspase-1 P10 0.593±0.096 1.301±0.0621)1.192±0.032 1.051±0.030 0.845±0.0182)0.302±0.0212)GSDMD 0.228±0.038 1.230±0.0901)0.678±0.1152)0.603±0.0172)0.334±0.0512)0.264±0.0452)GSDMD-NT 0.127±0.011 1.142±0.0911)0.461±0.2332)0.387±0.0702)0.198±0.0582)0.146±0.0872)IL-1β 0.726±0.060 1.080±0.0201)0.826±0.0362)0.776±0.0432)0.746±0.0162)0.738±0.0982)
圖4 梔子苷對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞 NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β 和 IL-18表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3,Caspase-1,GSDMD,GSDMD-NT,IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS
膿毒癥是感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)、危及生命的癥候群,其本質(zhì)是感染引起的SIRS,炎癥反應(yīng)具有“細(xì)胞因子風(fēng)暴”式級(jí)聯(lián)反應(yīng)特征,可導(dǎo)致循環(huán)、細(xì)胞和代謝異常,病死率顯著提高,即感染性休克;早期治療除抗感染外,發(fā)現(xiàn)及阻斷炎癥反應(yīng)也是重要的救治措施,使體內(nèi)炎癥反應(yīng)恢復(fù)平穩(wěn),其治療方式包括激素、抗生素及中藥制劑,中藥不影響抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的消除作用,且副作用少,是目前臨床關(guān)注熱點(diǎn)[11-13]。
中醫(yī)將膿毒癥等歸為“外感熱病”“脫證”“神昏”等范疇,由于邪之所湊,其氣必虛,外邪入侵,入里化熱,毒邪內(nèi)蘊(yùn),絡(luò)脈氣血運(yùn)行不暢,導(dǎo)致毒熱、瘀血、痰濁內(nèi)阻,瘀阻脈絡(luò),進(jìn)而令各臟器損傷,因此臨床多以清熱解毒、通腑泄熱、活血涼血及扶正固本為主[11,14]。指南推薦用于膿毒癥毒熱證的中成藥,如熱毒寧注射液、清開(kāi)靈注射液、醒腦靜注射液和安宮牛黃丸等,均為含梔子成分產(chǎn)品,梔子作為清熱解毒、涼血瀉火中藥受到臨床廣泛認(rèn)可[9]。
梔子苷是梔子主要活性成分環(huán)烯醚萜類化合物的代表,其含量最高,可達(dá)3%~5%[1]。藥理研究證實(shí)梔子苷可能通過(guò)與Lipid A 結(jié)合中和LPS 活性,抑制LPS介導(dǎo)的細(xì)胞活化,減少細(xì)胞因子釋放,進(jìn)而保護(hù)膿毒癥模型小鼠[15]。梔子苷通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠具有保護(hù)作用,能夠改善膿毒癥小鼠皮質(zhì)醇異常增高現(xiàn)象,調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素下游基因表達(dá)[16]。梔子苷可降低促炎因子,IL-1β、IL-4、IL-5、TNF-α、IL-8、細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)等表達(dá),提高IL-10等抗炎因子水平,并能激活T細(xì)胞,促進(jìn)T細(xì)胞增殖,降低細(xì)胞前炎癥因子釋放,發(fā)揮免疫-炎癥調(diào)節(jié)效應(yīng)[3-4]。
當(dāng)內(nèi)毒素侵入人體,識(shí)別病原相關(guān)分子受體和危險(xiǎn)相關(guān)分子受體并通過(guò)銜接蛋白方式與胞質(zhì)蛋白復(fù)合體-NLRP3 炎癥小體結(jié)合,NLRP3 炎癥小體是激活 Caspase-1 的胞質(zhì)傳感器[17]。Caspase-1 一旦被激活,會(huì)將Pro-IL-1β和Pro-IL-18分解為具有生物活性的成熟形態(tài)(IL-1β 和 IL-18),同時(shí)被激活的Caspase-1 切割為 GSDMD,剪切出 GSDMD 的氮端(GSDMD-NT)聚集至細(xì)胞膜,形成細(xì)胞膜孔隙,導(dǎo)致炎癥因子由此空隙釋放和最終死亡,是焦亡的經(jīng)典途徑[18-19]。焦亡的過(guò)度激活可能是導(dǎo)致膿毒癥、感染性休克重要機(jī)制之一,LPS 是激活Caspase-1 的重要模式分子,LPS 可激活細(xì)胞質(zhì)Lipid A,從而激活Caspase-1,使其表達(dá)增加,從而引發(fā)焦亡[20]。因而阻斷Caspase-1 細(xì)胞焦亡信號(hào)通路可阻斷炎癥反應(yīng)及焦亡,從而減輕炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的損傷,有利于膿毒癥等控制。
LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞后,通過(guò) LDH 釋放和PI 染色觀察細(xì)胞死亡情況,結(jié)果顯示模型組細(xì)胞LDH 釋放量和PI攝取明顯高于正常對(duì)照組,而梔子苷各組均顯著減少了LDH 釋放和PI 攝取,且在LPS誘導(dǎo)下,NLRP3炎癥小體和Caspase-1細(xì)胞焦亡信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白及其下游蛋白表達(dá)明顯升高,細(xì)胞上清中炎癥因子IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6 明顯上調(diào),表明LPS 激活了Caspase-1 細(xì)胞焦亡的信號(hào)通路。梔子苷各組抑制了NLRP3炎癥小體和Caspase-1細(xì)胞焦亡信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白及其下游蛋白表達(dá),且減少了炎癥因子 IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6分泌,說(shuō)明梔子苷對(duì)Caspase-1細(xì)胞焦亡信號(hào)通路具有抑制作用。
綜上所述,梔子苷可能通過(guò)下調(diào)NLRP3 炎癥小體表達(dá),從而抑制Caspase-1 細(xì)胞焦亡信號(hào)通路激活,進(jìn)一步減少炎癥因子釋放和細(xì)胞死亡,故梔子苷為臨床炎癥性疾病治療提供了新思路,值得進(jìn)一步研究。