沈立軍 朱雪梅 邱玉華 （蘇州大學生物醫(yī)學研究院，蘇州 215123）

蛋白質(zhì)組學是以體系中所有蛋白質(zhì)為研究對象，然后進行定性、定量及相互作用分析，進而揭示蛋白質(zhì)功能的一門學科。通過蛋白質(zhì)組學能夠找出兩個甚至多個蛋白質(zhì)間相互作用的關(guān)系。其中Label-free 無標記定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)是一種通過觀察離子強度變化，測量兩個或更多樣本間表達差異蛋白的技術(shù)。Label-free 方法與其他定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)相比，無須標記，應用廣泛，不受比較樣品數(shù)限制，靈敏度高，重復性好，操作簡便。近年來，隨著先進的高通量、高靈敏和快速掃描質(zhì)譜儀的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)分析鑒定技術(shù)已廣泛應用于生命科學研究領(lǐng)域［1-2］。

B7-1（即CD80）分子是活化T 細胞的信號分子之一，主要表達于抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APCs）表面，其與相應受體 CD28 結(jié)合可介導T細胞活化，為促使T-B細胞間的相互作用提供了重要的分子基礎，從而有效地維持了機體在正常生理狀態(tài)下的自我免疫應答［3-5］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，B7-1特異性抗體通過與APCs 表面表達的B7-1 分子相互結(jié)合，阻斷或減弱B7-1-CD28 間的傳遞通路，抑制T 細胞增殖、促進凋亡、減少細胞因子的產(chǎn)生和分泌，抑制T-B 細胞間的黏附，進而抑制T 細胞介導的體液免疫應答等［6］。故此類免疫干預方法對由于免疫應答異常而引起的疾病，如自身免疫病、超敏反應和移植排斥等均具有潛在的研究和治療意義。

研究結(jié)果表明，B7-1 分子可在人B 系惡性腫瘤細胞株中高表達，是參與T 細胞活化增殖必需的信號分子之一，推測該分子可能參與腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及逃逸，與多種B系腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7-9］。本文通過注射雜交瘤細胞誘導小鼠產(chǎn)生腹水，采用Protein A 層析技術(shù)，制備鼠抗人B7-1 單克隆抗體（命名為4E5），通過將該抗體與人B 系腫瘤細胞Daudi 共同培養(yǎng)，觀察和分析其對腫瘤細胞體外生長和增殖的影響，在此基礎上，通過Label-free定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究小鼠抗人B7-1 單克隆抗體抑制Daudi 細胞增殖的信號通路及機制，旨在探究B7-1 表達于B 系腫瘤表面的意義，從宏觀角度為B系惡性腫瘤的發(fā)病機制、治療及預后提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級雌性裸鼠（BALB/c，3~5 周齡）購自上海實驗動物中心；雜交瘤細胞株為本實驗室自行制備并保存；Daudi 細胞購自ATCC 細胞庫；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Hyclone；胰酶購自 Mediatech；DMSO、Pristane 均購自 Sigma-Aldrich；DTT、IAA、尿素、NaHCO3均購自 Sigma；甲醇、乙醇、甲酸、蛋白酶抑制劑、乙腈均購自Thermo Fisher；MTT購自BD公司；Protein A親和層析柱購自Merck；山羊抗小鼠 IgG-PE 購自 eBioscience；蛋白純化儀購自GE；多功能超聲儀購自Sonics；真空濃縮儀購自Eppendorf；酶標儀購自Molecular Devices；流式細胞儀購自BD 公司；Orbitrap Fusion Lumos 三合一超高分辨質(zhì)譜儀購自Thermo Fisher。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 復蘇能穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-1 單抗的雜交瘤細胞株，向培養(yǎng)皿中加入含10 ml/L FBS的RPMI1640 培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)皿置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 抗體的制備與純化 腹腔注射0.5 ml Pris?tane，使裸鼠致敏。離心收集生長狀態(tài)良好的雜交瘤細胞，重懸并計數(shù)。向已致敏的裸鼠腹腔內(nèi)注入細胞（1×107個/只），輕按裸鼠腹部，7~10 d 后腹水即可形成。抽取腹水，3 000 r/min 離心10 min，收取上清，以PBS等體積稀釋，采用Protein A免疫層析法進行抗體純化，過濾除菌后進行濃度和活性檢測。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測抗體活性 收集Daudi 細胞懸液于15 ml 離心管，1 200 r/min 室溫離心5 min，棄上清，PBS 重懸細胞并計數(shù)，吸取1×106個細胞至離心管，每管加入0.2 μg 4E5 mAb 混勻，4 ℃孵育45 min，用 含 10 ml/L FBS 的 PBS 洗 滌 細 胞 3 次 ，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 重懸，加入熒光標記的山羊抗小鼠IgG，4 ℃避光孵育染色30 min。流式細胞儀定量分析4E5 mAb 與細胞膜分子B7-1的結(jié)合。

1.2.4 MTT 法檢測細胞增殖 Daudi 細胞接種于96 孔培養(yǎng)板（5×104個/孔），實驗分為 3 組：①4E5 mAb 組（5、10、20、40 μg/ml）；②同型IgG 組：等劑量的同源型IgG1 抗體；③空白對照組。培養(yǎng)48 h 后，每孔加入 10 μl MTT（5 mg/ml），作用 4 h 后，加入150 μl DMSO 溶液溶解結(jié)晶。讀取酶標儀570 nm波長處的吸光度值（即A 值），記錄結(jié)果繪制細胞生長曲線圖。

1.2.5 質(zhì)譜樣本的處理和收集 收集處理好的Daudi 細胞，用預冷的PBS 洗滌2 次。細胞中加入含8 mol/L 尿素、1%蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液進行超聲裂解，離心取上清。向蛋白質(zhì)溶液中加入終濃度為 5 mmol/L 的DTT，60 ℃條件下孵育30 min 進行還原。加入15 mmol/L 的IAA 烷基化。然后向上述體系中加入25 mmol/L 的NH4HCO3溶液置換出尿素。將胰蛋白酶和蛋白按1∶50的質(zhì)量比加入胰酶，37 ℃酶切過夜。將10%TFA 加入消化后的樣本終止消化，BCA 測定蛋白濃度。將該樣品溶液過C18除鹽小柱后收集濾液，在離心濃縮儀中常溫旋干。

1.2.6 質(zhì)譜檢測 除鹽純化后的多肽樣品通過Orbitrap Fusion Lumos 三合一質(zhì)譜儀進行檢測。設置質(zhì)譜檢測分析條件：陽離子采集模式；一級質(zhì)譜掃描分辨率為60 000；高能碰撞解離（HCD）設置為15；二級質(zhì)譜碰撞能量為30%。自動采集各多肽信息，獲得其二級譜圖。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 將UniProt 人源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（更新于2021 年1 月 4 日）導入Proteome Discoverer 2.2（Thermo Fisher）軟件，將MS/MS圖譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫進行檢索，檢索方法參考文獻［10］，基于Labelfree定量（LFQ）在軟件中表示為肽量化蛋白質(zhì)豐度，將 4E5 mAb 組與同型 IgG 組均值比值≥2.0 且P<0.05 定義為蛋白表達量上調(diào)，比值≤0.5 且P<0.05定義為蛋白表達量下調(diào)。

1.2.8 平行反應監(jiān)測（parallel reaction monitoring，PRM）靶向驗證 選擇蛋白表達量上調(diào)最顯著的5個蛋白（P63218、O14813、P62861、Q9H0D6、O75340）和下調(diào)最為顯著的 5 個蛋白（O43708、P35998、Q8N4Q1、Q81YS1、Q13526）進行蛋白提取，利用Skyline（v. 3.6）軟件進行PRM 靶向驗證。參數(shù)設置：蛋白酶為胰蛋白酶，最多允許2 次漏切位點；分析肽段長度：4~50 個氨基酸；固定氨基酸修飾：半胱氨酸烷基化、乙?；把趸?。

2 結(jié)果

2.1 鼠抗人B7-1 單克隆抗體4E5 的制備純化 將雜交瘤細胞注射入裸鼠腹腔后，10 只裸鼠均形成腹水，經(jīng)Protein A 柱純化抗體，共收集抗體洗脫液10.2 ml，中和過濾后測定蛋白濃度為3.83 mg/ml。

2.2 單克隆抗體4E5 活性鑒定 利用流式細胞術(shù)鑒定純化后的抗體活性，結(jié)果顯示，抗人B7-1 單克隆抗體4E5 與Daudi 細胞的陽性結(jié)合率為93.7%（圖1），純化后的抗體具有B7-1抗原結(jié)合活性。

圖1 4E5與Daudi細胞表面B7-1的結(jié)合率（陽性率）Fig.1 Binding rate of 4E5 mAb to membrane B7-1 of Daudi（Positive rate）

2.3 單克隆抗體4E5對Daudi細胞增殖的影響 將4E5抗體加入Daudi細胞中培養(yǎng)48 h，MTT 法檢測結(jié)果顯示，當抗體終濃度為20、40 μg/ml 時，4E5 mAb對Daudi 細胞增殖的抑制率分別為（23.52±1.25）%和（30.84±1.09）%（P<0.05，P<0.01，圖2）。表明4E5 mAb可明顯抑制Daudi腫瘤細胞的增殖。

圖2 單克隆抗體4E5體外抑制Daudi細胞的增殖Fig.2 Inhibitory effect of 4E5 mAb on proliferation of Daudi in vitro

2.4 質(zhì)譜分析結(jié)果 單克隆抗體4E5 處理Daudi細胞后的分泌蛋白經(jīng)Label-free定量蛋白技術(shù)分析，共獲得605 122 個二級質(zhì)譜譜圖數(shù)，其中與肽段相匹配的譜圖數(shù)為25 362 個，有8 076 個肽段被鑒定，唯一肽段總數(shù)為7 747 個，蛋白質(zhì)總數(shù)為1 705 個，如圖 3A 所示。以差異倍數(shù)≥2 或≤0.5，且P<0.05 作為參考標準篩選差異蛋白，與IgG 組細胞相比，4E5組細胞中共鑒定出169個差異表達蛋白，其中131個蛋白顯著上調(diào)，38 個蛋白顯著下調(diào)（圖3B）；如圖3C所示，紅點在差異蛋白火山圖中代表上調(diào)蛋白，藍點代表下調(diào)蛋白，黑點代表在兩組樣本中未發(fā)生顯著變化的蛋白；熱圖如圖3D 所示，圖中呈現(xiàn)的為上調(diào)和下調(diào)最顯著的5 個蛋白；在這169 個差異表達蛋白中，涉及細胞增殖負調(diào)控的有11 個，涉及正調(diào)控的有1個，差異蛋白聚類熱圖如圖3E所示。

圖3 蛋白定性結(jié)果Fig.3 Results of qualitative identification of protein

2.5 PRM 靶向驗證 采用靶向PRM 方法對肽段標志物進行驗證，比較分析高分辨率質(zhì)譜采集的10個表達差異最顯著的蛋白和PRM 定量準確性，結(jié)果如表1 所示，證實PRM 的結(jié)果與蛋白組學的結(jié)果具有一致性。

表1 PRM驗證差異表達蛋白Tab.1 PRM was used to verify differentially expressed proteins

2.6 差異表達蛋白的基因本體（gene ontology，GO）注釋分析 GO 分析結(jié)果顯示，差異蛋白主要參與線粒體翻譯的延伸和終止、細胞增殖、mRNA 的加工、剪接和翻譯、細胞內(nèi)蛋白運輸、正轉(zhuǎn)錄調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體間的囊泡運輸、基因表達的正調(diào)控等生物學過程；差異蛋白主要定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體、核質(zhì)等細胞器，其中大部分分布在線粒體附近；在分子功能方面，差異蛋白主要涉及調(diào)節(jié)核苷及GTP連接、調(diào)控激酶活性等，見圖4。

圖4 差異表達蛋白在細胞成分、分子功能及生物學過程的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins involved in cell component，molecular function and biological process

2.7 KEGG 通路分析 采用KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異表達蛋白進行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與212 條信號通路，其中與腫瘤細胞增殖密切相關(guān)的信號通路主要有 PI3K-Akt、Ras、DNA replication、AMPK、mTOR、Hippo、VEGF、FoxO、Metabolic 等，見表2。

表2 KEGG通路分析與Daudi增殖相關(guān)的差異表達蛋白注釋Tab.2 Annotation of differentially expressed proteins associated with proliferation of Daudi-related KEGG pathways

3 討論

本研究利用能穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-1 mAb 的雜交瘤細胞株注射小鼠腹腔，誘導小鼠產(chǎn)生腹水［11-12］。采用Protein A 免疫親和層析法純化抗體，并通過流式細胞術(shù)鑒定抗體的純度和活性，證實B7-1 抗體具有高特異性。

研究表明，特異性抗體具有抑瘤效應［13-14］。本研究在獲取B7-1 mAb 的基礎上，為探討B(tài)7-1 在腫瘤細胞中表達的意義，以腫瘤細胞Daudi（天然高表達B7-1 分子）為實驗對象，進行一系列研究。通過MTT 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該抗體通過與相應抗原分子B7-1 結(jié)合后在一定程度上抑制了腫瘤細胞增殖，表明腫瘤細胞表面分子B7-1 可能在腫瘤細胞的生長和增殖過程中發(fā)揮重要作用。

為進一步探討B(tài)7-1 分子參與細胞增殖的機制，本文采用Orbitrap Fusion Lumos 三合一超高分辨質(zhì)譜儀分析了小鼠抗人B7-1 單克隆抗體4E5 抑制Daudi 細胞增殖的蛋白質(zhì)水平，兩組細胞中共鑒定出1 705個蛋白，其中有169個差異表達蛋白。在這些差異表達蛋白中，131個蛋白表達上調(diào)，38個蛋白表達下調(diào)，涉及細胞增殖負調(diào)控的有11 個，正調(diào)控的有1個。差異表達的蛋白無疑對抑制腫瘤細胞的增殖發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明，參與腫瘤細胞增殖調(diào)控的代表性差異蛋白有P63218、O14813、P62861、Q9H0D6、O75340、O43708、P35998、Q8N4Q1、Q81YS1、Q13526，部分代表性差異蛋白與腫瘤細胞增殖的關(guān)系已有報道［15-17］。PRM 靶向蛋白質(zhì)組學技術(shù)利用高分辨率、高精度分析器采集目的肽段的所有碎片離子信息，而后選擇性定量分析目標蛋白質(zhì)、目標肽段，可更好地排除各種干擾因素，具有更好的高效性、準確性和靈敏度，是蛋白質(zhì)組學最理想、最有效的驗證手段［18-21］。本研究對5 個代表性上調(diào)差異蛋白和5 個代表性下調(diào)差異蛋白，采用PRM 手段進行靶向驗證，結(jié)果證實蛋白組學結(jié)果與靶向PRM 結(jié)果一致。

GO 注釋和KEGG 信號富集分析在生物信息學應用中發(fā)揮重要作用［22］。通過GO注釋發(fā)現(xiàn)，4E5封閉的B系腫瘤細胞的差異表達蛋白主要定位于細胞器，其中又以線粒體附近最多；參與線粒體的翻譯、延伸和終止，細胞增殖，mRNA的加工、剪接和翻譯，細胞內(nèi)蛋白運輸，正轉(zhuǎn)錄調(diào)控等；參與29 個代謝途徑，其中與細胞內(nèi)部分子轉(zhuǎn)運、受體活性、線粒體功能、GTP結(jié)合活性等密切相關(guān)。線粒體基因（mtDNA）表達異?？梢鹁€粒體能量代謝障礙，進而引起神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腫瘤等的發(fā)生［23-24］。結(jié)果顯示，4E5 組細胞中線粒體相關(guān)基因（MRPL58、MRPS35、ANXA6、CLPB、TPP1、NDUFA8、BNIP1、UQCRH 等）表達發(fā)生變化，提示線粒體結(jié)構(gòu)及功能異常可引起一系列的損傷過程，進而抑制腫瘤細胞增殖。

KEGG 通路富集結(jié)果顯示4E5 封閉B 系腫瘤細胞可影響多個信號通路，其中與腫瘤細胞增殖密切相關(guān)的主要包括AMPK、PI3K-Akt、mTOR、Ras、DNA replication、Hippo、VEGF、FoxO、Metabolic 信號通路。AMPK 是參與能量代謝調(diào)節(jié)和多種信號傳導通路的關(guān)鍵分子之一，其在腫瘤快速增殖的新陳代謝過程中發(fā)揮抑制作用，因此，AMPK 蛋白是各種相關(guān)疾病研究的熱點［25］。KANG 等［26］發(fā)現(xiàn)石斑魚在受到溶藻菌感染時，宿主發(fā)生免疫反應，CD80（B71）、P13KAkt 等表達升高刺激免疫細胞增殖，同時，具有抑制細胞增殖作用的AMPK 表達降低，幫助宿主抵御微生物病原體的侵襲。KOVACH 等［27］發(fā)現(xiàn) CD80 配體和VEGF 抗體的聯(lián)合用藥在減少大鼠成骨細胞（OSA）異常增殖方面比任何一種抗體單獨用藥更為有效，VEGF 抗體靶向性OSA 細胞表面的VEGF 抗原，配體CD80 與細胞表面的CTLA-4 受體反應從而共同誘導腫瘤細胞凋亡。竇春鵬等［28］發(fā)現(xiàn)DC 經(jīng)K-ras 突變多肽修飾后，可促進DC 表面成熟分子（CD80、CD83、CD86、HLA-DR、CD1a）高表達，進而促進DC成熟，增加CIK的增殖及對胰腺癌細胞的殺傷作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，4E5 組細胞中通過封閉人B 系腫瘤細胞 Daudi 表面的 B7-1 分子導致 AMPK 信號通路發(fā)生變化，從而抑制了腫瘤細胞的快速增殖。此外，在腫瘤細胞增殖過程中發(fā)揮極其重要生物學功能的信號通路PI3K/Akt/mTOR、Ras、DNA replication、Hippo、VEGF、FoxO 等也發(fā)生了顯著變化，提示4E5 也可通過其他信號通路抑制腫瘤細胞的增殖和生存，其機制有待后續(xù)探究。

綜上所述，本研究通過Label-free定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選出了特異性鼠抗人B7-1 單抗處理B 系腫瘤細胞Daudi后的差異蛋白，并分析了其GO 功能與KEGG 富集通路，揭示了差異蛋白參與的生物學功能及信號通路，從一定程度上為B 系腫瘤的診斷和治療方案提供了研究方向和理論依據(jù)。