張桓瑜，江旖婷，朱曉晨，何智妍，周 薇，宋忠臣

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院牙周病科，上海交通大學口腔醫(yī)學院，國家口腔醫(yī)學中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海 200011；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔微生態(tài)與系統(tǒng)性疾病實驗室，上海交通大學口腔醫(yī)學院，國家口腔醫(yī)學中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海 200125

牙周炎是一種口腔慢性感染性疾病，是由微生物和宿主之間的反應失衡引起，臨床表現(xiàn)為牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙松動移位等癥狀，嚴重的可引起牙齒脫落，是導致成人牙齒喪失的主要原因之一［1］。牙周炎不僅僅危害口腔健康，牙周致病菌以及它們的代謝產物造成的炎癥狀態(tài)以及引起的機體免疫應答可能會造成全身系統(tǒng)性的變化。據(jù)報道，牙周炎與糖尿病、心血管疾病、胃腸道腫瘤以及阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD） 等多種疾病相關［2-3］。牙周炎作為一種炎癥性疾病，其持續(xù)的炎癥狀態(tài)，會引起低度全身性炎癥，進一步將導致中樞神經系統(tǒng)的炎癥［4］。

牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌的主要毒力因子牙齦素（gingipain）是存在于牙齦卟啉單胞菌外膜、膜泡或胞外的一組蛋白酶，具有強大的蛋白質降解功能［5］。根據(jù)組成結構的不同，牙齦素可分為2種：一種是精氨酸特異性牙齦素（arginine-gingipain，Rgp），另一種是賴氨酸特異性牙齦素（lysine-gingipain，Kgp），分別由編碼半胱氨酸蛋白酶的Rgp和Kgp基因編碼［6］。牙齦素可以與宿主上皮細胞和其他致病菌結合，為牙齦卟啉單胞菌的黏附和定植提供生理基礎［7-8］；并通過蛋白水解作用，產生多肽鏈或氨基酸作為牙齦卟啉單胞菌的能量來源，且通過直接切割纖維蛋白原或激活基質金屬酶系統(tǒng)，使得膠原纖維降解，從而導致局部牙齦出血和組織損害［9-11］；此外，牙齦素還可以導致局部炎癥反應失調［12-13］。牙齦素參與牙齦卟啉單胞菌的多種致病過程，提示其可能在牙周炎與全身系統(tǒng)性疾病的關系中發(fā)揮重要作用。

神經炎癥是神經退行性病變的主要病理特征之一，腦內持續(xù)分泌的炎癥因子會誘發(fā)神經損害。NONAKA 等［14］采用牙齦卟啉單胞菌以及牙齦素抑制劑進行動物實驗發(fā)現(xiàn)，牙齦素可能通過激活小膠質細胞，引發(fā)神經炎癥反應。但上述學者采用的是牙齦卟啉單胞菌建立的模型。本研究擬從牙齦卟啉單胞菌中提取牙齦素，通過向小鼠腹腔注射牙齦素提取物，更為直觀地觀察牙齦素對小鼠神經炎癥的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞 8 周齡健康雄性C57BL/6N小鼠60 只，體質量20～25 g，購買自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（浙）2019-0001，使用許可證號為SYXK（滬）2020-0025。小鼠飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境中，環(huán)境溫度（25±2）°C，濕度40%～70%，12 h 明暗交替，并允許其自由獲取食物和水。

牙齦卟啉單胞菌ATCC33277，由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔微生態(tài)與系統(tǒng)性疾病實驗室提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 Kgp抑制劑COR388（天津藥明康德新藥開發(fā)有限公司），Kgp 抗體及Rgp 抗體（Biorbyt，英國），Kgp熒光底物Z-His-Glu-Lys-MCA、Rgp熒光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA（吉爾生化上海有限公司），離子鈣適配分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）抗體（Arigo Biolaboratories，中國臺灣），神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（Abcam，美國），SuperSignal West Atto超敏化學發(fā)光底物（Thermo Fisher Scientific，美國）， 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）。

1.2 牙齦素提取

本研究采用PATHIRANA 等［15］的方法，從牙齦卟啉單胞菌ATCC33277 中提取牙齦素。具體方法如下：①將平板上牙齦卟啉單胞菌單克隆轉至液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3 代時，將細菌傳至800 mL 培養(yǎng)基，厭氧箱培養(yǎng)36～48 h。②將細菌培養(yǎng)液離心（4 ℃，7 500×g，30 min），收取細菌沉淀。③用PG 緩沖液［pH 8.0，內含50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2和5 mmol/L Cys-HCl］洗滌細菌沉淀2 次。④將洗滌后的細菌重懸于PG 緩沖液中，使用超聲破碎儀進行超聲處理40 min，輸出功率為50%，工作期與間歇期各5 s 交替進行。⑤將超聲破碎后的提取物離心（4 ℃，7 500×g，30 min），收集上清液。⑥將收集的上清液進行超速離心（4 ℃，190 000×g，1 h），收集上清液。⑦使用超濾管（截留分子量為30 000）對超速離心后的上清液進行超濾（4 ℃，5 000×g，1 h）。⑧收集超濾后的產物，儲存于-80°C的環(huán)境中。

1.3 牙齦素提取物鑒定

采用蛋白質印跡法（Western blotting）對牙齦素提取物進行鑒定。對提取到的牙齦素進行蛋白定量，用100 μg 樣品進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離蛋白質，采用濕轉法，恒流300 mA 條件下轉膜90 min。轉膜完成后，將PVDF 膜清洗，用5%的牛奶封閉液將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于搖床上室溫條件下封閉1 h。隨后將一抗用稀釋液按相應比例稀釋（Kgp 抗體1∶2 000；Rgp 抗體1∶200），將PVDF 膜與稀釋后的一抗放入4 ℃冰箱里的搖床上孵育過夜。將辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗用含0.1%吐 溫-20 的1×Tris-HCl 緩 沖 鹽 溶 液（Tris-Buffered Saline with Tween-20，TBST）溶液按1∶5 000 的比例稀釋，加入孵育盒中，搖床上室溫慢搖1 h。棄去二抗孵育液，用1×TBST溶液洗3次，每次5 min。將顯影試劑盒中的A 液與B 液以1∶1 比例混勻，加入適當體積去離子水稀釋配制顯色液，將PVDF 膜的蛋白面朝上并滴加顯色液，室溫下避光孵育，采用化學發(fā)光儀檢測蛋白。

1.4 腹腔注射牙齦素提取物建立小鼠牙齦素急性感染模型及實驗分組

將40 只8 周齡C57BL/6N 小鼠隨機分為4 組，每組10只。牙齦素組：小鼠腹腔注射牙齦素提取物，劑量為14 μg/只（以牙齦素活性部位濃度計算）；牙齦素＋COR388 組：小鼠腹腔注射COR388（3 mg/kg），1 h 后腹腔注射牙齦素提取物（劑量同牙齦素組）；COR388 組：小鼠腹腔注射等量COR388（3 mg/kg）；對照組：小鼠腹腔注射等量PG緩沖液。

1.5 牙齦素活性檢測

將20 只8 周齡C57BL/6N 小鼠隨機分成5 組，每組4 只，其中4 組分別腹腔注射牙齦素提取物14 μg/只（劑量以牙齦素活性部位濃度計算）4、8、12、24 h（分別設為4 h、8 h、12 h 和24 h 組）后，將小鼠麻醉取血漿。對照組小鼠腹腔注射等量PG 緩沖液。

采用DOMINY 等［16］的方法進行小鼠血漿牙齦素活性的檢測。分別用Kgp和Rgp特異性熒光底物Z-His-Glu-Lys-MCA 及Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 檢測小鼠血漿牙齦素Kgp和Rgp的活性。37°C下，96孔板每孔加入100 μL 血漿、90 μL 緩沖液（內含100 mmol/L Tris-HCl、75 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L半胱氨酸和1%二甲基亞砜）和10 μL 熒光底物Z-His-Glu-Lys-MCA或Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，底物終濃度為10 μmol/L，采用熒光酶標儀連續(xù)檢測90 min。

1.6 免疫組織化學染色

腹腔注射牙齦素提取物24 h 后，將小鼠麻醉取材。采用4%多聚甲醛溶液固定腦組織，后續(xù)經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、烤片、染色，采用Iba1 標記腦內的小膠質細胞，GFAP 標記腦內的星形膠質細胞。染色結束后，采用LEICA 顯微鏡對每張切片進行觀察并拍攝。

1.7 ELISA檢測

取小鼠大腦皮層組織置于離心管中，按質量體積比1∶9 加入RIPA 裂解液，置于研磨儀中進行研磨，64 Hz×60 s。隨后于4 °C、12 000×g離心10～15 min，吸取上清置于離心管中待用。使用BCA法測定蛋白濃度，每孔按照100 μg的總蛋白上樣量，根據(jù)ELISA試劑盒的說明書進行操作。用酶標儀在450 nm 處測量各孔吸光度值（optical density，OD 值）并繪制標準曲線。根據(jù)OD 值計算各孔的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）的濃度。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。定量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey's 多重t檢驗（Turkey's multiple comparisons test）。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 牙齦素提取物鑒定

本研究成功從牙齦卟啉單胞菌ATCC33277 中獲得牙齦素提取物。采用Kgp和Rgp抗體對提取的牙齦素進行鑒定。如圖1A 所示，采用Kgp 抗體孵育后，可在截留分子量50 000 附近處見明顯條帶，提示為Kgp；如圖1B 所示，采用Rgp 抗體孵育后，可在截留分子量50 000和70 000附近處見明顯條帶，提示為Rgp。

圖1 牙齦素提取物鑒定Fig1 Identification of the gingipain extracts by Western blotting

2.2 牙齦素體內活性分析

采用Kgp和Rgp特異性熒光底物檢測小鼠腹腔注射牙齦素后不同時間點血漿中牙齦素（Kgp 和Rgp）的活性。如圖2A、2B 所示，腹腔注射牙齦素后，小鼠血漿牙齦素活性隨著組別時間的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢。腹腔注射牙齦素提取物8 h 后，血漿Kgp 和Rgp活性達到峰值，隨后其活性逐漸下降。在腹腔注射牙齦素提取物24 h 后，我們測試了Kgp 抑制劑COR388 對小鼠血漿Kgp 活性的作用。如圖2C 所示，COR388 能顯著抑制小鼠血漿中Kgp 的活性。上述結果表明，在腹腔注射牙齦素提取物24 h后，小鼠血漿中可以檢測到Kgp 活性，并且COR388 可以顯著抑制Kgp活性。

圖2 小鼠血漿Kgp，Rgp活性檢測及COR388對Kgp活性的抑制作用Fig 2 Detection of Kgp and Rgp activity in plasma of mice and the effects of COR388 on Kgp activity

2.3 牙齦素急性感染的小鼠大腦皮層膠質細胞變化

如圖3A 所示，與對照組相比，在牙齦素組可以看到較多體積增大，具有不規(guī)則突起的棕褐色顆粒，為被Iba1 染色的小膠質細胞，提示牙齦素組活化的小膠質細胞增多，在牙齦素+COR388 組和COR388 組僅可見少量活化的小膠質細胞。上述結果表明，急性感染牙齦素可以激活小鼠大腦皮層組織中的小膠質細胞，且這種作用可以被Kgp 抑制劑COR388 抑制。如圖3B 所示，與對照組相比，在牙齦素組可以看到較多體積增大，具有不規(guī)則突起的棕褐色顆粒，為被GFAP 染色的星形膠質細胞，提示牙齦素組活化的星形膠質細胞增多，在牙齦素+COR388 組和COR388 組僅可見少量活化的星形膠質細胞。上述結果表明，急性感染牙齦素可以激活小鼠大腦皮層組織中的星形膠質細胞，且這種作用可以被Kgp 抑制劑COR388 抑制。

圖3 牙齦素提取物對小鼠皮層組織小膠質細胞和星形膠質細胞的影響Fig 3 Effects of gingipain extracts on microglia and astrocyte in cortex of mice

2.4 牙齦素提取物對小鼠大腦皮層炎癥因子蛋白表達的影響

如圖4 所示，與對照組相比，牙齦素組小鼠大腦皮層TNF-α 和IL-1β 蛋白表達水平顯著升高（均P=0.005）；與牙齦素組相比，牙齦素＋COR388 組小鼠大腦皮層TNF-α 和IL-1β 蛋白表達水平有所下降，但差異不具有統(tǒng)計學意義。上述結果表明，牙齦素急性感染可上調小鼠大腦皮層中TNF-α 和IL-1β 蛋白表達水平，且這種變化可被Kgp 抑制劑COR388 部分抑制。

圖4 牙齦素提取物對小鼠大腦皮層炎癥因子表達的影響Fig 4 Effects of gingipain extracts on the expression of inflammatory cytokines in cortex

3 討論

AD 是一種神經退行性疾病，其主要病理特征是β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）斑塊的胞外聚集和高度磷酸化的Tau 蛋白形成的胞內神經原纖維纏結［17-18］。近來的研究表明，Aβ 是一種抗菌肽［19］，提示細菌感染可能是AD 的一個發(fā)病原因。多項流行病學研究［20-23］表明AD 與牙周炎之間存在關聯(lián)。牙齦卟啉單胞菌是主要的牙周致病菌［5］，主要位于牙周炎患者的牙周袋內，在刷牙或使用牙線時造成的暫時性菌血癥可以將牙齦卟啉單胞菌播散到身體其他部位如冠狀動脈等［24-25］。學者已經在AD 患者大腦的尸檢樣本中鑒定出牙齦卟啉單胞菌的毒力因子脂多糖［26］。此外，DOMINY 等［16］已在輕度至中度認知障礙患者的腦脊液和唾液中檢測到牙齦卟啉單胞菌的DNA。這也進一步表明牙齦卟啉單胞菌參與AD 的發(fā)生發(fā)展。牙齦素是牙齦卟啉單胞菌的毒力因子，其在牙齦卟啉單胞菌感染宿主的每個階段都發(fā)揮重要作用。DOMINY 等［16］在AD 患者尸檢的腦標本中檢測到牙齦素的存在，且牙齦素主要位于腦內與記憶密切相關的區(qū)域（如海馬回）。給已經有牙齦卟啉單胞菌腦部感染的小鼠口服牙齦素抑制劑可降低大腦中牙齦卟啉單胞菌以及Aβ的含量［16］。上述證據(jù)表明，牙齦素在AD 的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要作用。此外，神經炎癥也是AD 的主要病理特征之一，目前關于牙齦素對神經炎癥影響的報道較少。

本研究參考PATHIRANA 等［15］的實驗方法，從牙齦卟啉單胞菌ATCC33277 中提取牙齦素，采用Western blotting 對提取物進行鑒定。研究［5，27］顯示，Kgp 在截留分子量50 000 處有明顯條帶，Rgp 根據(jù)分泌后不同的切割過程，其大小一般在45 000 和105 000 之間。本研究中Rgp 大小表現(xiàn)為截留分子量50 000 和70 000，與上述報道相似。小鼠血漿Kgp 和Rgp 活性檢測證實牙齦素提取物入血且具有生物活性，提示牙齦素急性感染模型建立成功。此外，本實驗采用了DOMINY等［16］報道的針對Kgp的特異性抑制劑COR388，小鼠血漿牙齦素活性檢測結果也顯示該抑制劑能顯著抑制Kgp的活性。牙齦素入血，提示牙齦素可能通過血液循環(huán)這一途徑進入中樞神經系統(tǒng)，進而造成神經損害。據(jù)學者［16，27］報道，牙齦卟啉單胞菌感染的神經元可持續(xù)檢測到牙齦素活性，且牙齦素具有神經細胞毒性，可促進神經細胞共聚，進而促進神經元的死亡。

腦內小膠質細胞和星形膠質細胞介導的神經炎癥是AD 的主要病理特征之一［28-29］?；罨男∧z質細胞通常與AD 的主要病理標志物Aβ 的沉積有關［30］。過度活化的小膠質細胞會釋放諸如IL-6、IL-1β 的炎癥因子，這會導致Aβ 的清除受阻，而Aβ 的沉積會進一步加劇神經炎癥［31］。同時，活化的小膠質細胞會加重腦內Tau 蛋白病變，且會直接介導腦內的神經突觸喪失［32-33］。此外，活化的星形膠質細胞會導致細胞因子和炎癥介質釋放增加、神經元突觸喪失，從而促進AD 的發(fā)生發(fā)展［34］。本研究發(fā)現(xiàn)，牙齦素組小鼠大腦皮層組織由Iba1 標記的小膠質細胞和GFAP 標記的星形膠質細胞均呈激活狀態(tài)，給予牙齦素（Kgp）抑制劑COR388 可逆轉上述變化。

遺傳學和藥理學實驗表明，體內升高的TNF-α會加劇Aβ 的沉積和Tau 蛋白的病理變化［35］。IL-1β可以激活小膠質細胞和星形膠質細胞，并進一步導致中樞神經系統(tǒng)內其他促炎介質的合成［36］。本研究結果表明，腹腔注射牙齦素提取物建立的牙齦素急性感染模型可上調小鼠大腦皮層組織TNF-α、IL-1β 的表達水平，促進神經炎癥的發(fā)生發(fā)展，給予牙齦素（Kgp）抑制劑COR388可部分抑制上述變化。牙齦素急性感染造成的腦內炎癥因子表達升高可能是牙齦素感染神經系統(tǒng)的另一機制。

本實驗研究結果表明，在腹腔注射牙齦素提取物4～8 h 后，小鼠血漿牙齦素活性達到峰值，隨后逐漸下降。牙齦素作為一種蛋白酶，其活性隨時間的變化而變化，因此小鼠體內的牙齦素活性具有時間差異性。本研究主要聚焦在腹腔注射牙齦素24 h后小鼠腦內神經炎癥的變化，其他時間點小鼠體內的免疫應答需進一步探究。此外，據(jù)報道，Kgp 的毒性大于RgpB，且兩者的毒性遠遠大于RgpA［5］，因此本研究優(yōu)先采用針對Kgp 的特異性抑制劑COR388 來觀察牙齦素對小鼠腦神經炎癥的影響。不可否認的是，Rgp也具有部分致病作用，關于Rgp對小鼠腦神經炎癥的影響值得進一步探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，采用超聲破膜的方法從ATCC33277 中提取的牙齦素具有生物活性，腹腔注射牙齦素建立的小鼠牙齦素急性感染模型可激活腦內小膠質細胞和星形膠質細胞，提高大腦炎癥因子表達，即急性感染牙齦素可引發(fā)小鼠神經炎癥。牙齦素是否可以通過引發(fā)神經炎癥來進一步影響認知功能，尚需繼續(xù)深入研究。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動物實驗均已通過上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會的審核批準（審批號SH9H-2020-A220-1）。所有實驗過程均遵照《實驗動物福利倫理審查指南》的條例進行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Laboratory Animal Ethics Committee in Ninth People's Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine（Approval Letter No. SH9H-2020-A220-1，dated 2020-03-03），and all experimental animal protocols were carried out by the guidelines of Laboratory Animal-Guideline for ethical review of animal welfare.

作者貢獻/Authors'Contributions

宋忠臣、張桓瑜、周薇參與了實驗設計；張桓瑜、江旖婷、朱曉晨、何智妍、周薇、宋忠臣參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by SONG Zhongchen， ZHANG Huanyu and ZHOU Wei. The manuscript was drafted and revised by ZHANG Huanyu，JIANG Yiting，ZHU Xiaochen，HE Zhiyan，ZHOU Wei and SONG Zhongchen. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-28

·Accepted：2022-04-05

·Published online：2022-05-28