王建斌，李雪琦，王麗春，吳化葉，程繼帥，牟唐維，李琦涵

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118

生殖器皰疹是最常見(jiàn)的性傳播疾病之一[1-2]，單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus type 2，HSV-2)是其主要病原體[3]。HSV-2屬于皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科，是具有包膜的線性雙鏈DNA病毒[4]，可通過(guò)性接觸傳播或新生兒經(jīng)母體生殖道感染，大大提高了人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染及傳播的風(fēng)險(xiǎn)[5]。HSV-2感染所致疾病通常癥狀輕微或無(wú)癥狀，但對(duì)新生兒和免疫功能低下者來(lái)說(shuō)可能危及生命[6]。此外，HSV-2原發(fā)性感染后，可在骶神經(jīng)節(jié)中終身潛伏[7]，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，其周期性地在神經(jīng)節(jié)內(nèi)重激活導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染。HSV-2特異性治療藥物雖能有效控制臨床癥狀，抑制病毒增殖，但不能根除潛伏的HSV-2并控制復(fù)發(fā)感染。因此，HSV-2感染嚴(yán)重威脅著人類健康。

研究證明，HSV-2核衣殼從裝配起始至成熟主要存在A、B、C型衣殼3種形式[8-10]。A型衣殼通常為空衣殼，多見(jiàn)于核衣殼形成的起始階段。B型衣殼多為發(fā)育成熟中的衣殼，其特點(diǎn)為具有UL26.5基因編碼蛋白ICP35[11]。ICP35為衣殼支架蛋白，最初形式是衣殼支架蛋白前體ICP35cd(也稱pre-VP22a)，其肽鏈內(nèi)部含有絲氨酸蛋白酶切割位點(diǎn)(M位點(diǎn))，可被UL26基因編碼的絲氨酸蛋白酶VP24識(shí)別切割，從而產(chǎn)生衣殼支架蛋白ICP35ef(VP22a)[12]。ICP35cd較于ICP35ef在HSV-2衣殼裝配中具有更重要的作用。ICP35cd通過(guò)其自身部分聯(lián)結(jié)起始衣殼的裝配，其C端還形成一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，可特異作用于UL19編碼的主要核衣殼蛋白成分VP5，促使VP5圍繞ICP35cd進(jìn)行裝配形成復(fù)合物，再由ICP35cd的核定位信號(hào)指導(dǎo)該復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核聚合形成支架[13]。此外，ICP35cd與UL6基因編碼蛋白之間的相互作用在衣殼形成、DNA進(jìn)入過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。最后，ICP35cd被磷酸化和水解，形成衣殼支架蛋白ICP35ef。當(dāng)DNA分子進(jìn)入B型衣殼后，衣殼內(nèi)的ICP35ef解體出殼，形成成熟衣殼——C型衣殼。早有研究表明，缺失UL26.5基因的HSV，其大量子代病毒顆粒的衣殼裝配失敗，不能形成新的成熟病毒顆粒，或者形成的病毒顆粒毒力大大減弱[14-15]。鑒于UL26.5 基因編碼蛋白ICP35在HSV衣殼裝配中的消長(zhǎng)特性[即僅在早期(裝配起始未形成成熟衣殼)出現(xiàn)，后期(形成成熟衣殼)消失]及重要作用，進(jìn)一步探討HSV-2 UL26.5基因功能可以為研究蛋白相互作用、病毒與宿主的相互作用以及篩選藥物靶標(biāo)等工作提供支持。本研究對(duì)HSV-2衣殼支架蛋白ICP35進(jìn)行原核表達(dá)、抗體制備，并分析其在病毒增殖中的表達(dá)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

人陰道上皮細(xì)胞VK2/E6E7購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所病毒免疫室凍存，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(5% CO2)中培養(yǎng)。HSV-2(HG52株)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所病毒免疫室擴(kuò)增并保存。大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。pET-32a(+)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、DL 15 000 DNA Marker、基因擴(kuò)增試劑盒PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GC Buffer購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，AxyPrep 體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司，TIANGEN 通用型DNA純化回收試劑盒、TIANGEN無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Peroxidase-conjugated AffiniPure Sheep Anti-Rabbit IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，Alexa Fluor?488 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)、4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)HSV-2 UL26.5基因序列(Gene ID：1487311)及原核表達(dá)載體pET-32a(+)的多克隆位點(diǎn)，利用DNAMAN軟件進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析，本研究選用EcoR I、HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，正向引物加入EcoR I酶切位點(diǎn)，引物序列為5′-ATAGAATTCA-TGAACCCCGTTTCGGCATC-3′；反向引物加入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，引物序列為5′-GCGAAGCT-TTTTATTTAAAATATATGAAAACACACA-3′。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用去離子水稀釋至工作濃度10 μmol/L，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HSV-2基因組提取及目的基因擴(kuò)增HSV-2基因組提取采用AxyPrep 體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒，UL26.5基因擴(kuò)增采用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GC Buffer試劑盒，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火10 s，68 ℃延伸75 s，40個(gè)循環(huán)后4 ℃保持。PCR結(jié)束后，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化、酶切及原核表達(dá)載體的構(gòu)建和篩選UL26.5的PCR產(chǎn)物純化采用TIANGEN通用型DNA純化回收試劑盒，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)。利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ對(duì)UL26.5及表達(dá)載體 pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切，以備后續(xù)連接。反應(yīng)體系為：EcoR I 5 μL，Hind Ⅲ 5 μL，DNA 5 μg，CutSmart Buffer(10×)25 μL，用不含RNase 的雙蒸水加至250 μL。反應(yīng)條件：37 ℃水浴酶切1 h。將純化后獲得的雙酶切目的 DNA片段UL26.5與載體DNA按約摩爾比3∶1結(jié)合，16 ℃連接過(guò)夜，然后取5～10 μL用于大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α的轉(zhuǎn)化，篩選重組質(zhì)粒，并將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-UL26.5。

1.2.4 HSV-2 ICP35重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及兔多克隆抗體的制備將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞 BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化菌涂布于含60 μg/mL氨芐西林的LB平板，倒置培養(yǎng) 16 h；挑取攜帶重組質(zhì)粒的單克隆菌落，接種于氨芐西林抗性的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；次日，按1∶50的比例接種于氨芐西林抗性的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng) 6～8 h，當(dāng)OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，向菌液中加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG溶液，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h；將所得菌液全部收集到50 mL離心管中，用溶菌酶處理菌體沉淀，分離上清及沉淀，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)觀察蛋白表達(dá)情況，并通過(guò)改變IPTG濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間來(lái)確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。根據(jù)重組蛋白表達(dá)的情況，本研究采用碧云天His標(biāo)簽蛋白產(chǎn)物純化試劑盒純化蛋白，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)。將表達(dá)純化的HSV-2 ICP35重組蛋白定量，與完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑按1: 1的比例混勻，室溫緩慢振蕩2 h，直至形成均一的油包水乳化劑，免疫新西蘭大白兔，每次2 mg /只，共3次。免疫期滿，頸動(dòng)脈采血，分離血清，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)兔血清抗體的產(chǎn)生情況，并通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)HSV-2 ICP35在HSV-2增殖中的表達(dá)特性將人陰道上皮細(xì)胞VK2/E6E7預(yù)鋪在細(xì)胞爬片上，待細(xì)胞匯合率約為80%，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為1接種HSV-2，于感染0、4、8、12、16、20 h后收集樣品。取出細(xì)胞爬片，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，4%多聚甲醛固定30 min；吸去固定液，用0.01 mol/L PBS洗3次，每次 5 min；用0.2% Triton X-100/PBS透化5 min，蒸餾水洗1次；用冰丙酮∶甲醇(體積比 7∶3)作用5 min，0.01 mol/L PBS 洗3次，每次 5 min；吸去多余水分，以4%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)37 ℃封閉30 min；棄封閉液，加一抗，于濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜；次日用0.01 mol/L PBS 洗3次，每次5 min；加熒光標(biāo)記二抗，37 ℃避光反應(yīng)30 min；用0.01 mol/L PBS 洗3次，每次 5 min；用蒸餾水洗1次，DAPI復(fù)染5 min，用PBS洗3次，每次5 min；分別用85%、95%、100%乙醇梯度脫水，每次1 min，最后一個(gè)乙醇梯度脫水2次，每次1 min；最后用熒光抗淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 HSV-2 UL26.5基因的PCR擴(kuò)增

以提取的HSV-2基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增UL26.5基因。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)加入EcoR I、Hind Ⅲ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并且在每條引物的5′ 端加入3 bp的隨機(jī)保護(hù)堿基，因此產(chǎn)物大小約為 1 065 bp。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 HSV-2 UL26.5重組質(zhì)粒的篩選及鑒定

利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ對(duì)HSV-2 UL26.5基因的PCR產(chǎn)物及原核表達(dá)載體 pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物純化回收，16 ℃連接過(guò)夜，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選重組質(zhì)粒。結(jié)果如圖2A所示，可見(jiàn)比空載體pET-32a(+)大的質(zhì)粒。對(duì)篩選得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序和酶切鑒定，大小符合雙酶切后的目的DNA片段與載體(見(jiàn)圖2B)。測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中UL26.5基因的序列完全一致，表明載體構(gòu)建成功，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-UL26.5。

2.3 HSV-2 ICP35重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將pET-32a(+)-UL26.5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞 BL21(DE3)，挑取單克隆，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG溶液，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，收集菌體沉淀，用溶菌酶處理，分離上清及沉淀，進(jìn)行12% SDS-PAGE。結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)處理的菌體裂解上清約在相對(duì)分子質(zhì)量為6.3×104處有一蛋白條帶(見(jiàn)圖3A3)，與衣殼支架蛋白ICP35融合了His標(biāo)簽后的重組蛋白一致，而在IPTG誘導(dǎo)處理的菌體裂解沉淀(見(jiàn)圖3A4)及IPTG未誘導(dǎo)處理的菌體裂解上清(見(jiàn)圖3A1)和沉淀(見(jiàn)圖3A2)中未見(jiàn)到該條帶。轉(zhuǎn)化pET-32a(+)空載體的BL21(DE3)菌體裂解上清約在相對(duì)分子質(zhì)量為2.5×104處有一標(biāo)簽蛋白條帶(圖3A5)。結(jié)果表明，ICP35重組蛋白以可溶性蛋白存在于菌體裂解上清中。采用抗His標(biāo)簽蛋白的抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果表明ICP35重組蛋白得到成功表達(dá)(見(jiàn)圖3B)。

M: DL 5 000 DNA Marker; 1 and 2: HSV-2 UL26.5 gene amplified by PCR.

2.4 HSV-2 ICP35重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

為獲得較高豐度的ICP35重組蛋白，本研究通過(guò)改變IPTG濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間來(lái)確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。首先，在37 ℃條件下加入IPTG至其終濃度為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，SDS-PAGE結(jié)果表明IPTG未誘導(dǎo)組無(wú)ICP35重組蛋白產(chǎn)生，其他IPTG濃度誘導(dǎo)組重組蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異，因此選擇IPTG終濃度0.2 mmol/L為最佳誘導(dǎo)濃度(見(jiàn)圖4A)。確定了最佳IPTG誘導(dǎo)濃度后，設(shè)置33 ℃、35 ℃及37 ℃為培養(yǎng)菌液溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)33 ℃組ICP35重組蛋白表達(dá)量較低，而35 ℃組與37 ℃組重組蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖4B)，因此選擇37 ℃為重組蛋白表達(dá)的最適溫度。在IPTG終濃度為0.2 mmol/L、37 ℃ 條件下，設(shè)置不同菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別誘導(dǎo)培養(yǎng)4、6、8 h重組蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖4B)，因此選擇4 h為誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白的最適時(shí)間。

M: Protein Marker; A1-6: 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L IPTG-induced supernatant of pET-32a(+)-UL26.5-transformed E.coli; A7 and B7: 0.2 mmol/L IPTG-induced supernatant of pET-32a(+)-transformed E.coli; A8 and B8: 0.2 mmol/L IPTG-induced precipitation of pET-32a(+)-transformed E.coli; B1-3: Induction at 33 ℃, 35 ℃ and 37 ℃, respectively; B4-6: Induction for 4, 6, 8 h, respectively.

2.5 HSV-2 ICP35重組蛋白的純化及兔免疫血清的蛋白免疫印跡檢測(cè)

確定ICP35重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件后，對(duì)其進(jìn)行大量表達(dá)并純化。結(jié)果如圖5A所示，ICP35重組蛋白經(jīng)純化后洗脫產(chǎn)物單一，純度高。將純化的HSV-2 ICP35重組蛋白定量后與佐劑混勻，多部位(肌肉、頸、脊部皮下、腹股溝)免疫新西蘭大白兔3次，ELISA檢測(cè)免疫后兔血清抗體效價(jià)為1∶32 768。為檢測(cè)免疫兔血清的抗體產(chǎn)生情況及所產(chǎn)抗體能否特異性識(shí)別HSV-2感染過(guò)程中的衣殼支架蛋白ICP35，首先將HSV-2濃縮純化，提取HSV-2顆粒蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE及蛋白免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果如圖5B所示，經(jīng)HSV-2 ICP35重組蛋白免疫后，新西蘭大白兔能夠產(chǎn)生識(shí)別HSV-2感染過(guò)程中衣殼支架蛋白前體ICP35cd及衣殼支架蛋白ICP35ef的抗體，為后續(xù)采用免疫熒光分析HSV-2 ICP35在病毒增殖中的表達(dá)特性奠定了基礎(chǔ)。

M: Protein Marker; A1: Unpurified ICP35 recombinant protein; A2: Purified ICP35 recombinant protein; B1: Immunized rabbit serum by ICP35 recombinant protein; B2: Unimmunized rabbit serum.

2.6 HSV-2 ICP35在HSV-2增殖中表達(dá)特性的動(dòng)態(tài)分析

采用免疫熒光檢測(cè)ICP35在HSV-2感染人陰道上皮細(xì)胞VK2/E6E7過(guò)程中的表達(dá)特性，結(jié)果如圖6所示，VK2/E6E7細(xì)胞在未感染HSV-2時(shí)，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，大小均一(見(jiàn)圖6A1)；HSV-2感染4 h時(shí)，細(xì)胞核出現(xiàn)膨大，核邊緣開(kāi)始不規(guī)則，但未檢測(cè)到HSV-2 衣殼支架蛋白ICP35的表達(dá)(見(jiàn)圖6B3)；HSV-2感染8 h時(shí)，部分VK2/E6E7細(xì)胞可檢測(cè)到衣殼支架蛋白ICP35的低表達(dá)，并緊密圍繞包裹在核周圍(見(jiàn)圖6C3)；HSV-2感染12 h時(shí)，可檢測(cè)到VK2/E6E7細(xì)胞融合形成多核細(xì)胞，衣殼支架蛋白ICP35的表達(dá)量進(jìn)一步增加，并出現(xiàn)向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的現(xiàn)象(見(jiàn)圖6D3)；HSV-2感染16 h時(shí)，病變細(xì)胞核膨大更明顯，形態(tài)更不規(guī)則，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)開(kāi)始檢測(cè)到聚集成斑點(diǎn)狀的衣殼支架蛋白ICP35(見(jiàn)圖6E3)，推測(cè)其已經(jīng)參與了病毒核衣殼的裝配；HSV-2感染20 h時(shí)，可見(jiàn)到更多衣殼支架蛋白ICP35聚集成斑點(diǎn)狀的感染細(xì)胞(見(jiàn)圖6F3)，充分表明ICP35在病毒增殖顆粒裝配中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

HSV-2作為目前已知的最大病毒之一，其基因組和結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。HSV-2顆粒呈球形，主要有4種結(jié)構(gòu)成分：①最內(nèi)層為病毒DNA及DNA結(jié)合蛋白構(gòu)成的病毒核心；②核心外是病毒核衣殼；③核衣殼周圍為一層被稱為皮層(tegument)的不定型蛋白；④皮層外為病毒包膜[16]。其中，衣殼是病毒體的主要組成，可保護(hù)病毒核酸免受核酸酶或其他因素的破壞，并能介導(dǎo)病毒核酸進(jìn)入所感染細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)[17-19]。衣殼最初組裝為前體衣殼(B型衣殼)，當(dāng)病毒核酸進(jìn)入時(shí)才轉(zhuǎn)為成熟衣殼[20-22]，而B(niǎo)型衣殼的裝配需衣殼支架蛋白前體ICP35cd參與。ICP35cd是HSV-2感染機(jī)體時(shí)UL26.5基因編碼的蛋白質(zhì)[23]，相對(duì)分子質(zhì)量約為3.8×103。其肽鏈內(nèi)部含有M位點(diǎn)，可被UL26基因編碼的絲氨酸蛋白酶VP24識(shí)別切割，由此產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量約為3.4×104的衣殼支架蛋白ICP35ef和一條由25個(gè)氨基酸組成的肽鏈，當(dāng)HSV-2 DNA進(jìn)入時(shí)，ICP35ef被擠出殼體而消失[12, 24]。本研究將大量擴(kuò)增的HSV-2濃縮純化后提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE及蛋白免疫印跡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ICP35重組蛋白免疫兔血清可檢測(cè)到2條特異性條帶，與報(bào)道一致，表明HSV-2在感染細(xì)胞內(nèi)的增殖過(guò)程中其大量病毒衣殼的裝配處于不同階段。

A1-F1: DAPI staining of nucleus; A2-F2: Alexa Fluor? 488 staining of capsid scaffolding protein ICP35; A3-F3: Merged images of DAPI and Alexa Fluor? 488; h.p.i: hours post infection.

HSV-2在裂解性感染宿主細(xì)胞時(shí)，至少需要編碼80多種蛋白質(zhì)以幫助其基因組的復(fù)制轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成及子代病毒顆粒的組裝等[25]。根據(jù) HSV-2 基因轉(zhuǎn)錄的先后順序，可分為α、β、γ 3類。α基因又稱即刻早期基因(immediate-early gene，IE)，在細(xì)胞內(nèi)最早表達(dá)，于感染后2～4 h達(dá)到高峰。α基因編碼產(chǎn)物可抑制宿主細(xì)胞生物大分子的有序合成，在HSV-2增殖起始中具有重要作用，可反式激活和調(diào)控β、γ基因的表達(dá)，促進(jìn)早期蛋白和晚期蛋白的合成。β基因受α基因編碼產(chǎn)物刺激后被激活，又稱早期基因(early gene，E)，一般在HSV-2感染細(xì)胞后5～7 h表達(dá)達(dá)到高峰，主要編碼HSV-2的非結(jié)構(gòu)蛋白。γ基因編碼的是病毒復(fù)制晚期的產(chǎn)物，一般在感染細(xì)胞后12～15 h表達(dá)達(dá)到高峰，所以又稱晚期基因(late gene，L)，主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。UL26.5基因?qū)儆贖SV-2晚期基因，其編碼蛋白ICP35參與病毒核衣殼的裝配。本研究采用免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HSV-2衣殼支架蛋白在病毒感染細(xì)胞8 h時(shí)才有低豐度的表達(dá)，感染 12 h 時(shí)表達(dá)量進(jìn)一步增加，證明其屬于HSV-2晚期蛋白。此外，本研究還觀察到HSV-2衣殼支架蛋白ICP35在合成后緊密圍繞在細(xì)胞核周圍，推測(cè)該現(xiàn)象與ICP35合成后需轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮功能有關(guān)，與Rixon等[26]早期研究HSV-1的結(jié)果一致。隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，ICP35聚集成斑點(diǎn)狀并分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，推測(cè)其可能發(fā)生了自我聯(lián)結(jié)，并與其他蛋白質(zhì)如VP5發(fā)生了相互作用，參與了病毒核衣殼的裝配。

構(gòu)建病毒基因表達(dá)載體、表達(dá)其蛋白，并免疫動(dòng)物制備其抗體是研究病毒基因功能、分析基因表達(dá)特性及病毒蛋白亞細(xì)胞定位的重要途徑，也是研制病原體亞單位疫苗的常用方法。本研究成功構(gòu)建了HSV-2衣殼支架蛋白ICP35的原核表達(dá)載體，對(duì)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)免疫家兔獲得了抗ICP35抗體，并經(jīng)免疫熒光檢測(cè)分析了HSV-2感染過(guò)程中ICP35的表達(dá)特性及亞細(xì)胞定位，為后續(xù)相關(guān)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。