陳偉，王之旸，付友娟，劉子微，樂嶺，

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，武漢 430070；2.中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430070)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是在遺傳和環(huán)境等多因素作用下β細(xì)胞功能逐漸衰竭的代謝性疾病，其中糖毒性在胰島β細(xì)胞衰竭中起重要作用[1]。改善高糖對(duì)β細(xì)胞的毒性作用是治療糖尿病的關(guān)鍵途徑之一。近年來中藥治療糖尿病的熱點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞功能與中醫(yī)脾主運(yùn)化功能密切相關(guān)，根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論使用益氣健脾養(yǎng)陰中藥可有效治療糖尿病，保護(hù)胰島β細(xì)胞[2]。津力達(dá)顆粒(Jinlidagranules，JLD)有健脾助運(yùn)、益氣養(yǎng)陰之功，多項(xiàng)研究表明它在降低血糖的同時(shí)可改善T2DM患者氣陰兩虛證的癥狀[3-4]，但JLD能否保護(hù)胰島β細(xì)胞尚不明確。因此，本研究擬通過觀察JLD對(duì)體外高糖環(huán)境下的小鼠胰島β細(xì)胞增殖、凋亡及胰島素分泌的影響，探討JLD對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 MIN6 細(xì)胞(CRL-3237)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)。JLD(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050845)。D-葡萄糖分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào) ：WHC2006-0621)；低糖(5.5 mmol·L-1) 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：JM-SH30021.01B)；高糖培養(yǎng)基自配，即稱取D-葡萄糖溶于DMEM培養(yǎng)基，配制成終濃度25.0 mmol·L-1葡萄糖溶液；0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：15050065)；10%胎牛血清(美國(guó)Corning公司，批號(hào)：35-076-CV)；兔單抗p-Smad2/3、兔抗Smad2/3、兔多抗Bax、兔多抗Bcl-2均購(gòu)自Cell signaling(批號(hào)：8828，8685，50599-2-Ig，12789-1-AP)；兔多抗Caspase-3(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：19677-1-AP)；內(nèi)參(GAPDH)抗體(杭州賢至生物有限公司，批號(hào)：AB-P-R 001)； 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BA1054)。小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，批號(hào)：CEA448Mu)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物，批號(hào)：KGA108)；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(噻唑藍(lán)，MTT)(BIOSHARP公司，批號(hào)：0793)；電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)底物液(Thermo，批號(hào)：NCI5079)；X光膠片購(gòu)自柯達(dá)(XBT-1)；顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠，D-76，批號(hào)：20190309)。倒置顯微鏡(日本OLYMPUS株式會(huì)社，IX51)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo scientific，Multiskan MK3)；微型高速離心機(jī)(美國(guó)Labnet，C2500-R-230 V)；低速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，5702R)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE，ICV-450)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，BD FACSCalibur)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MIN6細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素的 DEME基礎(chǔ)培養(yǎng)基5 mL中培養(yǎng)，置于飽和濕度、溫度37 ℃和5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中，生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)，收集細(xì)胞，在原瓶中以1：2至1：3傳代培養(yǎng)。

1.2.2分組及干預(yù) MTT法篩選JLD最佳干預(yù)濃度為200 mg·L-1。參考高糖誘導(dǎo)MIN6損傷模型方法[5]，在干預(yù)之前，將所有細(xì)胞與5.5 mmol·L-1葡萄糖共同孵育24 h，再分別在5.5，25 mmol·L-1葡萄糖加或不加200 mg·L-1JLD繼續(xù)培養(yǎng)48 h。根據(jù)不同培養(yǎng)條件分為4組，①正常對(duì)照(normal control，NC)組：5.5 mmol·L-1葡萄糖；②JLD組：5.5 mmol·L-1葡萄糖+200 mg·L-1JLD；③高糖(high glucose，HG)組：25 mmol·L-1葡萄糖；④HG+JLD組：25 mmol·L-1葡萄糖+200 mg·L-1JLD。

1.2.3ELISA法測(cè)葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS) 按條件培養(yǎng)MIN6細(xì)胞后，棄上清液，分別加入含2.8，16.7 mmol·L-1葡萄糖KRBH緩沖培養(yǎng)液37 ℃孵育0.5 h，收集各組細(xì)胞上清液檢測(cè)胰島素，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔，采用小鼠胰島素ELISA試劑盒，依照說明書進(jìn)行檢測(cè)：在各孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL、抗小鼠胰島素抗體50 μL、HRP標(biāo)記的親和素100 μL，再加顯色底物 90 μL避光孵育15 min，最后加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，藍(lán)色轉(zhuǎn)黃色，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度(A值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每組樣品胰島素濃度。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 按照條件培養(yǎng)MIN6細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入 MTT10 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h；吸出培養(yǎng)基，加入二甲亞砜150 μL震蕩10 min；于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)568 nm處測(cè)定各孔A值，取各組平均值后，計(jì)算細(xì)胞增殖率[細(xì)胞增殖率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%]。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒，依照說明書進(jìn)行檢測(cè)：①加入 緩沖液500 μL，重懸細(xì)胞；②AnnexinV-FITC 5 μL，混勻后加入 PI 5 μL，混勻；③室溫避光反應(yīng)5～15 min(同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，即正常細(xì)胞不加AnnexinV-FITC和PI；陽性對(duì)照1，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對(duì)照，只加AnnexinV-FITC單標(biāo)5 μL；陽性對(duì)照2，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對(duì)照，只加 PI單標(biāo)5 μL)。最后在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞比例。每組細(xì)胞檢測(cè)各重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)蛋白表達(dá) 終止培養(yǎng)后，收集各組細(xì)胞，提取蛋白，通過二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，每組蛋白質(zhì)樣本40 μg，在沸水下變形10 min，通過凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，室溫下，5%脫脂奶封閉2 h，隨后將PVDF膜浸泡于用封閉稀釋液稀釋的一抗[GADPH、Smad2/3、p-Smad2/3(1：1000)、Bcl-2(1：2000)、Caspase-3(1：600)、Bax(1：3000)]孵育液中，4 ℃孵育過夜，三羥甲基氨甲烷緩沖鹽溶液(trisbuffered saline with tween 20，TBST)充分洗滌PVDF膜，再在37 ℃下用稀釋的HRP(1：50 000)搖床孵育2 h，TBST充分洗滌PVDF膜。電化學(xué)發(fā)光顯影，使用BandScan分析膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1JLD增加高糖環(huán)境下的MIN6細(xì)胞的GSIS 16.7 mmol·L-1葡萄糖刺激的NC組、JLD組、HG組、HG+JLD組GSIS較2.8 mmol·L-1葡萄糖刺激時(shí)升高(P<0.01)。在2.8 mmol·L-1葡萄糖刺激下，HG組GSIS低于NC組(P<0.01)，JLD組與正常對(duì)照組、HG+JLD組與HG組GSIS相似(P>0.05)。在16.7 mmol·L-1葡萄糖刺激下，HG組GSIS低于NC組(P<0.01)，JLD組與NC組GSIS相似(P>0.05)；HG+JLD組GSIS高于HG組(P<0.01)。見表1。

表1 4組胰島細(xì)胞的GSIS比較 Tab.1 Comparison of GSIS from islet cells among four groups

2.2JLD促進(jìn)高糖作用下的MIN6細(xì)胞增殖 NC組、JLD組、HG組和HG+JLD組MIN6細(xì)胞增殖率分別為(99.67±2.08)%，(106.33±2.00)%，(68.33±2.08)%和(84.33±4.04)%。 與NC組比較，HG組細(xì)胞增殖率降低(t=-14.25，P<0.01)， JLD組細(xì)胞增殖率相似(P>0.05)。HG+JLD組較HG組細(xì)胞增殖率增高(t=15.31，P<0.01)。

2.3JLD抑制高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡 與NC組比較，JLD組早、晚期細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05或P<0.01)，HG組細(xì)胞早、晚期凋亡率上升(均P<0.01)。HG+JLD組較HG組的早、晚期細(xì)胞凋亡率下降(均P<0.01)。見圖1。

A.NC組；B.JLD組；C.HG組；D.HG+JLD組。①與NC組比較，t=-14.28，P<0.05；②與NC組比較，t=7.97，6.06，27.17，P<0.01；③與HG組比較，t=-50.68，-16.86，P<0.01。圖1 4組流式細(xì)胞圖 A.NC group；B.JLD group；C.HG group；D.HG+JLD group.①Compared with NC group，t=-14.28，P<0.05；②Compared with NC group，t=7.97，6.06，27.17，P<0.01；③Compared with HG group，t=-50.68，-16.86，P<0.01.Fig.1 Flow cytometry in four groups of cells

2.4JLD抑制高糖環(huán)境下的MIN6細(xì)胞p-Smad2/3、Caspase-3-2、Bax蛋白表達(dá)、促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá) 與NC組比較，HG組的p-Smad2/3、Caspase-3-2、Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(均P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，Smad2/3、Caspase-3-1的蛋白表達(dá)相仿(P>0.05)；JLD組的Smad2/3、p-Smad2/3、Caspase-3-1、Caspase-3-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)均相似(均P>0.05)。與HG組比較，HG+JLD組p-Smad2/3、Caspase-3-2、Bax蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.01或P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，Smad2/3、Caspase-3-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

①與NC組比較，t=24.83，22.97，10.61，-10.61，P<0.01；②與HG組比較，t=-17.76，-15.21，7.15，P<0.01；③與HG組比較，t=-7.15，P<0.05。圖2 4組細(xì)胞Smad2/3、p-Smad2/3、Caspase-3-1、Caspase-3-2、Bcl-2、Bax相對(duì)蛋白水平 ①Compared with NC group，t=24.83，22.97，10.61，-10.61，P<0.01；②Compared with HG group，t=-17.76，-15.21，7.15，P<0.01；③Compared with HG group，t=-7.15，P<0.05.Fig.2 Relative protein levels of Smad2/3，p-Smad2/3，Caspase-3-1，Caspase-3-2，Bcl-2 and Bax in four groups of cells

3 討論

中醫(yī)藥治療糖尿病可協(xié)同降糖、改善癥狀和體征、防治并發(fā)癥及提高生活質(zhì)量，因其副作用少已成為糖尿病治療的研究熱點(diǎn)。吳以嶺院士的絡(luò)病理論認(rèn)為“脾”是糖尿病病機(jī)變化的中心環(huán)節(jié)，發(fā)病基礎(chǔ)關(guān)乎脾，渴飲無度害于脾，治療自然應(yīng)顧及脾。JLD由人參、黃精、蒼術(shù)、茯苓、葛根、苦參等17味中藥組成，具有益氣健脾、養(yǎng)陰生津的功效，被《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2020年版)》推薦用于治療氣陰兩虛型的糖尿病前期和T2DM患者。一項(xiàng)基于15項(xiàng)臨床研究的Meta分析發(fā)現(xiàn)，JLD治療的T2DM病患者與基線時(shí)比較胰島素分泌指數(shù)升高、胰島素抵抗指數(shù)降低[6]，提示JLD對(duì)胰島素分泌和抵抗均有改善作用。GSIS是評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞分泌功能的重要指標(biāo)，它主要受磷酸化磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphoinositide-3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT)[7]、AKT/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)[8]、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/Smad(TGF-β/Smad)[9-10]等信號(hào)通路調(diào)控。JLD成分中的葛根素、黃精多糖均被證實(shí)有促進(jìn)胰島素分泌的作用。葛根素通過上調(diào)胰高糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體的表達(dá)增強(qiáng)GLP-1刺激胰島素分泌的作用[11]。黃精多糖可降低胰島β細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性，減輕胰腺免疫損傷和自由基損傷，從而改善胰島β細(xì)胞的分泌功能[12]。本實(shí)驗(yàn)觀察到JLD可改善高糖作用下胰島β細(xì)胞GSIS，可能與JLD組分的協(xié)同作用有關(guān)。同時(shí)觀察到JLD不增加正常環(huán)境下以及低糖刺激時(shí)的β細(xì)胞的GSIS，考慮JLD對(duì)胰島β細(xì)胞的刺激可能與葡萄糖濃度有關(guān)，JLD對(duì)MIN6細(xì)胞GSIS是否呈現(xiàn)葡萄糖依賴性，有待進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

JLD改善胰島β細(xì)胞GSIS亦可能與其促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖、抑制凋亡有關(guān)。筆者既往研究[13-14]發(fā)現(xiàn)JLD可促進(jìn)高糖作用下小鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制高糖誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)[14]信號(hào)通路有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道葛根素可上調(diào) GLP-1受體激活PI3K/AKT通路，促進(jìn)高脂飲食模型大鼠β 細(xì)胞增殖而減少其凋亡[11]；黃精多糖可通過減少高糖刺激的超氧化物歧化酶發(fā)生非酶糖基化，減輕胰島氧化損傷而減少胰島細(xì)胞凋亡[12]。筆者觀察到高糖對(duì)MIN6細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，使用JLD干預(yù)后，高糖+JLD組胰島β細(xì)胞增殖受到促進(jìn)，凋亡被抑制。因此認(rèn)為JLD可能具有促進(jìn)高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞增殖，抑制其凋亡的作用，其機(jī)制可能與組方中多個(gè)成分有關(guān)。

TGF-β/Smad是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，被認(rèn)為與增殖和凋亡過程密切相關(guān)[15]，以MIN6和小鼠胰島為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制TGFβ信號(hào)通路可促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖[9- 10]。Smad是TGF-β通路重要的效應(yīng)蛋白，TGFβ激活素誘導(dǎo)Smad蛋白磷酸化，p-Smad2和p-Smad3與Smad4形成復(fù)合體在細(xì)胞核內(nèi)聚集調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等過程。JLD組方中葛根、山茱萸可通過上調(diào)ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)MIN6細(xì)胞增殖與凋亡[16]。人參的多種提取物可通過TGF-β/Smad途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等病理生理過程[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖作用下MIN6細(xì)胞增殖減少、凋亡增加并伴p-Smad2/3表達(dá)上調(diào)，加用JLD可下調(diào)p-Smad2/3表達(dá)，上述作用被阻斷，提示p-Smad2/3可能介導(dǎo)了JLD對(duì)高糖作用下MIN6細(xì)胞的保護(hù)作用。

Caspase-3是凋亡過程中關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，活化的Caspase-3(Caspase-3-2)因可裂解細(xì)胞蛋白質(zhì)故被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡標(biāo)志物。Bcl家族中的Bcl-2、Bax可控制線粒體通透性并促進(jìn)細(xì)胞色素C的通過。Bax上調(diào)、Bcl-2下調(diào)可喪失線粒體膜電位并釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而引發(fā) Caspase-3 活化并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖上調(diào)胰島β細(xì)胞Caspase-3-2、Bax，下調(diào)Bcl-2，細(xì)胞凋亡率明顯上升，加入JLD顯著下調(diào)Caspase-3-2和Bax，降低凋亡率。提示高糖通過調(diào)控Caspase-3-2、Bax、Bcl-2誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡[18]，而JLD可改善上述蛋白的異常表達(dá)，抑制高糖環(huán)境下的胰島β細(xì)胞凋亡。但確切的機(jī)制有待更深入的分子生物學(xué)和動(dòng)物、臨床研究證實(shí)。

本研究探討了高糖環(huán)境下JLD對(duì)胰島β細(xì)胞功能的作用，以及對(duì)β細(xì)胞增殖凋亡的影響和可能機(jī)制，還探究了低糖環(huán)境下JLD對(duì)胰島β細(xì)胞分泌功能的影響，為JLD降糖作用和安全性提供了更多的基礎(chǔ)證據(jù)。