李雯 李楊 朱保玉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科 鄭州 450052

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)有著較高的發(fā)病率和病死率，嚴重威脅患者健康和生命的兩大原因為早期復(fù)發(fā)和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。目前，雖然OSCC的手術(shù)治療效果有了較大提升，但仍有20%～40%的患者術(shù)后有局部復(fù)發(fā)和(或)遠處轉(zhuǎn)移[2]。所以，早期發(fā)現(xiàn)OSCC患者有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對手術(shù)方案的制定至關(guān)重要，亦是提高患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵。OSCC患者術(shù)前評估方法包括頜面部增強CT檢查，MRI，胸部X線和CT檢查等[3]。單獨使用某種方法的敏感性和特異性不足以檢測OSCC是否有早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，使患者失去最佳治療時機。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)作為一種液體活檢新技術(shù)，在腫瘤診斷、治療和預(yù)后評估方面顯示出巨大的潛力[4]。澳大利亞墨爾本醫(yī)院的Thomas Ashworth醫(yī)生[5]于1869年提出，癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移和(或)復(fù)發(fā)的患者血液中可發(fā)現(xiàn)CTC，其性質(zhì)與原始腫瘤細胞相似。近期的研究表明，一些預(yù)后不佳的患者其CTC檢測數(shù)值明顯增高[6-7]。目前CTC對許多腫瘤的早期篩查及臨床診治具有重要指導(dǎo)意義，但對OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評估是否具有指導(dǎo)意義，仍缺乏相關(guān)研究。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2020-01—2021-07在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科治療的76例OSCC患者。納入標準：(1)手術(shù)前增強CT評估符合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的標準，即最大淋巴結(jié)短徑≥10 mm。(2)所有患者均行口腔腫瘤根治術(shù)和頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)，且病理證實為鱗狀細胞癌。(3)既往健康狀況良好，未進行系統(tǒng)化療、放療和免疫支持治療。(4)愿意參與研究并簽訂合同，經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(批準號：2019-KY-305)。

1.2CT檢查設(shè)備與方法采用Aquilion 16 CT (Toshiba，日本)進行掃描。參數(shù)：層距5～10 mm、層厚5～10 mm、電流250～280 mA、電壓120～140 kV。增強CT采用碘克沙醇(江蘇恒瑞)作為對比劑，1 mL/kg、流速3 mL/s，經(jīng)肘靜脈注射。影像資料均由1名放射科住院醫(yī)師描述與判斷，另有1名高級醫(yī)師負責質(zhì)控。記錄頸部淋巴結(jié)最大短徑，以淋巴結(jié)最大短徑≥10 mm作為判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標準。

1.3CTC分析患者入院后抽取肘靜脈血5 mL置于含有EDTA的抗凝管中，保存于4℃條件下，實驗于24 h內(nèi)完成。CTC分析所需要的試劑盒購自格諾生物科技(上海)有限公司。試驗包括：負向富集及靶向 PCR 檢測技術(shù)。將紅細胞裂解液加入3 mL靜脈血樣中進行孵育，待紅細胞裂解后離心，加入 CD45+磁珠結(jié)合白細胞，用磁場捕獲并去除白細胞。剩余富含CTC的細胞群，加入特異性探針(針對表達葉酸受體α的細胞設(shè)計，由靶向葉酸受體的葉酸單元與共價偶聯(lián)的寡核苷酸單元組成)標記CTC。離心，去除上清液游離探針，加入洗脫劑，洗脫與 CTC特異性結(jié)合的探針，制備待測樣品。加入PCR擴增試劑后進行熒光實時PCR擴增(PCR 擴增模板的寡核苷酸單元序列為：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTT CTAA-3′)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析后，計算出3 mL血樣中CTC的含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。卡方檢驗和秩和檢驗用于組間數(shù)據(jù)比較；ROC曲線分析后，計算曲線下面積、相應(yīng)的特異度、準確率、敏感度和尤登指數(shù)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床資料76例患者中，男47例(61.84%)、女29例(38.16%)。術(shù)前增強CT診斷有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的假陽性率占59.21%(45/76)，卡方檢驗和秩和檢驗結(jié)果表明，性別(P=0.003)和術(shù)前CTC(P=0.002)是OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素。見表1。

表1 OSCC患者臨床特征的相關(guān)性分析(n=76)

2.2ROC曲線分析經(jīng)ROC曲線分析顯示，性別作為診斷術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的曲線下面積為0.668；將CTC≥10.05作為診斷術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的最佳標準，曲線下面積為0.702，特異度為46.67%，敏感度為87.10%，準確率為63.16%，尤登指數(shù)為0.34。見圖1。

圖1 術(shù)前CTC檢測和性別ROC曲線

2.3CTC對OSCC患者術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的評估以CTC≥10.05為分界，將CTC分為2組?？ǚ綑z驗的結(jié)果表明：術(shù)前CTC水平(P=0.002)是OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個獨立因素。其比值比(odds ratio, OR)為5.906，95%可信區(qū)間為(1.775，19.655)。對于臨床判斷為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者，術(shù)前CTC數(shù)值高者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險是CTC數(shù)值低者的5.906倍，以CTC進一步篩查術(shù)前增強CT提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的假陽性率下降至31.58%(24/76)(見圖2)。由此可見，CTC結(jié)合增強CT可為臨床醫(yī)生制定手術(shù)方案提供更為準確的依據(jù)。

患者A，術(shù)前CTC值升高(13.5)，淋巴結(jié)約10.45 mm，術(shù)后病理結(jié)果證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；患者B，術(shù)前CTC值正常(7.6)，淋巴結(jié)約13.23 mm，術(shù)后病理結(jié)果證實淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移。圖2 患者增強CT圖像

3 討論

OSCC的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，受多種因素影響，其潛在的發(fā)病機制尚不清晰。OSCC具有高度的局部侵襲性，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者占所有OSCC患者死因的90%左右[8]。關(guān)于處理OSCC患者頸部淋巴結(jié)方案，一部分學(xué)者建議單純進行原發(fā)灶擴大切除術(shù)，明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后進行淋巴結(jié)清掃術(shù)，這種方案顯著降低了患者的生存率；另一部分學(xué)者則建議行原發(fā)灶擴大切除術(shù)聯(lián)合頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)，這種方案的治愈率高，但由于擴大了手術(shù)范圍，給患者造成了外觀損毀和早期部分功能喪失，而影響了患者生活質(zhì)量[9]。目前，評估口腔鱗癌在術(shù)前是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的手段較多，例如增強CT、PET、MRI及超聲。增強CT價格較PET-CT低廉，在頭頸部腫瘤中較MRI更能清晰顯示頜骨有無腫瘤侵犯，還可通過觀察圖像中淋巴結(jié)的大小、數(shù)目、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和密度、邊緣及其與周圍組織的關(guān)系進行判斷。臨床上影像科常用的判斷有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的主要標準為：(1)淋巴結(jié)最大短徑≥10 mm。(2)增強掃描顯示中心低密度，外周不規(guī)則強化。(3)淋巴引流區(qū)發(fā)現(xiàn)≥3個相鄰的淋巴結(jié)。(4)淋巴結(jié)邊緣不規(guī)則或不規(guī)則強化、模糊、周圍脂肪間隙消失。由于腫瘤轉(zhuǎn)移，炎癥或者組織增生均可導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大，僅僅基于增強CT判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準確率較低[10]。因此，如何通過無創(chuàng)性方法有效評估患者是否有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或高風險轉(zhuǎn)移，一直是臨床研究的重點。

CTC從腫瘤原發(fā)部位脫落，進入血液系統(tǒng)或淋巴管系統(tǒng)，大量CTC聚集后形成有高度轉(zhuǎn)移潛能的細胞團，再次從血管或淋巴管中溢出，到達特定器官發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。這表示CTC具有高侵襲性、逃避機體免疫殺傷等特點，容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。CTC作為液體活檢的代表，可提供大量腫瘤的相關(guān)信息，有效反映腫瘤異質(zhì)性的特點和實時監(jiān)測腫瘤的發(fā)展。由于液體活檢的創(chuàng)傷較小、操作簡單、樣本較容易獲取，且CTC的檢測僅需采集受檢者的外周血，因此CTC檢測可用于癌癥的早期篩查[11]。目前，CTC的檢測方式主要包括ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點技術(shù))、Cell Search System、CTC芯片技術(shù)等。本研究中使用的技術(shù)相對新穎，葉酸受體陽性CTC通過免疫磁珠法負向富集，隨后由配體-靶向PCR定量檢測CTC。CTC在胰腺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腺癌已被用于術(shù)前臨床評估和術(shù)后預(yù)后分析，但對口腔的研究較少[12-15]。Grisanti等[16]研究了53例OSCC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者，發(fā)現(xiàn)CTC高的患者預(yù)后較差；另一個現(xiàn)象是CTC的數(shù)量與OSCC的局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移之間存在顯著關(guān)聯(lián)。這證實OSCC的復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移是通過血液循環(huán)和再循環(huán)實現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)CTC可作為OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素，ROC曲線分析顯示：以CTC≥10.05作為判斷OSCC術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最佳標準，對于術(shù)前淋巴結(jié)最大短徑≥10 mm的患者，術(shù)前血清CTC升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風險也相應(yīng)增加，對OSCC患者術(shù)前判斷和評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有重要意義。本研究中，術(shù)前增強CT診斷的臨床淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者59.21%(45/76)為假陽性，結(jié)合術(shù)前血清CTC檢測后，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移假陽性率下降至31.58%(24/76)；對于臨床影像學(xué)判斷為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者，術(shù)前CTC數(shù)值高者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險是CTC數(shù)值低者的5.906倍。表明增強CT結(jié)合術(shù)前CTC檢測可有效降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評估的假陽性率。但需要更大樣本量的分析予以證實。

綜上所述，術(shù)前評估增強CT發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)最大短徑≥10 mm的OSCC患者，術(shù)前血清CTC水平是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素。術(shù)前進行血清CTC檢測可以降低增強CT對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評估的假陽性率，從而幫助臨床醫(yī)生制定手術(shù)方案及治療策略。