黎 燕，陳利紅，周 紅

甲型流感是由新型豬源性甲型H1N1流感病毒引起的人畜共患急性呼吸道傳染性疾病，其RNA片段由8條獨(dú)立的RNA單鏈組成，具有抗原性漂移和抗原性轉(zhuǎn)變雙重特性，易引起病毒抗原變異，出現(xiàn)耐藥毒株[1-4]。因此，尋找并開發(fā)安全有效的抗流感藥物迫在眉睫。金蓮清熱顆粒由金蓮花、大青葉、石膏、知母、地黃、玄參、苦杏仁(炒)七味中藥組成，具有清熱解毒、利咽生津、止咳祛痰的功效。本文應(yīng)用細(xì)胞病變效應(yīng)實(shí)驗(yàn)了解金蓮清熱顆粒在細(xì)胞水平上對甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)株的抗病毒活性，為研究中藥抗流感病毒活性和機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料：金蓮清熱顆粒(批號(hào)：200420-1，寧夏啟元國藥有限公司)，形狀為棕色顆粒，貯存條件為常溫避光保存。配制方法：受試樣品在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天使用無菌水溶解到800 mg/mL，經(jīng)100 ℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫后取上清液用于測試。對照化合物：奧司他韋酸(Oseltamivir acid)，來源：MedChemexpress(批號(hào)：44039)，貯存條件為-80℃冷凍保存。配制方法：Oseltamivir acid用100% DMSO配制成500 mM 的母液，分裝后凍于-80 ℃保存。

1.2 病毒株：流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，貨號(hào)：VR-1469。

1.3 細(xì)胞：犬腎細(xì)胞(MDCK)購自ATCC，貨號(hào)：CCL-34。細(xì)胞在添加10%胎牛血清，2 mM谷氨酰胺，1×非必需氨基酸，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的EMEM培養(yǎng)液中維持培養(yǎng)。添加2 mM谷氨酰胺，1×非必需氨基酸，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素及2.5 μg/mL胰酶的OptiPRO SFM培養(yǎng)液用做試驗(yàn)培養(yǎng)液。

1.4 主要試劑：細(xì)胞活力檢測試劑CCK8由李記生物科技(上海)有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)：AC11L057。細(xì)胞凍存液：DMEM培養(yǎng)基、血清和DMSO按照6∶3∶1的比例配置，使用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配[5]。

1.5 主要儀器：細(xì)胞記數(shù)儀，Beckman；CO2培養(yǎng)箱，Thermo 2401；Multidrop，Thermo；Multidrop Reader，BioTek，Synergy2；酶標(biāo)儀，Molecular Devices，SpectraMax 340PC384。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法：應(yīng)用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法探索性研究金蓮清熱顆粒的體外抗流感病毒活性，Oseltamivir acid作為陽性對照化合物。

1.6.1 細(xì)胞鋪板： MDCK細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，使用實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成每毫升含150 000個(gè)細(xì)胞的懸液。隨后將細(xì)胞以每孔15 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.6.2 化合物稀釋和病毒接種：次日每孔加入50 μL梯度稀釋的受試樣品或?qū)φ栈衔?8個(gè)濃度點(diǎn)、三復(fù)孔)和50 μL稀釋的病毒(MOI=0.006 7)。設(shè)置細(xì)胞對照(細(xì)胞，無化合物處理或病毒感染)、病毒對照(細(xì)胞感染病毒，無化合物處理)和培養(yǎng)液對照(只有培養(yǎng)液)。受試樣品和對照化合物測試濃度見表1。細(xì)胞培養(yǎng)液終體積為每孔200 μL，細(xì)胞培養(yǎng)液中DMSO終濃度為0.5%。細(xì)胞在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，直至無化合物的病毒感染對照孔內(nèi)細(xì)胞病變達(dá)80%～95%。

表1 樣品測試濃度

1.6.3 細(xì)胞活性檢測： 病毒感染5 d后吸去上清，每孔加入200 μL試驗(yàn)培養(yǎng)液。使用酶標(biāo)儀讀取每孔本底吸光度值(OD450～OD630)。隨后每孔加入200 μL細(xì)胞活力檢測試劑CCK8，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育3.5 h后讀取每孔吸光度值(OD450～OD630)。CCK8檢測后讀值減去CCK8檢測前本底值用于后續(xù)抗病毒活性計(jì)算。如含化合物孔的細(xì)胞活力較病毒感染對照孔高，即CPE減弱，則表明化合物對所測病毒有抑制作用。

1.7 檢測指標(biāo)：受試樣品金蓮清熱顆粒和對照化合物抗病毒活性及細(xì)胞活性，分別由受試樣品金蓮清熱顆粒和對照化合物對病毒引起的細(xì)胞病毒效應(yīng)的抑制率(%)及細(xì)胞活率(%)表示。計(jì)算公式如下：

抑制率(Inhibition,%)=(測試孔讀值-病毒對照平均值)/(細(xì)胞對照平均值-病毒對照平均值)×100;

細(xì)胞活率(Viability,%)=(測試孔讀值-培養(yǎng)液對照平均值)/(細(xì)胞對照平均值-培養(yǎng)液對照平均值)×100。

使用GraphPad Prism(Version 5)軟件計(jì)算受試樣品和對照化合物的半數(shù)有效濃度(EC50)值。曲線擬合方法為Log(Inhibition) vs.Response-Variable slope。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組數(shù)據(jù)間的對比用one-way ANOVA 進(jìn)行分析比較，用Linear-Regression對藥物劑量與其產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng)(細(xì)胞存活率，病毒抑制率)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 金蓮清熱顆粒和對照化合物對流感病毒活性和細(xì)胞活性的作用：實(shí)驗(yàn)以O(shè)seltamivir acid作為對照化合物，利用流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，觀察受試樣品金蓮清熱顆粒和對照化合物Oseltamivir acid體外抑制流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)株活性。結(jié)果顯示，細(xì)胞對照孔和病毒對照孔讀值符合預(yù)期。病毒對照孔在培養(yǎng)5 d后細(xì)胞活力值相比于正常細(xì)胞對照孔讀值明顯降低。在0.625、1.25、2.5、5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，金蓮清熱顆粒對流感病毒株/PR/8/34 (H1N1)抑制率(Inhibition)平均值分別為50.34%、103.78%、82.3%、64.47%，對以上4個(gè)濃度組進(jìn)行組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞活率(Viability)平均值分別為102.57%、97.26%、88.29%、78.62%，對以上4個(gè)濃度組進(jìn)行組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 金蓮清熱顆粒和對照化合物對流感病毒活性和細(xì)胞活性作用

2.2 受試樣品和對照化合物的EC50值:對照化合物Oseltamivir acid對測試病毒株具有明顯的抑制活性，EC50值為0.301 μM。受試樣品金蓮清熱顆粒對所測試的流感病毒株A/PR/8/34 (H1N1)具有一定的體外抑制活性，其EC50值為0.564 mg/mL。采用Log(inhibition) vs.response-Variable slope對金蓮清熱顆粒和對照化合物對流感病毒抑制活性進(jìn)行曲線擬合，結(jié)果見圖1(封三)。

3 討論

由于流感病毒感染普遍存在且無有效的預(yù)防措施，抗流感病毒等呼吸道病毒感染藥物一直是研究熱點(diǎn)。 目前臨床上常用于抗流感病毒的藥物包括離子通道M2阻滯藥(金剛烷胺、金剛乙胺)和神經(jīng)氨酸酶抑制藥(扎那米韋、奧司他韋及帕拉米韋)。離子通道M2阻滯藥對甲型H1NI流感病毒無效，神經(jīng)氨酸酶抑制藥也呈現(xiàn)出一定程度的耐藥，且由于流感病毒的自身抗原漂移特點(diǎn)，耐藥毒株易于出現(xiàn)[6-7]。

我國中草藥自然資源豐富，品種繁多，從中尋找高效、低毒、廣譜的抗病毒成分，開發(fā)出能夠應(yīng)用于臨床防治流感的新型藥物具有重要意義。中藥復(fù)方合劑較之單方具有多組分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，可有直接抑制病毒或(和)免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮抗流感病毒作用，在臨床上廣泛用于流感的預(yù)防與治療[8-11]。

金蓮清熱顆粒方中金蓮花、大青葉清熱解毒；石膏大瀉肺胃之熱，以防熱邪灼傷津液；知母瀉肺胃之熱以及腎中相火；苦杏仁止咳祛痰，生地黃、玄參清熱利咽、養(yǎng)陰生津，故本品具有清熱解毒、利咽生津、止咳祛痰的功效。臨床主要用于感冒熱毒壅盛證，癥見高熱、口渴、咽干、咽痛、咳嗽、痰稠；流行性感冒、上呼吸道感染見上述證候者[12-14]。金蓮清熱顆粒在細(xì)胞水平上是否對甲型流感病毒H1N1具有良好的抗病毒活性，目前還沒有定論。

細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)是指病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞病變甚至死亡的現(xiàn)象。通過檢測細(xì)胞活力，CPE實(shí)驗(yàn)被廣泛用于測定藥物抑制可引起細(xì)胞病變的病毒活性。MDCK 細(xì)胞(犬腎細(xì)胞株)是一種對不同流感病毒敏感的細(xì)胞系，能支持不同型流感病毒復(fù)制增殖，是體外評價(jià)抗流感病毒的模型系統(tǒng)[15-18]。

為了確定金蓮清熱顆粒的抗流感病毒效果，我們利用流感病毒敏感的MDCK 細(xì)胞株進(jìn)行體外細(xì)胞病變效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，探索性研究了金蓮清熱顆粒在細(xì)胞水平上對甲型流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)的抗病毒活性。首先，觀察了受試樣品金蓮清熱顆粒對MDCK 細(xì)胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)在0.625、1.25、2.5、5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞活率平均值分別為102.57%、97.26%、88.29%、78.62%；在此基礎(chǔ)上，以O(shè)seltamivir acid作為對照化合物，利用流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)的CPE，觀察受試樣品金蓮清熱顆粒和對照化合物Oseltamivir acid體外抑制流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)活性。結(jié)果顯示，在0.625、1.25、2.5、5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，金蓮清熱顆粒對流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)抑制率平均值分別為50.34%、103.78%、82.31%、64.47%。以抗病毒活性和細(xì)胞活力為指標(biāo)，計(jì)算出受試樣品金蓮清熱顆粒的EC50值為0.564 mg/mL，這些結(jié)果初步證明了金蓮清熱顆粒在細(xì)胞水平上對所測試的流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)具有一定的體外抑制活性。

此外，陽性對照化合物Oseltamivir acid 的EC50值為0.301 μM，對測試流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)具有明顯的抑制活性。與金蓮清熱顆粒相比顯示，對病毒的抑制作用濃度亦不同，這是由于對照化合物Oseltamivir acid成分單一，結(jié)構(gòu)清楚，而金蓮清熱顆粒是由多種中草藥組成的復(fù)方制劑，其中藥物輔料占比50%，藥物的顯效成分和結(jié)構(gòu)不同，故起效濃度不同，但是以它作為參照證明了金蓮清熱顆粒的抗流感病毒作用。金蓮清熱顆粒的抗病毒有效成分和結(jié)構(gòu)特征與抗病毒活性的關(guān)系仍有待深入研究。