郝 繼，柳科軍，2，牛一鳴，唐超峰，2，惠永峰，2，陳本棟，2，卜 陽(yáng)，3

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝的惡性腫瘤，因復(fù)發(fā)和缺乏有效治療而預(yù)后不佳。目前，HCC已成為世界上第五大最常見的癌癥，死亡率位居第二位[1]。對(duì)于HCC患者的治療方法主要有手術(shù)切除、移植與靶向藥物治療等，但這些措施僅僅只對(duì)30%～40%的病人有效，剩余患者只適用于姑息與對(duì)癥治療，且肝細(xì)胞癌切除術(shù)后的5年復(fù)發(fā)率可達(dá)40%～70%[2-3]。盡管近年來(lái)新輔助化療、分子靶向藥物和免疫治療等綜合治療方式的發(fā)展提高了肝細(xì)胞癌的療效，但患者的遠(yuǎn)期生存預(yù)后仍不樂(lè)觀。因此，需要更多較為敏感及可靠的預(yù)后指標(biāo)來(lái)監(jiān)測(cè)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展與評(píng)估患者的生存預(yù)后情況，從而為患者制訂個(gè)體化臨床診療策略提供可靠的依據(jù)。HCC的發(fā)生、進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程不僅與腫瘤細(xì)胞的病理特征有關(guān)，還受到腫瘤微環(huán)境及機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的影響，這其中就包括了炎癥反應(yīng)對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。炎癥反應(yīng)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的激活增殖、逃避免疫抑制、抵抗細(xì)胞凋亡、無(wú)限復(fù)制、血管新生以及侵襲轉(zhuǎn)移，同時(shí)也能產(chǎn)生以活性氧自由基(ROS)為代表的化學(xué)物質(zhì)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[4]。鐵死亡是一種不同于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死等死亡機(jī)制的細(xì)胞程序性死亡[5-6]。其發(fā)生的主要原因在于細(xì)胞內(nèi)Fe2+發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS增加，脂質(zhì)過(guò)氧化水平的顯著升高，或者通過(guò)抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)、胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Xc-system)等細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化機(jī)制，從而使細(xì)胞死亡[7-8]。研究表明，p62-Keap1-NRF2通路可以增加鐵或ROS代謝過(guò)程中的基因表達(dá)來(lái)保護(hù)HCC細(xì)胞免受鐵死亡，而索拉菲尼也被證實(shí)在HCC的鐵死亡中起到了重要作用，應(yīng)用索拉菲尼和Erastin共同處理肝細(xì)胞的癌細(xì)胞時(shí)，鐵死亡負(fù)調(diào)節(jié)因子Nrf2被抑制，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(RB)蛋白下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)在索拉菲尼導(dǎo)致的鐵死亡中，RB蛋白的水平起到了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[9-10]。基于上述研究發(fā)現(xiàn)，本研究通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲取鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，探討鐵死亡相關(guān)基因與HCC癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系，并構(gòu)建預(yù)后模型，評(píng)估由鐵死亡相關(guān)基因構(gòu)成的預(yù)后模型對(duì)HCC患者生存預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，有望為評(píng)估HCC患者的生存預(yù)后提供可靠的臨床參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集：本研究相關(guān)的HCC的基因表達(dá)圖譜及相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)均來(lái)自于TCGA(https：//portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)，去除臨床資料與生存資料不完整的數(shù)據(jù)，最終收集了360例患者的基因組圖譜、臨床病理及臨床資料。通過(guò)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)譜取交集，最終從FerrDb(http：//www.zhounan.org/ferrdb/)數(shù)據(jù)庫(kù)納入了25個(gè)鐵死亡相關(guān)基因進(jìn)行研究。TCGA與FerrDb的數(shù)據(jù)都是公開的，因此，我們的研究無(wú)須獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)。此外，本研究遵循TCGA與FerrDb的數(shù)據(jù)訪問(wèn)和使用準(zhǔn)則。

1.2 功能富集分析：采用Metascope在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鐵死亡相關(guān)基因進(jìn)行基因本體論(GO)分析和基因組百科全書(KEGG)分析，如無(wú)特殊標(biāo)注，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用R軟件(V3.8.3)比較正常組織與腫瘤組織中鐵死亡相關(guān)基因的差異性表達(dá)，并繪制基因熱圖；采用PERSON相關(guān)分析以確定基因間的相關(guān)性；采用單因素COX和Lasso回歸分析構(gòu)建HCC的預(yù)后模型并將所有患者分為高風(fēng)險(xiǎn)與低風(fēng)險(xiǎn)2組，通過(guò)Kaplan-Meier曲線比較2組的總體生存率，使用受試者工作特征曲線(ROC)評(píng)估該模型的預(yù)測(cè)效果；采用多因素COX回歸分析確定影響HCC患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并構(gòu)建列線圖模型(Nomogram圖)，繪制Calibration圖對(duì)列線圖的擬合情況和預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 HCC中鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá):與正常組織相比，其中22個(gè)鐵死亡相關(guān)基因(CISD1,ATP5MC3,GPX4,HSPB1,RPL8,ACSL4,HSPA5,EMC2,SLC7A11,CS,FANCD2,TFRC,SLC1A5,CARS1,ATL1,NFE2L2,NCOA4,LPCAT3,FDFT1,DPP4,MT1G,SAT1,CDKN1A,GLS2,ALOX15)在HCC組織中顯著上調(diào)(圖1，封二)。Pearson相關(guān)分析表明，25個(gè)基因之間存在相關(guān)性。其中，LPCAT3與NCOA4相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.64；NFE2L2和LPCAT3，NFE2L2和NCOA4也有較強(qiáng)的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為0.58和0.61(圖2，封二)。

2.2 功能富集分析:GO富集分析和KEGG通路分析差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因的生物學(xué)功能和機(jī)制。在GO基因富集中，可以得出鐵死亡的相關(guān)基因在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、對(duì)伽馬射線的反應(yīng)及谷胱甘肽代謝等生物過(guò)程中明顯富集，在線粒體外膜、細(xì)胞色素及黑素體等細(xì)胞成分中富集；此外，在分子功能水平，主要富集于Hijacked molecular function、Virus receptor activity和Protein binding involved in protein folding等；在KEGG功能富集分析，差異表達(dá)基因在與腫瘤代謝等相關(guān)通路中是明顯富集的(圖3，封二)。

2.3 Lasso、COX模型的構(gòu)建:單因素COX回歸分析鐵死亡相關(guān)基因與HCC患者總體生存率的相關(guān)性，得到了6個(gè)與OS顯著相關(guān)的差異表達(dá)基因(P<0.05)(圖4a，封二)；同時(shí)構(gòu)建Lasso、COX模型：0.128*CARS1+0.148*FANCD2+0.173*SLC1A5+0.227*SLC7A11，計(jì)算出肝細(xì)胞癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值將所有肝細(xì)胞癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組(圖4b-d，封二)。K-M生存分析結(jié)果表明，低風(fēng)險(xiǎn)組總體生存期比高風(fēng)險(xiǎn)組長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4e，封二)。ROC曲線結(jié)果顯示，1年、3年和5年生存率的曲線下面積分別為0.765、0.673和0.687(圖4f，封二)。

2.4 鐵死亡基因的預(yù)后價(jià)值及列線圖的構(gòu)建:單因素COX回歸分析顯示，T分期(HR=2.598，95%CI:1.826～3.697，P<0.05)、病理分期(HR=2.504，95%CI:1.727～3.631，P<0.05)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(HR=10 806，95%CI:1.272～2.564，P<0.05)與肝細(xì)胞癌患者的總體生存率顯著相關(guān)；多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，鐵死亡相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(HR=1.833，95%CI:1.257～2.673;P<0.05)是影響HCC患者總體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。最終，將T分期、病理分期、性別、年齡、BMI、AFP、CHILD分級(jí)及血管浸潤(rùn)等納入Nomogram圖中構(gòu)建出評(píng)估預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。通過(guò)Nomogram圖可以對(duì)模型中的每個(gè)變量進(jìn)行評(píng)分，然后將所有變量的得分相加，得到總分后，根據(jù)總分向下繪制垂直線，就可以得出HCC患者的1年、3年及5年生存率(圖5a，目錄后)。同時(shí)，諾莫列線圖及校準(zhǔn)曲線均提示，本預(yù)后模型有較好的預(yù)測(cè)能力(C指數(shù)為0.709，P<0.05)，見表1與圖5b(封三)。

表1 影響HCC癌患者術(shù)后生存預(yù)后因素的COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估

3 討論

肝癌是一種高度異質(zhì)性的疾病，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率仍然較高且預(yù)后相對(duì)較差，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。長(zhǎng)期以來(lái)，大量的分子生物標(biāo)志物如miRNA、蛋白編碼基因、長(zhǎng)鏈非編碼RNA、甲基化基因啟動(dòng)子等被證實(shí)在HCC患者中異常表達(dá)，其中大多數(shù)具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[11]。然而，由于HCC發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，涉及細(xì)胞周期調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多基因在多個(gè)階段的相互作用[12]。通過(guò)篩選與腫瘤形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)，建立新的HCC預(yù)后模型來(lái)提高肝細(xì)胞癌患者的個(gè)體化預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度，并對(duì)肝細(xì)胞癌患者的治療提供了一定的指導(dǎo)意義。目前，肝臟鐵超載被人們普遍認(rèn)為是引起肝臟疾病的主要原因之一，鐵死亡可能在HCC的惡性進(jìn)展中充當(dāng)著重要角色。與細(xì)胞凋亡、壞死和焦亡不同，鐵死亡是一種氧化性、鐵依賴的細(xì)胞死亡形式，是一種受調(diào)控的被動(dòng)細(xì)胞死亡形式，在肝癌、肝纖維化、肝衰竭、肝缺血-再灌注損傷、非酒精性脂肪變性等多種肝臟疾病中，鐵死亡引起了廣泛的關(guān)注[13]。在肝細(xì)胞特異性Trf基因敲除的小鼠中，喂養(yǎng)高鐵飲食增加了它們對(duì)鐵死亡引起的肝纖維化的脆弱性，而鐵抑制劑可使上述癥狀恢復(fù)正常[14]。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，鐵死亡是非酒精性脂肪性肝炎的誘導(dǎo)劑，可導(dǎo)致肝損傷、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)[15]，同時(shí)介導(dǎo)了對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝衰竭[16]。此外，由于癌細(xì)胞的代謝比較旺盛，線粒體易出現(xiàn)功能障礙，從而可以導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)ROS積累較多，對(duì)鐵死亡的敏感性增加。癌細(xì)胞可以通過(guò)超氧化物歧化酶(SOD)、GPX4和過(guò)氧化氫酶等應(yīng)激反應(yīng)和激活抗氧化機(jī)制來(lái)清除細(xì)胞內(nèi)積累的ROS，以達(dá)到防止ROS對(duì)自身造成損傷的效果[17]。因此，鐵死亡相關(guān)基因?qū)τ趷盒阅[瘤的治療與預(yù)后具有重大意義。本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘和分析，篩選出的4個(gè)鐵死亡相關(guān)基因(SLC1A5、SLC7A11、FANCD2、CARS1)組成的預(yù)后模型對(duì)肝細(xì)胞癌預(yù)后有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，有望對(duì)肝細(xì)胞癌患者治療及生存預(yù)后的早期評(píng)估提供一定的指導(dǎo)意義。

溶質(zhì)載體家族1成員5(SLC1A5)是一種依賴鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，被證實(shí)在HCC組織中顯著增加，可通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的攝取能力以促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖[18]。在Erastin和Rsl3誘導(dǎo)的鐵死亡中，谷氨酰胺代謝可誘導(dǎo)脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生并促進(jìn)細(xì)胞死亡[19]。MiR137或小分子抑制劑對(duì)SLC1A5的抑制能強(qiáng)烈抑制谷氨酰胺分解而導(dǎo)致鐵細(xì)胞死亡[20]。SLC1A5介導(dǎo)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)在腫瘤細(xì)胞代謝、增殖和鐵死亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，阻斷SLC1A5可以成功阻止黑色素瘤[21]、非小細(xì)胞肺癌[22]、前列腺癌[23]和急性髓系白血病[24]中的腫瘤細(xì)胞增殖。SLC7A11可以與SLC3A2共同組成胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Xc-system)，可將細(xì)胞內(nèi)谷氨酸與細(xì)胞外的半胱氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)換并用來(lái)合成谷胱甘肽。而GPX4是一種重要的抗氧化酶，可以將脂質(zhì)過(guò)氧化物還原為脂醇，當(dāng)GPX4受到影響時(shí)可增加細(xì)胞的氧化應(yīng)激，所以通過(guò)抑制Xc-system或GPX4，可以使細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物增加，從而導(dǎo)致鐵死亡，可能為治療癌癥提供新的治療途徑[25-27]。同時(shí)，索拉非尼被證實(shí)，通過(guò)抑制Xc-system而增加氧化應(yīng)激對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[28]。此外，SLC7A11的下調(diào)最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)胱氨酸水平的喪失以及隨后的谷胱甘肽生物合成的耗損，從而間接抑制GPx4的活性并激活鐵死亡[29]。SLC7A11的高表達(dá)可抑制細(xì)胞內(nèi)ROS水平，而通過(guò)抑制SLC7A11在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)鐵死亡，被證實(shí)可能是抑制突變小鼠腫瘤發(fā)展的機(jī)制之一[30]。研究表明[31]，范可尼貧血(FA)通路參與細(xì)胞DNA損傷修復(fù),范可尼貧血蛋白(FANCD2)缺陷細(xì)胞對(duì)乙醛暴露的敏感性較高，在含有FANCD2基因缺陷的小鼠中也可觀察到這種現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，向細(xì)胞系中添加乙醛，刺激了移除DNA鏈間交聯(lián)所必需的FANCD2單泛素化作用。FANCD2和FANCI的單泛素化形成FANCD2-FANCI異二聚體，結(jié)合到DNA上可將其他DNA修復(fù)因子引入DNA鏈間交聯(lián)[32]。因此，具有FANCD2突變體的小鼠可以發(fā)展為急性白血病[31]。此外，β2-蛋白是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)的轉(zhuǎn)錄輔助因子，通過(guò)激活FANCD2在肝細(xì)胞中修復(fù)酒精誘導(dǎo)的DNA損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[33]。當(dāng)TGF-β/β2蛋白信號(hào)通路受到抑制時(shí)，F(xiàn)A-DNA修復(fù)通路可能出現(xiàn)缺陷。當(dāng)FA-DNA修復(fù)通路出現(xiàn)缺陷后，需要非同源端連接(NHEJ)和替代非同源端連(Alt-NHEJ)來(lái)確定FA-DNA修復(fù)通路失效后乙醛誘導(dǎo)的小鼠造血系統(tǒng)DNA損傷情況[34]。FA途徑的作用不能被取代，因?yàn)镹HEJ途徑誘導(dǎo)了隨后的誘變修復(fù)和可選末端連接。ALDH2缺陷的FA患者胚胎發(fā)育不良、造血干細(xì)胞功能障礙和癌癥易感性加重[31，34]。KOMATSU[35]等的研究表明，F(xiàn)ANCD2在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)上調(diào)，且較高的FANCD2表達(dá)預(yù)示著較差的總體生存率；FANCD2被認(rèn)為是肝細(xì)胞癌患者腫瘤侵襲性的標(biāo)志和預(yù)后不良的因素，可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。通過(guò)抑制CARS1的表達(dá)，可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)硫途徑代償性增加，進(jìn)而導(dǎo)致半胱氨酸的增加，抑制Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[36]。本研究提示，SLC7A11、FANCD2、CARS1及SLC1A5可能與肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞代謝相關(guān)，因此這4個(gè)基因呈現(xiàn)高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者多存在腫瘤易早期侵襲轉(zhuǎn)移、生存預(yù)后差等特點(diǎn)，故在本模型中所預(yù)測(cè)的預(yù)后更差。運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析也顯示鐵死亡相關(guān)基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)后模型是影響肝細(xì)胞癌患者術(shù)后總生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，諾莫列線圖及校準(zhǔn)曲線圖也證實(shí)了我們構(gòu)建的預(yù)后模型具有良好的預(yù)測(cè)能力。由此可見，鐵死亡相關(guān)基因可作為肝細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)記物。

此外，為了進(jìn)一步探索鐵死亡相關(guān)基因在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，對(duì)肝細(xì)胞癌組織中差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因就主要富集于谷氨酰胺代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程及線粒體與細(xì)胞色素等細(xì)胞成分。這些途徑在腫瘤進(jìn)展中起著重要的作用，氧化應(yīng)激感受蛋白Pirin被證實(shí)與上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制有關(guān)[37]。GPX4受到影響時(shí)可直接增加細(xì)胞的氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡，比如索拉非尼被證實(shí)可以通過(guò)抑制GPX4增加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[28，38],而來(lái)源于線粒體的ROS被證實(shí)可能參與了半胱氨酸減少所導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌細(xì)胞鐵死亡[39]。此外，JANA[40]等的研究表明與正常組織相比，肝細(xì)胞癌組織中的細(xì)胞色素p450表達(dá)明顯下調(diào)，且肝細(xì)胞癌患者更容易收到藥物毒性的影響，對(duì)藥物治療如索拉菲尼更加敏感。由此可以得出，鐵死亡可能通過(guò)這些途徑參與了肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展，鐵死亡相關(guān)基因可能是肝細(xì)胞癌的預(yù)后預(yù)測(cè)因子和治療靶點(diǎn)。

本研究也存在一定的局限性，研究基于TCGA的個(gè)體來(lái)源，沒(méi)有獨(dú)立隊(duì)列的驗(yàn)證，缺少外部數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證，還需要更多的實(shí)驗(yàn)室研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。但通過(guò)對(duì)25個(gè)最重要的鐵死亡相關(guān)基因進(jìn)行了全面的生物學(xué)分析，比以往單個(gè)基因?qū)膊∮绊懙难芯扛鼮槿妗?/p>

綜上所述，本研究初步表明，鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)水平在HCC的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)，我們成功構(gòu)建出基于鐵死亡相關(guān)基因的肝細(xì)胞癌預(yù)后模型，對(duì)肝細(xì)胞癌患者的個(gè)體化治療提供理論依據(jù)，并提高了肝細(xì)胞癌患者的生存預(yù)后預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。