田春花，陳 沖，吳 陽，馬 釗，馬鴻云

子宮內(nèi)膜癌(EC)是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤首位[1]。近年來EC的發(fā)生率及死亡率逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)[2-4]。侵襲轉(zhuǎn)移是EC重要的生物學(xué)特征之一，也是EC人群死亡的主要原因[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(LncRNA)在胚胎發(fā)育、基因表達(dá)和腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用，且參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程[6]。亦有研究顯示，LncRNA成神經(jīng)細(xì)胞瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(NBAT1)最早被發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤，其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中呈低表達(dá)，由此可見LncRNA-NBAT1可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及侵襲，并可作為患者預(yù)后的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[7-8]。本研究旨在探討EC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，并尋找子宮內(nèi)膜癌的治療靶點(diǎn)，為EC患者臨床防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑：人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A和Ishikawa；293T細(xì)胞；mimic NC、miR-21-5p mimic、海腎質(zhì)粒、LncRNA-NBAT1野生型雙熒光素酶載體、LncRNA NBAT1突變型雙熒光素酶載體(中洪博元分子實(shí)驗(yàn)室提供)；DP103-02質(zhì)粒小提試劑盒、DP209-02普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生物)；BM161 Trans15K DNA Marker、6×1 018 DNA Loading Buffer、CD201-01 Trans5α(Trans)；FD1134 SacI、FD0694 XhoI、FD0505 HindIII(Thermo Scientific)；D6950-01 Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ(OMEGA)；AP101-100-kit Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit、CCS102 Cell Cycle Staining Kit(聯(lián)科生物)；CW0580S Trizon Reagent、CW0627S miRNA Purification Kit 提取試劑盒、CW0581M Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒、CW0014S BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì))；MR101-02 miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit、MQ101-02 miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix、R223-01 HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(諾唯贊)；2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M，生命互聯(lián))； Marker(#26617，Thermo)；PVDF膜(IPVH00010， Millipore)；牛血清白蛋白(A8020，索萊寶)； TA-08 Mouse Monoclonal Anti-GAPDH、ZB-2305辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)、ZB-2301辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金橋，1/2 000)； ab32199 Rabbit Anti PTEN；RG027雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑；L3000015 LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑。

1.2 LncRNA-NBAT1過表達(dá)載體構(gòu)建:用NCBI查找基因序列NBAT1(NR_034143.1)，引入酶切位點(diǎn)(HindⅢ:AAGCTT；XhoI:CTCGAG)，生物合成目的基因片段并連接到pcDNA3.1(+)載體上。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，擴(kuò)培，去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，若電泳檢測(cè)結(jié)果與理論值基本都相符，證明為正確的質(zhì)粒。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及處理:癌細(xì)胞傳代鋪板后，當(dāng)70%細(xì)胞密度時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為1 mL無血清培養(yǎng)基，取2個(gè)滅菌EP管，一個(gè)加入125 μL Opti-MEM和5 μL lipofectamine 3000，另一個(gè)加入12.5 μL miRNA，混勻后室溫孵育5 min；將上述EP液管混勻，室溫孵育15 min后滴到六孔板孔內(nèi)，將細(xì)胞放回孵箱培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染4 h后在六孔板中加入1 mL 20%血清含量的完全培養(yǎng)基。293T細(xì)胞鋪板，50%細(xì)胞密度時(shí)轉(zhuǎn)染，提前換成含5%血清的培養(yǎng)基。準(zhǔn)備12孔板的293T細(xì)胞共21個(gè)孔，配制lipo3000組(L組)和P3000組(P組)，分出一組空白組P組，其余P組全加海腎質(zhì)粒；在野生型組和突變型組中，分別對(duì)應(yīng)加入野生型雙熒光素酶載體和突變型雙熒光素酶載體，接著再分別加mimic NC和miR-21-5p mimic，混合后室溫孵育15 min；50 μL每孔加入細(xì)胞，逐滴將試劑加入12孔板中，每加完一組要晃動(dòng)均勻。

1.4 Western blot檢測(cè):棄掉培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的細(xì)胞裂解液，置于冰上20 min。將細(xì)胞刮至一側(cè)，用移液槍吸入已做好標(biāo)記的細(xì)胞。12 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液移至新EP管，總蛋白置于-20 ℃保存。根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。上樣進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1.5 h后，用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。用PVDF膜孵育一抗，4℃過夜；次日PVDF膜室溫孵育二抗2 h，洗膜，用發(fā)光液浸濕PVDF膜后顯影成像。

1.5 熒光定量PCR(qPCR):細(xì)胞收集于培養(yǎng)皿中，吸除培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液。根據(jù)細(xì)胞量每皿加入1 mL的Trizon Reagent，每使用1 mL Trizon后加入0.2 mL氯仿，miRNA、mRNA提取分別采用miRNA提取試劑盒和mRNA超純提取試劑盒，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定miRNA和mRNA的濃度和純度(OD260/OD280)；通過miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別合成micDNA和cDNA，利用熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系如下：miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL或2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、RNase Free dH2O 8.2 μL。各引物序列見表1。反應(yīng)步驟如下：預(yù)變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，10 s，退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參，基因的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算，見表1。

表1 引物信息統(tǒng)計(jì)情況

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)LncRNA-NBAT1細(xì)胞轉(zhuǎn)染的qPCR驗(yàn)證：相較于對(duì)照組和空載組，HEC-1A和Ishikawa細(xì)胞的過表達(dá)組均呈現(xiàn)上調(diào)高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1(目錄后)。

2.2 miR-21-5p mimic處理過表達(dá)LncRNA-NBAT1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的PTEN表達(dá)水平:采用Western blot檢測(cè)兩款癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平變化，結(jié)果見圖2(目錄后)。相較于對(duì)照組及NC組，HEC-1A和Ishikawa細(xì)胞過表達(dá)組中PTEN的表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 miR-21-5p mimic處理過表達(dá)LncRNA-NBAT1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的miR-21-5p表達(dá)水平：相較于對(duì)照組和空載組，HEC-1A細(xì)胞和Ishikawa細(xì)胞的LncRNA-NBAT1組、LncRNA-NBAT1過表達(dá)+mimic NC組均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，LncRNA-NBAT1 NC+mimic組呈上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，見圖3(目錄后)。

2.4 qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中LncRNA-NBAT1、miR-21-5p和PTEN的mRNA表達(dá)水平：在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，LncRNA-NBAT1過表達(dá)組、LncRNA-NBAT1過表達(dá)+mimic NC中LncRNA-NBAT1mRNA、PTENmRNA的表達(dá)量高于他組(P<0.05)；在LncRNA-NBAT1 NC+mimic中LncRNA-NBAT1mRNA、PTENmRNA表達(dá)量最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而LncRNA-NBAT1過表達(dá)組、LncRNA-NBAT1過表達(dá)+mimic NC組中miR-21-5p mRNA的表達(dá)量低于其他組(P<0.05)；在LncRNA-NBAT1 NC+mimic中miR-21-5p mRNA的表達(dá)量最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組細(xì)胞中NBAT1、miR-21-5p和PTEN的mRNA表達(dá)水平

3 討論

盡管近年來臨床研究人員在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療領(lǐng)域內(nèi)取得了顯著進(jìn)展，但腫瘤的臨床治療仍存在諸多有待解決的問題[9]。在諸多癌細(xì)胞中，LncRNA與miRNA之間的關(guān)系多為LncRNA靶向抑制下游的miRNA表達(dá)[10-11]，隨后解除miRNA對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制，從而在癌癥的發(fā)生及發(fā)展過程中起到重要調(diào)控作用[12-13]，這其中也包括子宮內(nèi)膜癌[14]。然而有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21不僅可以靶向抑制腫瘤蛋白編碼基因，而且還可以靶向長鏈非編碼基因的LncRNA GAS5從而抑制其表達(dá)[15]。這意味著miRNA和LncRNA之間還有諸多其他的相互調(diào)節(jié)方式仍不為知，這也值得更多的研究者深入研究。

在骨肉瘤方面的研究報(bào)道指出，LncRNA NBAT1/miR-21/PTEN軸是調(diào)控骨肉瘤生長、轉(zhuǎn)移和凋亡的重要途徑[16]。PTEN是公認(rèn)的抑癌基因，是人類腫瘤中最常見的突變基因之一，在惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、卵巢癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌和EC等腫瘤組織中均可檢測(cè)到PTEN的突變[17]。有研究報(bào)道，EC組織中PTEN表達(dá)較癌旁正常組織顯著降低[18]，本實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)此觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，LncRNA-NBAT1過表達(dá)組、LncRNA-NBAT1過表達(dá)+mimic NC中LncRNA-NBAT1mRNA、PTENmRNA的表達(dá)量高于空載他組(P<0.05)，在LncRNA-NBAT1 NC+mimic中LncRNA-NBAT1mRNA、PTENmRNA表達(dá)量最低(P<0.05)。由此可見，在LncRNA-NBAT1、PTEN對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖具有抑制作用；而在LncRNA-NBAT1過表達(dá)組、LncRNA-NBAT1過表達(dá)+mimic NC中miR-21-5p mRNA的表達(dá)量低于空載其他組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在LncRNA-NBAT1 NC+mimic中miR-21-5p mRNA的表達(dá)量最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明miR-21-5p mRNA上調(diào)能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，這與國內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果相一致[19]。

綜上所述，LncRNA-NBAT1、PTEN對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖具有抑制作用，而miR-21-5p對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，上調(diào)LncRNA-NBAT1后PTEN亦上調(diào)，而miR-21-5p呈下調(diào)。由此可見，LncRNA-NBAT1可通過調(diào)控LncRNA-NBAT1/miR-21/PTEN軸可以進(jìn)一步加強(qiáng)這一調(diào)控功能，這為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷及治療提供了理論參考。