李綠梅，張 娜，代瑤瑤，付 雪，王艷平，張蓮香，孫向平

慢性便秘是臨床常見的疾病或由于許多疾病而伴發(fā)的癥狀，或某些藥物如阿片類藥物的副作用所致,臨床常用的治療便秘藥有藥物依賴性或其他問題，不能從根本上解決便秘問題[1-2]。因此，研究便秘機制進(jìn)而篩選有效的治療藥物成為當(dāng)前研究的重點。針對不同原因?qū)е碌谋忝厮玫谋忝啬Ｐ筒煌琜3-5]，對于阿片類藥物所致便秘，多用鹽酸洛哌丁胺制備便秘模型。鹽酸洛哌丁胺為阿片受體激動劑，應(yīng)用鹽酸洛哌丁胺制備便秘模型可模擬臨床使用阿片類藥物導(dǎo)致便秘的機制研究[6-7]。文獻(xiàn)報道用鹽酸洛哌丁胺50 mg/kg灌胃7 d可制備穩(wěn)定的小鼠便秘模型[7]，但本課題組參考此劑量制備便秘模型時成模率不高。課題組在文獻(xiàn)報道的劑量的基礎(chǔ)上進(jìn)一步摸索鹽酸洛哌丁胺制備便秘模型的最佳用藥劑量和時間，為深入研究阿片類藥物所致便秘的機制提供可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:本研究于2019年9月在寧夏顱腦疾病重點實驗室完成。2月齡SPF級C57BL/6J小鼠，體重25 g，雌雄各半，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(寧)2005-0001，喂養(yǎng)于晝夜 12 h 交替、室溫(24±2)℃環(huán)境中，自由進(jìn)食水，在動物中轉(zhuǎn)單元適應(yīng)1周。本實驗經(jīng)學(xué)校倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 器材和試劑：主要器材有小鼠灌胃針、電子天平電子秤(島津電子天平UW220H，上海儀天科學(xué)儀器有限公司)，主要試劑有鹽酸洛哌丁胺(2 mg/粒，國藥準(zhǔn)字：H10910085，西安楊森制藥有限公司)和生理鹽水(市售)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:選取 50 只小鼠隨機分為空白對照組和便秘模型組。便秘模型組根據(jù)鹽酸洛哌丁胺劑量分為：50、60、70、80 mg/kg 4 個劑量組，每組10只。

1.2.2 給藥方法:將鹽酸洛哌丁胺溶于1 mL 純水中，每天早、晚 7:00 灌胃給藥，對照組給予等量純水，持續(xù)7 d。

1.2.3 便秘效果觀察:在小鼠灌胃期間每日稱量小鼠體重和糞便重量，觀察糞便性狀、活動狀態(tài)、毛發(fā)狀態(tài)、存活情況。通過每天的排便量結(jié)合小腸推進(jìn)情況判斷成模情況。在造模成功后繼續(xù)觀察各組小鼠排便情況，確定模型的穩(wěn)定性。

1.2.4 小腸推進(jìn)試驗:每組各選 4 只小鼠，造模完成后，小鼠禁食過夜以排空腸內(nèi)容物，至第2 d上午開始進(jìn)行小鼠腸道推進(jìn)率檢測。具體方法為：每只小鼠經(jīng)口灌0.2 mL印度墨水，20 min用后異氟烷深麻醉小鼠再迅速打開腹腔，取出自幽門至肛門的全腸道，無張力拉直后測量腸道全長為L1；然后再測量墨汁在腸道內(nèi)的行進(jìn)長度為L2，計算小鼠腸道推進(jìn)率：D=L2/L1×100%。

2 結(jié)果

2.1 便秘小鼠一般情況:各造模組小鼠給予不同劑量的鹽酸洛哌丁胺后，觀察小鼠活動度的變化。與空白對照組小鼠比較，50 mg/kg和60 mg/kg組小鼠活動度僅有輕微降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；70 mg/kg組在給藥第2～3 d 有輕度活動下降，之后明顯下降；80 mg/kg組在第1～2 d 活動輕微下降，之后持續(xù)下降，至第5 d 不活動。在活動度變化中，便秘模型組以80 mg/kg組活動度最低，50 mg/kg組活動度最高。在7 d灌胃中觀察小鼠的毛色，可見50 mg/kg和60 mg/kg組小鼠與空白對照組小鼠毛發(fā)均光滑有光澤，無明顯差異；70mg/kg組和80 mg/kg組小鼠出現(xiàn)毛發(fā)光澤度差、毛雜亂、不光滑；各便秘模型組小鼠均進(jìn)食減少，以80 mg/kg組進(jìn)食降低更顯著。在灌胃期間，80 mg/kg組小鼠因便秘嚴(yán)重而死亡2只，其他各組未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

2.2 鹽酸洛哌丁胺對小鼠體重的影響:各組小鼠在中轉(zhuǎn)單元適應(yīng)1周后，稱量體重并記錄。各組按照前述實驗方案灌胃7 d，每天稱量并記錄各組小鼠體重。對各組小鼠體重進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示灌胃鹽酸洛哌丁胺7 d對小鼠體重的影響不明顯。

2.3 鹽酸洛哌丁胺對小鼠糞便的影響:對各組小鼠每天的糞便性狀進(jìn)行觀察并稱重，在灌胃7 d中，空白對照組糞便性狀和重量無明顯變化。在灌胃2 d和3 d，與空白對照組比較，50 mg/kg組和60 mg/kg組糞便性狀及量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；70 mg/kg組糞便性狀差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，便量減少；80 mg/kg組糞便較干，便量明顯減少(P<0.05)；灌胃4、5、6及7 d，鹽酸洛哌丁胺各劑量組糞便均較干，糞便重量均低于空白對照組(P<0.05)；且灌胃4 d時，70 mg/kg組和80 mg/kg組糞便重量低于50 mg/kg組和60 mg/kg組(P<0.05)；灌胃5 d，80 mg/kg組糞便重量低于50 mg/kg組和60 mg/kg組(P<0.05)，至灌胃6～7 d 鹽酸洛哌丁胺各劑量組之間糞便重量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，70 mg/kg和80 mg/kg鹽酸洛哌丁胺灌胃3 d可制備便秘模型，各劑量鹽酸洛哌丁胺灌胃4 d時均可制備小鼠便秘模型，而且灌胃7 d時，各組便量和性狀無顯著差異，結(jié)果見圖1(封三)，但80 mg/kg組小鼠腹脹明顯，有2只死亡。

2.4 鹽酸洛哌丁胺對對小鼠腸推進(jìn)率的影響:按照鹽酸洛哌丁胺的不同給藥劑量，每組4只小鼠給藥時間7 d，比較墨水在各組腸道的推進(jìn)長度，并計算推薦率，驗證造模效果。結(jié)果顯示，鹽酸洛哌丁胺各劑量組小鼠腸道推進(jìn)率均降低，50 mg/kg劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；60 mg/kg、70 mg/kg和80 mg/kg組腸道推進(jìn)率減低更顯著(P<0.05)，見圖2(封三)。

2.5 便秘效果觀察:通過各組小鼠排便量、排便現(xiàn)狀和小腸推進(jìn)率判斷，本研究鹽酸洛哌丁胺各劑量均可成功制備便秘模型，但80 mg/kg組便秘癥狀嚴(yán)重(2只小鼠死亡)。為確定各劑量鹽酸洛哌丁胺制備便秘模型的穩(wěn)定性，在停止灌胃鹽酸洛哌丁胺后，對各組小鼠的排便情況繼續(xù)觀察1周。結(jié)果表明，在停止灌胃 2 d時50 mg/kg組小鼠有2只排便正常，3 d時有1只排便正常；60 mg/kg組小鼠在停藥5 d時有2只排便正常。研究結(jié)果表明，70 mg/kg可制備穩(wěn)定的便秘模型。

3 討論

阿片類制劑如嗎啡、可待因等在臨床有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、止瀉、麻醉、解痙等作用，但如長期服用可誘發(fā)嚴(yán)重的胃腸道功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致便秘。研究發(fā)現(xiàn)，阿片類制劑的有效鎮(zhèn)痛位點包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，阿片類誘發(fā)胃腸道功能紊亂則主要經(jīng)激活外周阿片受體。相關(guān)文獻(xiàn)報道[2]，阿片類誘發(fā)便秘的途徑有以下兩個：一是抑制腸蠕動，延緩腸道的輸送功能；二是腸內(nèi)容物在腸腔內(nèi)滯留時間過長，抑制腸上皮細(xì)胞的分泌和增加黏膜層對水分的重吸收。因此，探索阿片類制劑抑制結(jié)腸運動的機制，尋找預(yù)防阿片類藥物誘發(fā)便秘的藥物，對臨床擴大阿片類藥物的使用范圍具有重要的價值。

常用制作便秘模型的方法較多，阿片類藥物致便秘機制常用鹽酸洛哌丁胺制備便秘模型進(jìn)行研究[6-7]。鹽酸洛哌丁胺是阿片受體激動劑，為制備便秘模型的常用藥物，相關(guān)文獻(xiàn)報道用鹽酸洛哌丁胺50 mg/kg灌胃7 d可制備穩(wěn)定的小鼠慢性傳輸型便秘模型[7]，但本課題組參考此劑量制備便秘模型時成模率不高。因此，在參考文獻(xiàn)劑量的基礎(chǔ)上進(jìn)一步摸索鹽酸洛哌丁胺制備制作便秘模型的最佳用藥劑量和時間，為深入研究阿片類藥物所致便秘的機制提供可靠的動物模型。本研究分別用50、60、70和80 mg/kg 4個劑量的鹽酸洛哌丁胺灌胃7 d，通過觀察分析小鼠的一般情況、活動度、進(jìn)食情況、體重變化、排便以及腸推進(jìn)率情況來評價便秘模型的成模效果。研究結(jié)果顯示，鹽酸洛哌丁胺各劑量都可使小鼠便秘，但綜合分析小鼠便秘效果，50 mg/kg組和60 mg/kg組有輕微便秘，停藥后幾天大便會較快恢復(fù)正常，而70 mg/kg組每天早晚各一次共灌胃7 d，制備的便秘模型最為穩(wěn)定。本研究用50 mg/kg鹽酸洛哌丁胺制備小鼠便秘模型的效果與姚一博等制備的模型效果有差異[7]，分析可能與小鼠的種屬、飼養(yǎng)環(huán)境、個體對藥物的敏感性、灌胃操作熟練程度等因素有關(guān)，也可能與稀釋鹽酸洛哌丁胺的液體有關(guān)；本研究用純凈水稀釋溶解鹽酸洛哌丁胺，而姚一博等用生理鹽水溶解。另外，姚一博等分別用0.5、5和50 mg/kg 3個劑量研究制備便秘模型的最佳劑量和時間，3個劑量之間是十倍、百倍的差距，劑量差太大。本研究在文獻(xiàn)報道的最佳劑量50 mg/kg基礎(chǔ)上，增加了60、70、80 mg/kg 3個劑量，進(jìn)而尋找更合適的劑量和時間，通過小鼠一般情況觀察、糞便形態(tài)、重量、小鼠體重、墨水在腸道的推進(jìn)率等指標(biāo)評價造模效果，結(jié)果表明70 mg/kg組早晚各灌胃一次，連續(xù)灌胃7 d，可制備穩(wěn)定的小鼠便秘模型，為進(jìn)一步研究阿片類藥物所致便秘機制與模型制備提供了參考依據(jù)。