康佳，梁夕金，楊文龍，鐘懷榮，宣寧，耿耘，孫秀芹，岳壽松，陳高

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室，山東 濟南 250100；2. 諸城市密州街道文體中心，山東 諸城 262234)

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是土壤中十分重要的一類微生物，可與80%以上陸生維管植物形成互惠共生體[1]。 借助龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)，AMF 幫助宿主植物吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并提高宿主對生物和非生物脅迫的抗性，在拮抗土傳病原物、提高植物抗病性方面有顯著的作用效果。 AMF 已經(jīng)被廣泛用作微生物制劑，可以有效改善根際微環(huán)境，增加植物營養(yǎng)物質(zhì)攝取和脅迫耐受能力。 在土壤中施加AMF 菌劑不僅可以增加有益微生物數(shù)量，還可以降低土傳病原菌的豐度[2]。

研究表明，微生物菌群可以影響植物和病原物之間的相互作用，有益微生物能夠促進(jìn)植物生長，同時增加植物對非生物脅迫的耐受性[3]。 Wu等[4]研究發(fā)現(xiàn)接種AMF 后植株根長、根表面積、根體積等增加，從而促進(jìn)植物的養(yǎng)分吸收和生長發(fā)育；黃京華等[5]發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌與玉米形成菌根后，玉米植株總根長、根表面積和根體積均明顯增加；Wu 等[6]研究發(fā)現(xiàn)接種AMF 后，柑橘根系直徑的降低使根系能夠深入到較小的土壤空隙中吸收養(yǎng)分；劉榮林等[7]也發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根真菌能提高植物根系活力，促進(jìn)養(yǎng)分吸收。

我國待開發(fā)利用的鹽堿地大部分分布在黃河流域及長江以北。 山東省不同程度鹽堿化耕地，主要分布在濱州、德州、濰坊和東營[8]。 6.67×106hm2鹽堿地具有良好農(nóng)業(yè)利用潛力，其中有2.33×106hm2經(jīng)治理改良后可實現(xiàn)較大幅度增產(chǎn)，有4.33×106hm2未被農(nóng)業(yè)利用的鹽堿地經(jīng)開發(fā)改造后可實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[9]。 目前對鹽堿地改良研究主要包括各種節(jié)水減肥和鹽堿障礙消減的物理、化學(xué)、生物、水利工程等方法。 在生態(tài)環(huán)境脆弱及地下水位高的輕、中度鹽漬土改良中，一般認(rèn)為生物改良措施是能長期“治標(biāo)亦治本”的方法[10]。從生物進(jìn)化角度來看，鹽堿土中的菌根真菌與植物的共生關(guān)系有利于雙方在鹽堿環(huán)境中的生存，在促進(jìn)植物生長和提高植物產(chǎn)量中發(fā)揮重要作用[11]。 陶蕾等[12]對復(fù)合微生物菌劑進(jìn)行研究表明，接種生物菌劑是降低土壤鹽堿度、增加土壤肥力的有效手段。 本試驗以花生品種“花育25”為研究對象，通過接種AMF 菌劑研究花生根系土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化，以明確AMF 對鹽堿地花生土壤微生物的影響，為進(jìn)一步深入研究AMF 在鹽堿地改良及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與處理

試驗在山東省東營市山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃河三角洲現(xiàn)代農(nóng)業(yè)試驗示范基地進(jìn)行。 土壤為濱海鹽堿土，0 ～20 cm 土層總鹽含量為0.28%。 AMF菌劑成分為異形根孢囊霉(Rhizophagus irregularisSA) 和摩西管柄囊霉(Funneliformis mosseaeBEG95)，比例為(w/w)1∶1，粉狀，由捷克Symbiom公司提供。

試驗處理為AMF 菌劑0.5 g 施于花生種子下方0.5 cm 處，對照(CK)不施用AMF 菌劑。 供試花生品種為“花育25”。 田間隨機區(qū)組設(shè)計，3 次重復(fù)。 小區(qū)面積8 m × 5 m。 單粒種子點播，行距50 cm，株距10 cm，肥水和其它管理措施同常規(guī)大田。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品采集 花生出苗30 d 取樣，采集AMF 菌劑處理及對照的根外(距離植株20 ～30 cm 處的土壤)、根圍(距離植株0.5 ～1.0 cm 處的土壤)、根表(將根放入盛有PBS 的無菌管中，用超聲波對其進(jìn)行二次沖洗，沖洗液作為根表微生物樣本)、根際(距離植株2 ～3 mm 處的土壤)和根內(nèi)(根用無菌水沖洗，超聲20 min，搖床振蕩1 h；紗布過濾后液體經(jīng)4000 r/min離心10 min，收集菌體)區(qū)域樣本。 將土壤及花生根部樣品分別放入無菌采樣袋中，每個樣本5 個重復(fù)，送杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行16S rRNA/ITS 擴增子測序。

1.2.2 基因組提取和高通量測序 用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(D4015，Omega，Inc. US)提取樣品總DNA，正向引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和反向引物805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)擴增16S rRNA 基因的V3 - V4 區(qū)； 正 向 引 物 ITS1 (5′ - GTGARTCATCGAATCTTTG-3′)和反向引物ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對真菌ITS 可變區(qū)進(jìn)行擴增。 PCR 反應(yīng)體系:模板DNA 1 μL、PCR Premix 12.5 μL、上游引物2.5 μL、下游引物2.5 μL、ddH2O 補充至25 μL。 擴增程序:98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，共32 個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物，用AMPure XT beads (Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA)純化PCR 產(chǎn)物，并用Qubit(Invitrogen，USA)進(jìn)行定量。 采用Agilent 2100 生物分析儀(Agilent，USA)和Illumina(Kapa Biosciences，Woburn，MA，USA)文庫定量試劑盒評估擴增子文庫的大小和數(shù)量。 利用NovaSeq PE250 平臺進(jìn)行庫排序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 上機測序完成后，得到原始的下機數(shù)據(jù)，利用overlap 將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，并進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過濾，獲得高質(zhì)量的cleandata。利用DADA2 去噪，之后用ASVs(Amplicon Sequence Variants)構(gòu)建類OTU(Operational Taxonomic Units)表，獲得最終的特征表以及特征序列，進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等。 對細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行Alpha 多樣性分析(Chao 1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù))，其中Chao 1 指數(shù)和ACE 指數(shù)用于表征微生物群落豐富度，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)用于表征微生物群落多樣性。 通過R 語言工具繪制Shannon 指數(shù)稀釋曲線。 使用R 語言vegan 軟件包進(jìn)行NMDS(Nonmetric Multidimensional Scaling)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物多樣性

Shannon 指數(shù)稀釋曲線可反映樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。 結(jié)果(圖1)表明，供試樣品的稀釋曲線已趨于平穩(wěn)，表明樣品測序數(shù)據(jù)量足夠大，能客觀反映花生根系微生物群落的真實情況，可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

Alpha 多樣性指數(shù)分析(表1)表明，接種AMF 菌劑樣品16S rDNA 和ITS Chao 1 指數(shù)和ACE 指數(shù)均增加，說明接種AMF 菌劑可提高花生根系土壤中細(xì)菌和真菌的物種豐富度。16S rDNA的Shannon 指數(shù)稍有增加而Simpson 指數(shù)沒有變化，說明AMF 處理對根及土壤的細(xì)菌群落多樣性影響較小。ITS 的Shannon 指數(shù)減小，Simpson 指數(shù)變化較小，說明AMF 處理降低了花生根及土壤真菌多樣性。

2.2 AMF 對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

接種AMF 菌劑和對照組優(yōu)勢細(xì)菌均為13種，但優(yōu)勢菌群豐度不同。 與對照相比，接種AMF 菌劑可增加放線菌門(Actinobacteria，10% vs 12%)、變形桿菌門(Proteobacteria，35% vs 36%)、綠彎菌門(Chloroflexi，5% vs 6%)的豐度；豐度減少的有芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，8% vs 7%)、厚壁菌門(Firmicutes，7% vs 6%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，4% vs 3%)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria，3% vs 2%，圖2A、2B)。 說明施用AMF菌劑影響根和土壤中細(xì)菌類群的結(jié)構(gòu)組成，其中比例增加最大的為放線菌門。

接種AMF 菌劑和對照組優(yōu)勢真菌均為7 種。與對照相比，接種AMF 菌劑子囊菌門(Ascomycota，71% vs 83%)豐度明顯增加，接合菌門(Zygomycota，8% vs 3%)、Fungi -unclassfied(6% vs 3%)、球囊菌門(Glomeromycota，5% vs 3%)、壺菌門(Chytridiomycota，2% vs 1%)、unclassfied(2%vs 1%)豐度減少(圖2C、2D)。 說明施用AMF 菌劑影響根和土壤中真菌類群的結(jié)構(gòu)組成，其中比例增加最大的為子囊菌門。 AMF 處理種群比例真菌差異幅度比細(xì)菌更大，可能與AMF 是真菌制劑有關(guān)。

圖2 不同處理下門水平細(xì)菌、真菌群落豐度變化

2.3 根系不同部位微生物群落結(jié)構(gòu)差異

對AMF 菌劑處理和對照土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行NMDS 分析，結(jié)果表明，在細(xì)菌群落中，根外、根圍和根際聚類位置比較近，但與根表和根內(nèi)的聚類位置較遠(yuǎn)，并且在接種菌劑后，根表和根內(nèi)聚類位置有較大變化(圖3A)。 在真菌群落中各樣點聚類位置都有一定的距離，而且在接種菌劑后，根表和根內(nèi)聚類位置變化更大(圖3B)。 以上結(jié)果說明，AMF 菌劑主要影響根內(nèi)和根表微生物群落結(jié)構(gòu)，而且對真菌的影響更大。

圖3 基于Bray-Curtis 距離的非度量多維尺度(NMDS)分析

2.4 AMF 對特征細(xì)菌和真菌類群的影響

通過LEfSe 線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)檢測不同處理土壤微生物差異。柱形圖的長短表示具有顯著差異物種的影響大小(圖4)。

圖4 細(xì)菌、真菌LDA 柱形圖

對照有顯著差異的細(xì)菌有芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、不可培養(yǎng)的鞘脂單胞菌屬(unculturedSphingomonas)、 鞘 脂 單 胞 菌 屬(Sphingomonas)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales) 和Microscillaceae；AMF 組有顯著差異的為變形菌綱(Deltaproteobacteria)和黏球菌目(Myxococcales)。

對照有顯著差異的真菌有接合菌門(Zygomycota)、毛霉亞門(Mucoromycotina)、被包霉科(Mortierellaceae)、球囊菌門(Glomeromycota)；AMF 有顯著差異的為子囊菌門(Ascomycota)、籃狀菌屬(Talaromyces)、青霉菌屬(Penicillium pinophilum)、發(fā)菌科(Trichocomaceae)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、火絲菌科(Pyronemataceae)。

圖5A 表明，有20 個細(xì)菌類群表現(xiàn)出顯著差異。 對照樣品中起重要作用的微生物主要為鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)；接種AMF 菌劑處理的樣品中起重要作用的微生物主要為放線菌門的分支桿菌屬(Mycobacterium)、丙酸桿菌(Propionibacteriales)、微單孢菌科(Micromonosporaceae)；變形菌門的Caulobacterales、變形菌門的紅螺菌目(Rhodospirillales)、變形菌綱(Deltaproteobacteria)、變形菌門的Steroidobacteraceae、黏球菌目(Myxococcales)。 放線菌、鞘脂單胞菌和變形菌是細(xì)菌群落關(guān)鍵差異物種，其中放線菌和變形桿菌是有益微生物菌群，對植物生長有良好促進(jìn)作用。鞘脂桿菌目中的部分細(xì)菌可參與鐵代謝以及少量鉀和硫的代謝，影響植物的生理代謝，增強植物抗病和抗蟲能力[13]。

由圖5B 可知，有49 個類群表現(xiàn)出顯著差異。對照樣品中起重要作用的微生物主要有壺菌門(Chytridiomycota)、球囊霉門(Glomeromycota)、根霉屬(Rhizophagus)、擔(dān)子菌門糞銹傘科(Bolbitiaceae)。 接種AMF 菌劑樣品中起重要作用的真菌有子囊菌門(Ascomycota)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、擔(dān)子菌門銀耳綱(Tremellomycetes)、球囊菌目(Glomerales)、黃絲曲霉屬(Talaromyces)。

圖5 細(xì)菌、真菌LEfSe 分析圖

3 討論與結(jié)論

植物根系是植物-微生物互作的重要場所[14]，接種AMF 后可改善作物根系形狀，從而提高作物對養(yǎng)分的吸收[15]。 AMF 在維持根際微生物生態(tài)平衡、協(xié)調(diào)植物生長發(fā)育與營養(yǎng)物質(zhì)的攝取等方面具有重要作用[16]。 16S rRNA 基因和ITS 高通量測序技術(shù)可以根據(jù)微生物的豐度信息計算根系土壤樣品中微生物的多樣性指標(biāo)，對土壤中的優(yōu)勢菌群進(jìn)行鑒定，以此來全面反映土壤樣品中微生物的組成和分布規(guī)律。

本研究結(jié)果表明，接種AMF 菌劑后花生土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。 AMF在一定程度上改變了土壤微生物的群落組成。 細(xì)菌群落的Chao 1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均增加，說明AMF 增加了細(xì)菌群落多樣性，提高了土壤微生物群落的豐富度。 真菌群落Chao 1 指數(shù)增加，說明AMF 具有增加真菌群落豐富度的作用，其引起花生根及環(huán)境真菌多樣性變化的機理有待進(jìn)一步研究。 放線菌門是農(nóng)田土壤中典型的有益微生物種群，是最豐富、最重要的微生物種類之一，也是抗生素(包括農(nóng)用抗菌素)和眾多次級代謝產(chǎn)物主要微生物資源[17]。 放線菌門含有大量植物促生功能菌、病原拮抗菌等，可提高植物獲取營養(yǎng)物質(zhì)的效率，促進(jìn)植物生長，同時抑制土傳病原微生物侵染。 本研究表明放線菌是花生土壤中門水平下的最優(yōu)勢菌(圖2)。 厚壁菌門對外界有害條件的抵抗力強，能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)防止多種作物病害。酸桿菌門在細(xì)菌群落的相對豐度在10%以上，在土壤細(xì)菌群落中普遍存在。 在細(xì)菌微生物群落中(圖2)，隨著離根越近，變形桿菌的相對豐度明顯增加，變形桿菌門中有多種植物根際有益促生菌，對植物生長有良好促進(jìn)作用。 如假單胞菌，其營養(yǎng)要求簡單，許多研究表明，這類微生物能有效分泌鐵載體，促進(jìn)植物正常生長，對防治花生黃化病有重要意義。 變形菌在土壤的碳、硫、氮循環(huán)中起著關(guān)鍵作用[18]。 本研究中，放線菌門、變形桿菌、厚壁菌門、酸桿菌門為花生根系微生物的優(yōu)勢菌門，這與唐杰等[19]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，花生種子接種AMF 菌劑影響根系和土壤中細(xì)菌和真菌類群的多樣性，明顯改變細(xì)菌和真菌群落顯著差異物種。 本研究可為鹽堿地土壤中相關(guān)功能微生物分離、進(jìn)一步篩選優(yōu)良菌根菌、制備優(yōu)良復(fù)合生物菌劑提供理論基礎(chǔ)。