趙振方,胡貫宇,2,3,4,5,6*,陳新軍,3,4,5,6,劉必林,3,4,5,6,梁佳偉

(1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.同濟(jì)大學(xué) 海洋地質(zhì)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200092；3.上海海洋大學(xué) 大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 201306；4.上海海洋大學(xué) 國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306；5.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗室，上海201306；6.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗站，上海 201306)

引 言

莖柔魚(Dosidicusgigas)，是東太平洋特有的頭足類動物[1-3]。與其它魚種不同，莖柔魚可食用率較高(75%)，脂肪含量低，營養(yǎng)價值高[4]。其特點(diǎn)是生長迅速、生命周期短(1～2年)、對環(huán)境變化的適應(yīng)性強(qiáng)[2, 5]。FAO統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，過去30 a中，莖柔魚捕獲量呈明顯的波動上升趨勢，2019年產(chǎn)量近94萬t。莖柔魚是一種極其活躍的捕食者，通常以甲殼類、魚類和頭足類動物為食[6]。此外，它還是一種非選擇性捕食者，具有較寬的營養(yǎng)生態(tài)位和很高的攝食率[7-8]；食性變化與體型、地理區(qū)域和季節(jié)變化有關(guān)[9-10]。作為捕食者和被捕食者，莖柔魚處于食物網(wǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著關(guān)鍵能量流動作用[11]。海洋生物的攝食生態(tài)揭示了海洋食物網(wǎng)的基本結(jié)構(gòu)，承載了食物網(wǎng)絕大部分的物質(zhì)和能量流動[12]。因此，莖柔魚的攝食生態(tài)成為研究海洋食物網(wǎng)的重要環(huán)節(jié)。

研究攝食生態(tài)的傳統(tǒng)方法為胃含物分析法[13-14]，早在上個世紀(jì)初，Reed[15]等就已經(jīng)對胃含物分析法做出詳細(xì)闡述。但由于傳統(tǒng)的胃含物分析僅能對生物48 h甚至24 h內(nèi)的攝食狀況進(jìn)行反應(yīng)，對研究海洋生物長時間的攝食情況幫助甚少。而脂肪酸分析法能夠反映該物種兩周內(nèi)甚至更長時間段的攝食情況。因此，脂肪酸分析法現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于海洋生物的攝食生態(tài)的研究。貢藝等[9]利用脂肪酸分析法對智利外海、秘魯外海以及中東太平洋赤道海域的莖柔魚食性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)脂肪酸組成的空間異質(zhì)性主要是由各海區(qū) C16∶0、C18∶2n6、C20∶4n6 和 DHA 的含量不同造成的。Chen等[16]利用脂肪酸分析法，研究雌性莖柔魚繁殖時期的能量積累和飲食策略，研究發(fā)現(xiàn)莖柔魚繁殖時期能量主要來源于直接攝食，而體細(xì)胞儲備再利用較為有限。雖然已有學(xué)者使用脂肪酸分析法來探究莖柔魚的攝食生態(tài)，但考慮到莖柔魚短暫的生命周期，目前仍缺少從時間尺度對其進(jìn)行對比分析。因此，本研究以在秘魯外海5、6、10和11月捕獲的莖柔魚為對象，對其肌肉脂肪酸進(jìn)行測定并加以分析，旨在探究秘魯外海莖柔魚不同月份間脂肪酸組成及差異，探討在不同月份其食性的差異。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本實(shí)驗樣本采集于東太平洋秘魯外海(80°57′～ 85°35′W、09°18′～18°55′S)，采樣時間為2020年5、6、10和11月。樣本采集后經(jīng)冷凍運(yùn)輸船運(yùn)回實(shí)驗室，在-20℃冷庫中儲存[17]。研究表明，莖柔魚為機(jī)會主義捕食者，個體大小、性別對其攝食影響較小[2,18]，因此，本研究樣本從4個月份捕撈上岸的莖柔魚中隨機(jī)挑選。

表1 不同月份莖柔魚樣本組成

1.2 樣本處理

在實(shí)驗室解凍后，按月份對樣本進(jìn)行隨機(jī)挑選，測量胴長和體重，去除內(nèi)臟后，取莖柔魚胴體漏斗鎖軟骨處的肌肉3 cm×3 cm。去除表皮，用超純水漂洗后放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，將干燥后的肌肉組織研磨成粉。

取0.2 g粉末樣品于試管中，加入15 ml二氯甲烷-甲醇溶液(體積比為2∶1)浸泡20 h以上。離心后取上清液于具塞試管中，再加入10 ml三氯甲烷-甲醇混合溶液沖洗殘渣，離心取上清液，合并兩次收集的上清液加入4 ml 0.9%的氯化鈉溶液，靜置2 h。取下層溶液于圓底燒瓶中進(jìn)行水浴蒸發(fā)，得到粗脂肪樣品[19]。

在圓底燒瓶中加入4 ml氫氧化鉀-甲醇溶液(0.5 mol/L)，混合后連接水浴回流裝置(100 ℃)，水浴加熱15～20 min，加入4 ml三氟化硼-甲醇溶液煮沸25～30 min，最后加入4 ml正己烷回流萃取2 min；冷卻后加入20～30 ml氯化鈉飽和溶液，搖晃均勻，將溶液倒入試管中靜置分層1～2 min，用注射器吸取一定量的正己烷層留待測量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差( Mean ±Sd) 表示，脂肪酸組成采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。每種脂肪酸以占各脂肪酸總含量的百分比表示。使用R軟件的scale函數(shù)對樣本的脂肪酸百分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)按月份分組后進(jìn)行非度量多為尺度(NMDS)分析，根據(jù)NMDS散點(diǎn)圖分析不同月份莖柔魚肌肉脂肪酸組成的時間差異，根據(jù)脂肪酸NMDS載荷強(qiáng)度分析造成差異的主要脂肪酸種類[20,21]。采用Bray-Curtis相似性系數(shù)，以相似性分析(ANOSIM)對比不同月份莖柔魚脂肪酸組成差異的大小，以P<0.05作為具有顯著性差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)[9,22]。以上分析、繪圖均使用R 4.0.5完成。

1.4 指示食性的特征脂肪酸

特征脂肪酸有指示生物食性的作用，并結(jié)合現(xiàn)有脂肪酸標(biāo)志體系[23-27]，分析肌肉中特征脂肪酸組成與月份的關(guān)系，進(jìn)一步探究樣本的食性。

圖1 莖柔魚體長-質(zhì)量關(guān)系

2 結(jié)果

2.1 胴長體重關(guān)系

四個月份莖柔魚胴長范圍為122～627 mm，平均胴長為(369.3±167.2) mm，體質(zhì)量范圍為119～7 911 g，平均質(zhì)量為(2 622.3±2 574)g。體長-質(zhì)量關(guān)系為W= 8e-05L2.8472(R2= 0.9467，n=41，p<0.01)(W為體質(zhì)量，L為胴長，n為樣本數(shù))。

2.2 莖柔魚肌肉脂肪含量和脂肪酸組成

本研究中，4個月份莖柔魚肌肉中所含脂肪酸種類相同，共檢測到28種脂肪酸(表 2)，包括10種飽和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)，8種單飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)和10種多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)。其中多不飽和脂肪酸含量最高，其次為飽和脂肪酸，而單不飽和脂肪酸含量最少。4個月份莖柔魚肌肉SFA含量為29.18%～31.65%，其中C16∶0和C18∶0含量較高，占據(jù)所有SFA的83.2%～91.3%；MUFA含量為8.52%～10.31%，其中C20∶1含量較高，占據(jù)所有MUFA的58.0%～68.4%；PUFA含量為59.40%～60.85%，而C22∶6n3(DHA)是 PUFA 的主要存在形式(>73.2%)。

表2 莖柔魚肌肉脂肪酸組成

續(xù)表2

2.3 莖柔魚肌肉脂肪酸組成的時間差異

一方面，ANOSIM 顯示，飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸在4個月之間的差異均不顯著(P>0.05)；而單不飽和脂肪酸的差異顯著(P<0.05)，其中10月單不飽和脂肪酸含量最高(10.31%)，6月含量最低(8.52%)。檢測到的28種脂肪酸中，10種脂肪酸的含量在月份間存在極顯著差異(P<0.01)，分別為C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶1n9、C20∶1、C20∶3n3、C20∶4n6、EPA、C22∶2n6；另有C18∶0的含量在月份間的差異性顯著(P<0.05)。

另一方面，NMDS 排序圖表明，5月和 6月莖柔魚脂肪酸組成的置信橢圓重疊明顯(圖 2)，主要脂肪酸組成差異不顯著(P>0.05)(表 3)。同樣，10月、11月脂肪酸組成差異也不顯著(P>0.05)。此外，5、6兩月的散點(diǎn)明顯的區(qū)分于10、11兩月，且置信橢圓未有重疊，表明5、6月份與10、11月份的主要脂肪酸組成差異顯著。而根據(jù)NMDS主要矩陣向量組成(表 4)以及主要向量的相對加載強(qiáng)度和方向(圖 3)可以看出，C16∶0、C18∶0、C18∶1n9、C20∶1、C20∶5n3、C22∶2n6、C22∶6n3為造成脂肪酸月間差異性的主要脂肪酸，C18∶0、C20∶1可以較明顯的體現(xiàn)10月樣本的脂肪酸特征，C16∶0則更多體現(xiàn)6月樣本的脂肪酸特征。

表3 月份間脂肪酸組成相似性分析(ANOSIM)

表4 NMDS主要矩陣向量組成

圖2 不同月份間莖柔魚肌肉脂肪酸組成的NMDS散點(diǎn)分布

圖3 不同月份莖柔魚肌肉脂肪酸組成的NMDS標(biāo)度

2.4 特征脂肪酸及食性差異

通過對比分析特征脂肪酸百分含量與月份的變化關(guān)系(表 2)，6月C20∶4n6 出現(xiàn)高值，且5、6月份 C20∶4n6含量均大于1%，明顯高于10月、11月。DHA含量最高值也出現(xiàn)在6月，但4個月份無顯著差異(P=0.571)。C18∶ 1n9 和C16∶1n7 的最高值均出現(xiàn)在5月，11月份出現(xiàn)最低值，且4個月份中C18∶ 1n9含量均高于1%。10、11月C20∶5n3 含量較高，均大于9%，明顯高于5月和6月。莖柔魚肌肉脂肪酸中DHA含量最多，4個月份均大于40%，而5、6、10、11月DHA/EPA分別為5.82、5.84、4.54、4.83。

3 討論與分析

本研究通過對比4個不同月份莖柔魚肌肉脂肪酸組成，分析發(fā)現(xiàn)，莖柔魚肌肉組織中共有28種脂肪酸，其中SFA、PUFA各10種，MUFA 8種，這與貢藝[9]等的研究結(jié)果一致。各月份SFA、PUFA、MUFA含量雖有差異，但均以PUFA為主，其次是SFA，MUFA含量最低。作為必須脂肪酸，DHA和EPA對維持莖柔魚正常生長發(fā)育起到關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，莖柔魚肌肉中DHA與EPA含量較高，占多不飽和脂肪酸的二分之一以上，且 n-3 型多不飽和脂肪酸含量明顯高于 n-6型多不飽和脂肪酸。由于 n-3/n-6是魚油相對營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)[28]，高含量的n-3/n-6 證明了莖柔魚較高的營養(yǎng)價值。

以往研究中，已有學(xué)者使用脂肪酸組成分析法從不同地理群體[9]、生殖投入[16]等方面來探究莖柔魚的攝食生態(tài)，而本研究則是從時間角度來分析莖柔魚的攝食變化。

本研究發(fā)現(xiàn)，5月和6月、10月和11月莖柔魚肌肉脂肪酸組成差異不顯著，由于莖柔魚攝食受溫度、葉綠素濃度等環(huán)境因子的影響[29]，因此，相鄰兩月較為相似的外部環(huán)境特征可能是其脂肪酸組成相似的主要原因。然而，5、6兩月與10、11兩月肌肉脂肪酸組成差異明顯(圖 2)，這種差異首先體現(xiàn)在飽和脂肪上(P=0.042)，飽和脂肪酸可以自身合成，因此，通過攝食很難對其進(jìn)行解釋。5、6月南半球處于秋冬季節(jié)，溫度較低，莖柔魚可獲取的食物相對較少，為保持體內(nèi)能量，儲存能量的脂肪可能相應(yīng)增加，從而導(dǎo)致5、6月份莖柔魚飽和脂肪酸含量顯著高于10、11月份。

此外，多不飽和脂肪酸不能自身合成，只能從食物中攝取[30]，因此可以很好的指示食物來源。本研究顯示，各個月份多不飽和脂肪酸組成種類相同，但其中C20∶3n3、C20∶4n6、C20∶5n3、C22∶2n6 4種多不飽和脂肪酸月份間差異顯著(表 2)。本研究認(rèn)為，不同月份莖柔魚所攝食獵物種類一致，但4個月份間攝食不同獵物的比例有所差異。Alegre等[29]通過胃含物分析研究秘魯海域莖柔魚一年中攝食組成變化，同樣發(fā)現(xiàn)，莖柔魚四個季節(jié)攝食物種種類基本一致，但不同季節(jié)食物組成比例有所差異，如春季其他頭足類為最主要的食物，而秋季則對熒光串魚有更強(qiáng)的攝食偏好。

表5 特征脂肪酸及其指示生物

由于生物體內(nèi)的脂肪酸組成在很大程度上取決于其攝食對象的脂肪酸特征[31]，且特征脂肪酸具有指示食性的作用，其組成和含量可以較好地指示它們的食物來源(表5)。本研究中，5、6月份C22∶6n-3/ C20∶5n-3比值顯著高于10、11月份，表明5、6月份秘魯海域莖柔魚比10、11月份更多地攝食橈足類或以橈足類為主要食物的物種。此外，5、6月份指示浮游生物的特殊脂肪酸 C18∶1n9 也明顯高于10、11月份。已有研究表明，竹筴魚的主要攝食對象為橈足類、浮游生物、小型魚類[32-33]，而Cecilia等[34]對秘魯海域莖柔魚進(jìn)行胃含物分析，發(fā)現(xiàn)莖柔魚胃含物組成中竹筴魚(Trachurusmurphyi)無論是在出現(xiàn)頻次、數(shù)量還是重量上都顯著超過其他種類。由此推斷，C22∶6n-3/ C20∶5n-3、C18∶1n9間接指示了秘魯海域莖柔魚的竹筴魚食性，且5、6月份對竹筴魚有更強(qiáng)的攝食偏好。除此之外，6月份脂肪酸C20∶4n6組成比例明顯高于其余3個月，說明秘魯莖柔魚6月攝食更多的底棲生物。根據(jù)Stewart等[35]研究，莖柔魚垂直洄游受到最小含氧層(Oxygen Minimum Zone，OMZ)的影響，OMZ的上層深度往往是莖柔魚下潛的最大深度。而東南太平洋冬季OMZ寬度增加，但其上邊界則會下移至較深的位置[36]，因此冬季莖柔魚可能在較深的海域滯留時間相比于其他季節(jié)更長，從而捕食更多的底棲生物。此外，由于DHA/EPA會隨營養(yǎng)級的增加而增加，因此DHA/EPA可以間接指示生物營養(yǎng)級[37-38]，5、6、10、11月莖柔魚DHA/EPA分別為5.82、5.84、4.54、4.83，5、 6兩月莖柔魚營養(yǎng)級高于10、11月，因此，莖柔魚在5、6月份可能捕食更多的底棲生物。

本研究通過測定2020年4個月份捕獲自秘魯外海的莖柔魚肌肉脂肪酸，分析了不同月份莖柔魚肌肉脂肪酸組成的特點(diǎn)和差異。研究發(fā)現(xiàn)，4個月莖柔魚脂肪酸均以多不飽和脂肪酸為主，飽和脂肪酸次之，單不飽和脂肪酸最少。5月與10月、5月與11月、6月與10月、6月與11月的脂肪酸組成差異顯著。4個月份多不飽和脂肪酸種類相同，但組成比例不同。本研究認(rèn)為，不同月份莖柔魚所攝食獵物種類一致，但4個月份間攝食不同獵物的比例有所差異。此外，C22∶6n-3/ C20∶5n-3、C18∶1n9、C20∶4n6等特征脂肪酸組成也顯示出顯著的月份間差異，本研究認(rèn)為，5、6月份莖柔魚對竹筴魚、底棲生物有更強(qiáng)的攝食偏好，這可能是由海洋環(huán)境的月間差異所致。然而，脂肪酸分析同樣存在一定的缺陷，其對食性的指示具有一定的間接性，尤其是對浮游生物的指示，并不能確定莖柔魚直接攝食浮游生物或是攝食以浮游生物為食的其它種類，而傳統(tǒng)胃含物分析法也很難檢測出浮游生物，因此后續(xù)研究可使用DNA序列分析法對其進(jìn)行補(bǔ)充、驗證。另一方面，脂肪酸分析不能確定營養(yǎng)級，后續(xù)研究可以結(jié)合穩(wěn)定同位素分析法研究莖柔魚在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的營養(yǎng)位置。