孫奇奇， 李永生， 牛德超

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，低維材料化學(xué)研究室，上海 200237）

因具有高復(fù)發(fā)率和高死亡率，惡性腫瘤至今仍是世界范圍內(nèi)威脅人類生命健康最致命、最棘手的疾病之一[1]。在過去的幾十年里，化療和放療是臨床癌癥的主要治療方法[2-3]。盡管這些治療手段取得了顯著的進(jìn)展，但是都有其自身的局限性，會(huì)對(duì)患者造成嚴(yán)重的副作用[4]。化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法（CDT）作為一種新興和有效的癌癥治療策略，最近在腫瘤治療領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注[5]。它是基于在芬頓試劑的催化下，在腫瘤區(qū)域?qū)⑦^氧化氫（H2O2）原位轉(zhuǎn)化為具有高細(xì)胞毒性的羥基自由基（?OH），從而引發(fā)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長[6-7]。鑒于H2O2在腫瘤微環(huán)境（TME）中過度表達(dá)的特點(diǎn)，?OH 僅在腫瘤區(qū)域產(chǎn)生，對(duì)正常組織幾乎沒有傷害，這使得CDT 成為了一種“綠色療法”[8]。鐵基納米材料作為經(jīng)典的芬頓反應(yīng)催化劑，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到CDT 研究中。然而，F(xiàn)e2+介導(dǎo)的芬頓反應(yīng)強(qiáng)烈依賴于酸性環(huán)境（pH 2～4），在生理中性的條件和弱酸性的腫瘤微環(huán)境（pH 6.5～6.9）下，反應(yīng)相對(duì)低效[9-10]。即使在理想的酸性條件下，F(xiàn)e3+/Fe2+的低轉(zhuǎn)化率也阻礙了芬頓反應(yīng)的進(jìn)行[11]，導(dǎo)致活性氧（ROS）生成緩慢，從而達(dá)不到理想的治療效果[12]。此外，TME 的另一個(gè)特點(diǎn)是谷胱甘肽（GSH）濃度過高，可達(dá)10 mmol/L[13]。GSH 作為細(xì)胞中一種重要的抗氧化劑，可以清除產(chǎn)生的?OH，減弱細(xì)胞的氧化還原作用，這種癌細(xì)胞中的抗氧化防御又成為CDT 發(fā)揮功效的一大障礙[14-15]。因此，亟需開發(fā)在弱酸性TME 中具有高催化活性和特異性的CDT 納米催化劑。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，除Fe2+之外，其他金屬離子如Mn2+、Cu+、Cr4+和V2+也具有優(yōu)異的類芬頓催化活性[16]。在這些金屬元素中，銅因其優(yōu)異的特性而引人注目。首先，作為生物體中許多天然酶的輔因子，銅具有優(yōu)異的生物相容性，廣泛參與體內(nèi)的生化反應(yīng)[17]。另外，與鐵相比，具有氧化還原活性的Cu+催化的類芬頓反應(yīng)在動(dòng)力學(xué)和能量上比Fe2+更有利。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，銅離子的催化活性基本不受酸堿度的影響,其催化的類芬頓反應(yīng)可以在弱酸性和中性介質(zhì)中高效發(fā)生，Cu2+/Cu+（0.16 V）的氧化還原電位明顯低于Fe3+/Fe2+（0.77 V）[18]，最高反應(yīng)速率（1×104mol/(L·s)）可達(dá)到Fe2+的160 倍[19]。更為重要的是，Cu2+向Cu+的轉(zhuǎn)化可以有效地消耗細(xì)胞內(nèi)的GSH，減少ROS 的損失，還原產(chǎn)生的Cu+又可以與腫瘤細(xì)胞中的H2O2反應(yīng)產(chǎn)生?OH，從而提高CDT 效率，進(jìn)而增強(qiáng)抗腫瘤效果。

本文制備了一種銅納米簇負(fù)載的有機(jī)硅穩(wěn)定的聚苯乙烯-b-聚丙烯酸（PS-b-PAA）膠束用于化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療研究。首先，通過引入3-巰基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）對(duì)PS-b-PAA 的膠束結(jié)構(gòu)進(jìn)行固定，得到巰基改性的有機(jī)硅膠束。然后，借助銅離子與巰基較強(qiáng)的配位能力[20]，采用原位還原策略將銅物種負(fù)載到有機(jī)硅膠束中。結(jié)果表明，這種銅納米簇負(fù)載的有機(jī)硅膠束體系具有pH 響應(yīng)特性，即在微酸的TME 環(huán)境中釋放Cu+，進(jìn)而催化腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)的H2O2，產(chǎn)生高毒性的?OH。此外，腫瘤細(xì)胞中的GSH 又可將Cu2+還原為Cu+，消耗GSH 的同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)ROS 的持續(xù)生成，從而增強(qiáng)CDT 效率。因此，這種同時(shí)具備pH 響應(yīng)和GSH 消耗特性的銅基CDT 試劑將為惡性腫瘤的高效、安全治療提供一種新的策略。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

PS-b-PAA：自制；MPTMS：分析純，Sigma-Aldrich；四氫呋喃（THF）：分析純，上海國藥化學(xué)制劑有限公司；氨水（NH3?H2O）：分析純，上海泰坦科技股份有限公司；二水合氯化銅（CuCl2?2H2O）：純度99%，上海泰坦科技股份有限公司；鹽酸（HCl）：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）：純度98.35%，上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4?2H2O）：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（NaCl）：分析純，上海泰坦科技股份有限公司；亞甲基藍(lán)（MB）：純度98%，上海泰坦科技股份有限公司；GSH：純度98%，阿拉丁生物科技有限公司；雙氧水（H2O2）：w=30%，上海國藥化學(xué)制劑有限公司。

1.2 測(cè)試與表征

采用透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會(huì)社，JEM-2100F 型）在200 kV 工作電壓下進(jìn)行樣品粒徑測(cè)試；采用動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS，英國馬爾文公司，Malvern ZEN3700 型）在室溫下檢測(cè)樣品的水合動(dòng)力學(xué)尺寸和ζ電勢(shì)；采用X 射線衍射儀（XRD，德國布魯克公司，D8 Focus 型）在電壓40 kV、電流40 mA以及掃描速度8（°）/min 條件下測(cè)試樣品的XRD 圖譜；采用拉曼光譜儀（Raman，英國雷尼紹公司，inVia Reflex 型）得到樣品的拉曼光譜；采用場(chǎng)發(fā)射電子掃描顯微鏡（FESEM，日本日立公司，S-4800 型）進(jìn)行樣品元素能譜分析；X 射線光電子能譜分析由X 射線光電子能譜儀（XPS，美國賽默飛世爾科技公司，250Xi 型）得到；采用紫外-可見光（UV-vis）分光光度計(jì)（日本島津公司，UV-3600 型）在室溫下檢測(cè)樣品的紫外-可見光光譜；采用電感耦合等離子體光譜儀（ICP-OES，美國安捷倫公司，752ES 型）測(cè)得樣品的Cu 含量；采用酶標(biāo)儀（美國美谷分子儀器有限公司，SpectraMax M2 型）于室溫下對(duì)體外細(xì)胞毒性進(jìn)行分析；采用細(xì)胞流式儀（美國碧迪公司，BD Accuri C6 型）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.3 PS-b-PAA 膠束（PMs）的制備方法

首先將20 mg PS-b-PAA 分散到10 mL THF 中，快速攪拌（600 r/min）30 min 直至完全溶解。然后保持劇烈攪拌的狀態(tài)，取40 mL 超純水迅速加入到上述混合溶液中，再繼續(xù)攪拌30 min。攪拌結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋（MWCO 14000）中進(jìn)行透析24 h，期間每隔4 h 換一次透析介質(zhì)（去離子水）以除去多余的THF。透析結(jié)束后即得到PMs。

1.4 PS-b-PAA 有機(jī)硅膠束（POMs）的制備方法

將1 mL NH3·H2O 和50 μL MPTMS 逐滴加入到上述實(shí)驗(yàn)所獲得的PMs 溶液中。然后在室溫?cái)嚢?4 h，接著將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中進(jìn)行連續(xù)1 d的透析，以除去NH3·H2O 和多余的MPTMS，即得到POMs。

1.5 負(fù)載銅納米簇的PS-b-PAA 有機(jī)硅膠束（Cu-POMs）的制備方法

取2 mL CuCl2·2H2O 溶液（50 mmol/L）緩慢加入到18 mL 上述實(shí)驗(yàn)所得到的POMs 溶液中，然后將混合溶液連續(xù)劇烈攪拌24 h。待攪拌完全后，再連續(xù)透析1 d 除去未反應(yīng)的游離的銅離子，即獲得Cu-POMs。

1.6 Cu-POMs 的生物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別取1 mL Cu-POMs 溶液加入到2 mL pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）和2 mL 含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液中。在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)連續(xù)用DLS 檢測(cè)其水合動(dòng)力學(xué)粒徑的變化。

1.7 pH 響應(yīng)的離子釋放

用ICP-OES 評(píng)估Cu-POMs 在不同pH 值（pH =7.4、6.5、5.0）的PBS 溶液中釋放的銅離子的量。簡而言之，將4 mL Cu-POMs 溶液密封在透析袋里，然后將透析袋分別放入到50 mL 不同pH 值（pH = 7.4、6.5、5.0）的PBS 溶液中，并進(jìn)行適度攪拌。分別在0、1、2、4、8、12、24 h 的時(shí)間點(diǎn)收集5 mL 緩沖液，然后使用ICP-OES 檢測(cè)銅離子的濃度。每次取完緩沖液，再補(bǔ)充5 mL 新鮮的緩沖液。

1.8 羥基自由基（?OH）的檢測(cè)

通過MB 的降解實(shí)驗(yàn)，評(píng)估Cu-POMs 對(duì)芬頓反應(yīng)的催化能力和生成?OH 的能力。首先檢測(cè)了Cu-POMs 在不同pH 條件下生成?OH 的能力，將Cu-POMs 溶液分別添加到不同pH（7.4、6.5 和5.0）的含MB（20 μg/mL）和H2O2（100 μmol/L）的PBS 緩沖溶液中，再在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)（0、10、20、30、40、50、60 min）測(cè)其在664 nm 處的紫外吸光度。為了進(jìn)一步探究GSH 是否會(huì)對(duì)Cu-POMs 生成?OH 的能力造成影響，將Cu-POMs 溶液分別添加到含有不同GSH 濃度（0、20 μmol/L 和10 mmol/L）的pH 為6.5 的 含MB（20 μg/mL）和H2O2（100 μmol/L）的PBS 緩沖溶液中，再在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)（0、10、20、30、40、50、60 min）測(cè)其在664 nm 處的紫外吸光度。MB 的降解率采用以下公式計(jì)算：

其中：A0和At分別表示樣品起始時(shí)刻和t時(shí)刻時(shí)的紫外吸光度。

采用相同的方法，評(píng)估了Cu-POMs 在pH為6.5，含有不同H2O2濃度（100、200、1 000 μmol/L）條件下生成?OH 的能力。

1.9 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.9.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用人體肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞（簡稱SMMC-7721 細(xì)胞）和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH-3T3 細(xì)胞（簡稱NIH-3T3 細(xì)胞）進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)SMMC-7721 細(xì)胞，而在含10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)NIH-3T3 細(xì)胞。此外，所有細(xì)胞系均在體積分?jǐn)?shù)5%的CO2氣氛和37°C 加濕環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.9.2 體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià) 以細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）測(cè)定SMMC-7721 細(xì)胞和NIH-3T3 細(xì)胞的活性，以此來評(píng)估Cu-POMs 的細(xì)胞毒性。具體操作如下：將細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，按1.9.1 節(jié)方法分別培養(yǎng)SMMC-7721 細(xì)胞和NIH-3T3 細(xì)胞至細(xì)胞完全貼壁。然后用含Cu-POMs（Cu 質(zhì)量濃度范圍1.5～24.0 μg/mL）的培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24 h，之后換用CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h, 接著用酶標(biāo)儀獲取其在450 nm 處的吸光度，以此計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)存活率。此外，將不含納米顆粒的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞用作對(duì)照。用相同的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步探究了POMs 和H2O2對(duì)細(xì)胞的毒性。使用以下公式計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)存活率：

其中：A和A'分別為用樣品處理的細(xì)胞的吸光度和對(duì)照組的吸光度，對(duì)照組的細(xì)胞定義為100%存活。

1.9.3 細(xì)胞凋亡分析 將SMMC-7721 細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種在6 孔板中，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，分別用含POMs，H2O2和Cu-POMs 的培養(yǎng)基與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。同樣地，用不含任何納米顆粒的新鮮培養(yǎng)基孵育的細(xì)胞作對(duì)照。共培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液并將細(xì)胞用PBS 洗滌3 次，然后用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化細(xì)胞，再通過離心（2 000 r/min，5 min）收集細(xì)胞，接著將收集的細(xì)胞分散到0.5 mL PBS 中，并用5 μL 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和5 μL 的碘化丙啶（PI）溶液在避光條件下將細(xì)胞染色15 min。最后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光，并基于染色的差異來確定細(xì)胞的凋亡情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu-POMs 的合成與表征

圖1 Cu-POMs 的制備流程示意圖Fig. 1 Schematic illustration of Cu-POMs

Cu-POMs 的制備流程示意圖如圖1 所示。首先將PS-b-PAA 分散至THF 中，待其溶解后再加入去離子水，由于兩親性嵌段共聚物具有在溶液中自組裝的特性，因此PS-b-PAA 自發(fā)形成了由親水性PAA外殼和親脂性PS 內(nèi)核組成的膠束（PMs）。然后，引入含巰基的硅烷偶聯(lián)劑MPTMS，并利用其進(jìn)行水解縮聚反應(yīng)以穩(wěn)定膠束結(jié)構(gòu)，即有機(jī)硅烷分子在銨根離子的介導(dǎo)下會(huì)在PAA 鏈段區(qū)域進(jìn)行水解縮聚，形成雙硫鍵交聯(lián)的有機(jī)硅網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而得到POMs。最后，利用POMs 中有機(jī)硅中的巰基基團(tuán)與銅離子的配位作用，通過原位還原得到Cu-POMs。

Cu-POMs 的TEM 圖片如圖2(a)～2(c)所示，可以觀察到合成的Cu-POMs 為44 nm 左右的球形納米顆粒，具有優(yōu)異的分散性。另外，納米粒子表面有明顯的黑色小顆粒，推測(cè)是Cu 的納米簇。由TEM 圖片得到的粒徑分布直方圖（圖2(d)）顯示，Cu-POMs的粒徑分布區(qū)間較小，表明其粒徑均一。圖2(e)所示為POMs 及其合成的Cu-POMs 的Zeta 電位和水合動(dòng)力學(xué)直徑，從中可以發(fā)現(xiàn)二者通過DLS 所測(cè)定的粒徑無明顯變化，均為90.0 nm 左右，大于通過TEM 所觀察到的粒徑。這是因?yàn)樗蠈拥拇嬖跁?huì)對(duì)DLS 的激光有折射作用，從而造成了水合動(dòng)力學(xué)粒徑偏大。不同的是，Cu-POMs 的Zeta 電位相較于POMs 明顯升高，由-28.6 mV 上升到了-16.7 mV，推測(cè)是引入的銅離子消耗了POMs 表面帶負(fù)電的巰基基團(tuán)和羧基基團(tuán)所致。

圖2 Cu-POMs 的透射電鏡照片（a）～（c）及其得到的粒徑分布直方圖（d）；POMs 和Cu-POMs 的Zeta 電位及DLS 粒徑（e）Fig. 2 TEM images (a)～(c) of Cu-POMs and the histogram of particle size distribution obtained from them (d); Zeta potential and DLS particle size of POMs and Cu-POMs (e)

圖3(a)是POMs 和Cu-POMs 的XRD 譜 圖，可以看出二者的結(jié)晶度均較低，在21°左右的主峰可推測(cè)為PS-b-PAA 膠束的峰。另外，Cu-POMs 中并未出現(xiàn)明顯的銅的化合物的特征峰，這可能是因?yàn)镃u 在POMs 上的存在形式為納米簇。為了進(jìn)一步探究Cu-POMs 相較于POMs 表面巰基含量的變化，進(jìn)一步利用拉曼光譜對(duì)PMs、POMs 和Cu-POMs 進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3(b)所示。與PMs 相比，POMs 和Cu-POMs 均分別在510 cm-1處和2 570 cm-1處出現(xiàn)了二硫鍵（-S-S-）和巰基（-SH）的特征峰，這充分證明了MPTMS 成功引入到PMs表面，發(fā)生水解縮聚形成了有機(jī)硅層。此外，Cu-POMs 巰基的特征峰強(qiáng)度相較于POMs 有明顯的降低，表明其表面的巰基含量有所下降，這對(duì)應(yīng)了Zeta 電位的表征結(jié)果，說明Cu 離子的引入確實(shí)消耗了POMs 表面的部分巰基。為了證實(shí)Cu-POMs 中Cu 元素的存在，進(jìn)一步對(duì)Cu-POMs 進(jìn)行了元素能譜（EDS）分析，如圖4(a)所示。從圖4(a)中可以看到，在0.9、8.0 keV和8.9 keV 處均出現(xiàn)了Cu 元素的特征峰，這證實(shí)了Cu 離子在POMs 上的成功負(fù)載。此外，Si 元素和S元素的存在則進(jìn)一步證實(shí)了PMs 表面有機(jī)硅網(wǎng)絡(luò)的形成。為了進(jìn)一步探究Cu-POMs 上Cu 元素的價(jià)態(tài)，利用XPS 對(duì)其進(jìn)行分析。圖4(b)示出了Cu-POMs 的Cu 2p 譜圖，從圖中可以看出，在952.3 eV 和932.4 eV處有兩個(gè)主要峰，分別對(duì)應(yīng)于Cu+的Cu+2p1/2和Cu+2p3/2，這與文獻(xiàn)報(bào)道的Cu+結(jié)合能值完全吻合[21]。此外，另有兩個(gè)特征峰分別在953.9 eV 和934.8 eV處，分別代表Cu2+的Cu2+2p1/2和Cu2+2p3/2[22]。以上結(jié)果為Cu-POMs 中Cu+的存在提供了可靠的證據(jù)，而Cu+的存在則是由于巰基將Cu2+還原所致。圖5所示是Cu-POMs 的暗場(chǎng)高分辨透射電鏡照片及其元素掃描分析，可以清晰地看到Cu 元素主要分布在膠束納米顆粒表面，這進(jìn)一步證明了Cu 元素的成功負(fù)載。

圖3 POMs 和Cu-POMs 的XRD 譜圖（a）；PMs、POMs 和Cu-POMs 的拉曼光譜圖（b）Fig. 3 XRD patterns of POMs and Cu-POMs (a); Raman spectra of PMs，POMs and Cu-POMs (b)

圖4 Cu-POMs 的EDS 譜圖（a）和XPS Cu 2p 局部選區(qū)譜圖（b）Fig. 4 EDS (a) and local XPS spectra (b) of the Cu 2p region of Cu-POMs

2.2 Cu-POMs 的穩(wěn)定性

納米材料的穩(wěn)定性是衡量其能否在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的一個(gè)重要指標(biāo)。圖6 所示的數(shù)碼照片顯示，120 h 后Cu-POMs 仍然具有優(yōu)異的分散性，更重要的是，Cu-POMs 在不同介質(zhì)中120 h 內(nèi)的流體力學(xué)直徑無明顯變化，表明其擁有良好的生物穩(wěn)定性。

2.3 Cu-POMs 的離子釋放

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cu-POMs 的生物安全性，探究了其在不同pH 條件下的離子釋放，結(jié)果如圖7 所示。在pH 7.4 的條件下，48 h 內(nèi)銅離子的累積釋放量僅為10%左右，說明Cu-POMs 在生理環(huán)境中能夠維持穩(wěn)定。對(duì)比鮮明的是，在pH 為6.5 和5.0 的環(huán)境中，Cu-POMs 的銅離子的累積釋放量顯著增加，分別達(dá)到了55%和69%。這一結(jié)果表明了Cu-POMs具有pH 響應(yīng)特性，既能夠充分利用腫瘤中的微酸環(huán)境，同時(shí)也避免了其在正常組織中泄露出銅離子，進(jìn)一步確保了其生物安全性。

2.4 類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基

眾所周知，能夠通過芬頓反應(yīng)或者類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生具有高細(xì)胞毒性的羥基自由基（?OH）是納米藥物可用于癌癥的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療的前提。由XPS的分析結(jié)果可知，Cu-POMs 的表面存在著豐富的Cu+，有望發(fā)生類芬頓反應(yīng)生成?OH。本文通過MB 的降解實(shí)驗(yàn)評(píng)估了Cu-POMs 催化H2O2產(chǎn)生?OH 的能力。

圖5 Cu-POMs 的高分辨TEM 圖像及其元素掃描分布Fig. 5 High-resolution TEM image of Cu-POMs and the corresponding element mapping

圖6 Cu-POMs 在不同介質(zhì)中120 h 內(nèi)的水合動(dòng)力學(xué)粒徑（嵌入：120 h 時(shí)的數(shù)碼照片）Fig. 6 Hydrodynamic sizes of Cu-POMs stored in different mediums for 120 h (Insert: the digital photograph at 120 h)

圖7 Cu-POMs 在不同pH 的緩沖液和不同時(shí)間時(shí)銅離子的釋放Fig. 7 Cu ions release of Cu-POMs after coincubation with buffers with various pH at different time

鑒于Cu-POMs 具有pH 響應(yīng)的特性，首先探究了在不同pH 下Cu-POMs 發(fā)生芬頓反應(yīng)降解MB 的效率。圖8(a)所示為Cu-POMs 在不同pH 條件下加入100 μmol/L H2O2時(shí)MB 的時(shí)間-降解曲線，可以看出，在pH = 7.4 時(shí)，1 h 內(nèi)MB 的降解率僅為15.9%，遠(yuǎn)低于pH 為6.5 和5.0 條件下的43.0%和48.2%，這可能歸因于Cu-POMs 在低pH 的環(huán)境中會(huì)釋放出足量的Cu+，從而催化H2O2生成能夠使MB 褪色的?OH。另外，從反應(yīng)10 min 后的紫外-可見光吸收光譜圖中也可以看出，pH = 7.4 時(shí)在664 nm 處的吸收峰強(qiáng)度幾乎無下降，而pH 為6.5 和5.0 時(shí)有明顯的降低（圖8(b)）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cu-POMs 不僅能夠有效地發(fā)生類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生?OH，還能響應(yīng)于TME 微酸的特性釋放Cu+。

圖8 MB 與Cu-POMs (ρ(Cu)=50 μg/mL)+H2O2(100 μmol/L)在不同pH 條件下反應(yīng)后的降解-時(shí)間曲線（a）和紫外-可見光吸收光譜（b）Fig. 8 Degradation-time curves (a) and UV-Vis spectra (b) of MB treated with Cu-POMs (ρ(Cu) = 50 μg/mL), and H2O2(100 μmol/L) under different pH conditions

圖9 MB 與Cu-POMs (ρ(Cu)=50 μg/mL）+H2O2(100 μmol/L)在pH 6.5 和不同濃度的GSH 條件下反應(yīng)后的降解-時(shí)間曲線（a）和反應(yīng)10 min 后的紫外-可見光吸收光譜（b）Fig. 9 Degradation-time curves (a) and UV-Vis spectra (after 10 min reaction) (b) of MB treated with Cu-POMs(ρ(Cu) = 50 μg/mL), and H2O2 (100 μmol/L) at pH 6.5 under different concentration of GSH conditions

腫瘤細(xì)胞內(nèi)較高濃度的GSH 可以消耗?OH，從而使得CDT 治療效果大打折扣。幸運(yùn)的是，具有高還原性的GSH 可以還原由Cu+催化H2O2生成的Cu2+，將其再次轉(zhuǎn)化為高催化活性的Cu+。因此，進(jìn)一步探究了不同濃度的GSH 對(duì)Cu-POMs 發(fā)生類芬頓反應(yīng)的影響。如圖9(a)所示，相較于不添加GSH 的組，反 應(yīng)60 min 時(shí)，GSH 濃 度 為20 μmol/L 組 的MB 降解率稍有提高（45.9%），更明顯的是，GSH 濃度為10 mmol/L 組的降解率增高至57.2%。從圖9(b)中也可看出，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到10 min 時(shí)，GSH 濃度為20 μmol/L和10 mmol/L 組在664 nm 處的吸收峰強(qiáng)度均比不外加GSH 組的低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了GSH 可以促進(jìn)Cu-POMs 中Cu+的再生，從而提高類芬頓反應(yīng)的效率。

另外，探究了不同濃度的H2O2對(duì)Cu-POMs 發(fā)生類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生?OH 的影響。從圖10(a)中可以看出，反應(yīng)60 min 時(shí)H2O2濃度分別為100、400、1 000 μmol/L 條件下，MB 的降解率分別為43.0%，54.7%和64.2%。圖10(b)也顯示10 min 后，1 000 μmol/L組在664 nm 處的吸收峰強(qiáng)度最低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過上調(diào)H2O2的濃度也可以提高類芬頓反應(yīng)的效率。

2.5 Cu-POMs 的細(xì)胞毒性

圖10 MB 與Cu-POMs （ρ（Cu） = 50 μg/mL）和不同濃度的雙氧水在pH 6.5 條件下反應(yīng)后的降解-時(shí)間曲線（a）和反應(yīng)10 min 后的紫外-可見光吸收光譜（b）Fig. 10 Degradation-time curves (a) and UV-Vis spectra (after 10 min reaction) (b) of MB treated with Cu-POMs(ρ(Cu) = 50 μg/mL), and different concentration of H2O2 at pH 6.5

圖11 SMMC-7721 細(xì)胞與不同濃度的H2O2 孵育24 h 后的細(xì)胞存活率Fig. 11 Cell viabilities of SMMC-7721 cells after 24 h incubation with various concentrations of H2O2

在進(jìn)行Cu-POMs 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)之前，首先探究了H2O2對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞的影響。圖11 示出了SMMC-7721 細(xì)胞與不同濃度的H2O2孵育24 h 后的細(xì)胞存活率。圖11 可以看出，當(dāng)H2O2濃度不高于200 μmol/L 時(shí)，H2O2對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞的殺傷作用幾乎沒有。然而，當(dāng)H2O2濃度為500 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率出現(xiàn)了明顯的下降，特別地，當(dāng)H2O2濃度為1 000 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率僅為16.1%。雖然過高濃度的雙氧水可以有效地殺死腫瘤細(xì)胞，但TME中過表達(dá)的雙氧水水平也僅為100 μmol/L 左右，所以需要通過其他途徑來抑制和消除腫瘤細(xì)胞。進(jìn)一步探究了Cu-POMs 對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用。圖12(a)所示為SMMC-7721 細(xì)胞與POMs 或Cu-POMs 共同孵育24 h 后的細(xì)胞存活率，從圖中可以看出，POMs組的細(xì)胞存活率幾乎均接近100%，表明POMs 無法殺死腫瘤細(xì)胞。對(duì)比鮮明的是，隨著材料濃度的增大，Cu-POMs 對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞的毒性也呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，特別地，當(dāng)Cu-POMs 質(zhì)量濃度為480 μg/mL（ρ（Cu） = 24 μg/mL）時(shí)，細(xì)胞存活率只有55.0%，與POMs 構(gòu)成了顯著性差異。另外，將NIH-3T3 細(xì)胞與POMs 或Cu-POMs共同孵育24 h 后，即便材料質(zhì)量濃度達(dá)到480 μg/mL時(shí)，POMs 和Cu-POMs 均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性（圖12(b)）。這充分說明了POMs 基的納米材料具有良好的生物安全性，Cu-POMs 對(duì)細(xì)胞造成毒性的選擇性表達(dá)，可歸因于它的pH 響應(yīng)特性。

為了進(jìn)一步探究Cu-POMs 對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖13 所示。

圖12 SMMC-7721 細(xì)胞（a）和NIH-3T3 細(xì)胞（b）與不同濃度的POMs 或Cu-POMs 孵育24 h 后的細(xì)胞存活率Fig. 12 Cell viabilities of SMMC-7721 cells (a) and NIH-3T3 cells (b) after 24 h incubation with POMs or Cu-POMs at various particle concentrations. Data were presented as mean ± SD (n=5, *p＜0.05, ***p＜0.001)

圖13 與不同樣品共孵育24 h 并通過Annexin-V/PI 試劑染色后的SMMC-7721 細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果Fig. 13 Flow cytometry analysis of SMMC-7721 cells after 24 h incubation with different samples and staining by Annexin-V/PI reagents

從圖13 中可以看出，與對(duì)照組相比，POMs 組和H2O2組的細(xì)胞幾乎無凋亡和壞死，表明了POMs和TME 中H2O2濃度 (100 μmol/L)不會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞造成殺傷。然而，Cu-POMs 組的腫瘤細(xì)胞凋亡率高達(dá)57.5%，進(jìn)一步表明了Cu-POMs納米粒子有作為CDT試劑的潛力，在腫瘤治療領(lǐng)域擁有良好的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

（1）采用一種簡便的“原位還原”策略制備了粒徑約為44 nm 的Cu-POMs，其具有良好的均一性與分散性，在不同介質(zhì)中120 h 內(nèi)的流體力學(xué)粒徑無明顯變化，具有優(yōu)異的生物穩(wěn)定性。

（2）Cu-POMs 具有pH 響應(yīng)和GSH 消耗特性，能夠充分利用TME 中微酸環(huán)境和GSH 過表達(dá)的特點(diǎn)，催化H2O2生成高細(xì)胞毒性的?OH。同時(shí)，還能避免在正常組織中泄露出銅離子，確保了生物安全性。