皮本元，魏媛媛，佘文勝

(鄂州市中心醫(yī)院耳鼻喉科，湖北 鄂州 436000)

鼻咽癌(NPC)是一種起源于鼻咽部黏膜上皮細(xì)胞的上皮性惡性腫瘤，主要在我國(guó)南方流行[1]。NPC對(duì)放射治療比其他頭頸部惡性腫瘤更敏感，故5年總生存率從32%增加到52%[2-3]。然而放療后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是該病治療失敗的主要原因[4]。因此盡早診斷和治療是改善患者預(yù)后的重要措施。目前許多證據(jù)[5-8]表明環(huán)狀RNA(circRNA)在腫瘤形成過(guò)程中具有重要作用。同時(shí)有研究[8]顯示circRNA在NPC中亦發(fā)揮重要作用。在NPC細(xì)胞中，circRNA的表達(dá)與其抗輻射表型有關(guān)。SU等[9]從人類食管鱗癌親本細(xì)胞系KYSE-150和自建放射抗拒細(xì)胞系KYSE-150R的基因芯片數(shù)據(jù)中獲得了大量的circRNA差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)circRNA_100367表達(dá)明顯上調(diào)；LIU等[10]進(jìn)一步證實(shí)circRNA_100367可通過(guò)miR-217/Wnt3通路調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的放療敏感性。然而circRNA_100367在調(diào)節(jié)NPC放療敏感性方面的作用尚不清楚。因此，在本研究中利用臨床樣本探討circRNA_100367在NPC診斷和放療反應(yīng)預(yù)測(cè)中的價(jià)值，旨在為NPC的臨床治療提供新的生物標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2010年9月至2017年10月在鄂州市中心醫(yī)院頭頸外科耳鼻咽喉科接受根治性放射治療的NPC患者(NPC組)血清樣本222例，其中男164例，女58例，年齡18～76歲。同時(shí)，收集同期健康人(來(lái)源于體檢人群)的血清樣本200例作為對(duì)照組。所有患者在術(shù)后放療前收集血清樣本用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有受試者提供書(shū)面知情同意參與本研究。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1)18歲及以上；2)病理活檢診斷為無(wú)角化和/或未分化鼻咽癌(世界衛(wèi)生組織Ⅱ/Ⅲ型)；3)無(wú)抗癌治療史和癌癥病史；4)Kamofsky評(píng)分≥80分；5)診斷時(shí)無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和伴發(fā)惡性腫瘤證據(jù)；6)心臟功能(紐約心臟協(xié)會(huì)心功能分級(jí)≤Ⅱ級(jí))、肝臟(總膽紅素和丙氨酸含量≤1.5倍參考上限)和腎功能(肌酐含量≤1.5倍參考上限)正常；7)完成處方治療；8)在獲得血清前未接受放療或化療。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)第八版分期系統(tǒng)進(jìn)行TNM分期。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1)對(duì)放療不耐受者；2)血清基線生化數(shù)據(jù)不完整者；3)未完成規(guī)定治療方案或任何原因退出研究者。

1.2 放射治療方法

治療前的評(píng)估包括完整的病史、身體檢查、血液學(xué)和生物化學(xué)特征、纖維鼻咽鏡、胸部X線片、腹部超聲、鼻咽和頸部磁共振成像、全身骨骼掃描或全身FDG PET/CT。根據(jù)本院治療原則，原發(fā)腫瘤和頸部惡性淋巴結(jié)均采用調(diào)強(qiáng)放療(IMRT)。用Elekta直線加速器(Precise 1120，瑞典Elekta公司)以220 cGy·min-1的劑量率對(duì)患者進(jìn)行6MV X射線治療。計(jì)劃劑量為鼻咽部腫瘤體積(GTVnx)計(jì)劃靶體積(PTV)66～72 Gy(28～33 次分割)，惡性淋巴結(jié)腫瘤體積(GTVnd)的PTV為64～70 Gy(28～33 次分割)。原則上，Ⅰ期患者單獨(dú)使用放療，Ⅱ期患者進(jìn)行單獨(dú)化療或同步放化療，晚期患者(Ⅲ—Ⅳ期)進(jìn)行同步放化療并/或不并誘導(dǎo)/輔助鉑類化療(IC/AC)。經(jīng)過(guò)7～8周的放射治療后，根據(jù)治療效果分患者為放射敏感組和抵抗組。放射抵抗是指放射治療結(jié)束后3個(gè)月以上有持續(xù)性病變(原發(fā)腫瘤和/或頸部淋巴結(jié)不完全消退)或鼻咽和/或頸部淋巴結(jié)局部復(fù)發(fā)的患者。放射敏感指放射治療后3個(gè)月以上無(wú)局部殘留病變(完全消退)，且12個(gè)月以上無(wú)局部復(fù)發(fā)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

在放療前24～48 h，用外周靜脈穿刺法獲取血樣5 mL，離心取血清樣本并保存在-80 ℃?zhèn)溆?。利用Trizol試劑盒(美國(guó)賽默飛公司)提取血清總RNA。RNase R(美國(guó)Epicentre公司)用于降解線性RNA。使用1 μg circRNA，采用PrimeScriptTMRT試劑盒(大連寶生物工程有限公司)合成cDNA。應(yīng)用SYBR premix Ex Taq試劑盒(大連寶生物工程有限公司)配制10 μL反應(yīng)體系(2 μL cDNA模板)，在Applied BiosystemsABI 7500 Real Time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)：95 ℃ 2 min，39個(gè)擴(kuò)增周期(95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)。每個(gè)周期后測(cè)量熒光曲線。采用2-ΔΔCt法測(cè)定circRNA_100367的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：(正向)5′-GGCACTGGAACCAGACTCTC-3′，(反向)5′-GTAGCCAGCCTTTCCTCCTT-3′。

1.4 觀察指標(biāo)

比較2組血清circRNA_100367水平。單因素和多因素Logistic回歸分析血清circRNA_100367水平與NPC患者臨床病理特征、放療反應(yīng)及預(yù)后的關(guān)系。預(yù)后指標(biāo)：無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)、次要終點(diǎn)包括總生存率(OS)、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率(DMF)；PFS指從確診之日到疾病進(jìn)展之日或最后一次隨訪之日的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組血清circRNA_100367水平比較

對(duì)照組、NPC組血清circRNA_100367相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.27、2.53±1.82，2組間比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.767，P<0.001)。見(jiàn)圖1。ROC曲線結(jié)果顯示，血清circRNA_100367水平用于NPC診斷的ROC曲線下面積為0.857(95%CI：0.821～0.892)，對(duì)應(yīng)截?cái)嘀禐?.433，特異度為94.5%，敏感度69.8%。見(jiàn)圖2。

圖1 2組血清circRNA_100367水平比較

1-特異性

2.2 NPC患者血清circRNA_100367水平與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)ROC曲線得到的最佳截?cái)嘀?.433，將NPC患者分為低表達(dá)組(<1.433)和高表達(dá)組(≥1.433)。經(jīng)單因素分析，NPC患者血清circRNA_100367表達(dá)水平與患者年齡、TNM分期有關(guān)(均P<0.05)，而與患者性別、病理分型、T分期、N分期、有無(wú)化療、KPS評(píng)分、PGTVnx、PGTVnd、血紅蛋白水平均無(wú)顯著相關(guān)性(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NPC患者血清circRNA_100367水平與臨床病理特征的關(guān)系 n(%)

2.3 NPC患者血清circRNA_100367水平與放療反應(yīng)性的關(guān)系

根據(jù)放療效果分為放射敏感組(n=149)和抵抗組(n=73)。對(duì)于進(jìn)行單純放療的患者，放射敏感組血清circRNA_100367水平低于抵抗組[(1.87±1.38 )比(3.77±2.05)，t=3.204、P=0.003]。見(jiàn)圖3A。對(duì)于聯(lián)合化療的患者，放射敏感組血清circRNA_100367水平亦顯著低于抵抗組[(1.75±1.05)比(4.12±2.01)，t=10.519、P<0.001]。見(jiàn)圖3B。

A：?jiǎn)渭兎暖熁颊?；B：同步放化療患者。

2.4 單因素和多因素Logistic回歸分析NPC患者血清circRNA_100367水平與放療反應(yīng)的關(guān)系

經(jīng)單因素和多因素Logistic回歸分析，T分期、血清circRNA_100367水平是放療反應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 血清circRNA_100367水平與放療反應(yīng)的關(guān)系

2.5 ROC曲線分析血清circRNA_100367對(duì)放療反應(yīng)的預(yù)測(cè)價(jià)值

血清circRNA_100367預(yù)測(cè)放療反應(yīng)的ROC曲線下面積為0.860(95%CI：0.807～0.913)，對(duì)應(yīng)截?cái)嘀禐?.222，特異度為78.1%，敏感度80.5%。見(jiàn)圖4。

1-特異性

2.6 Kaplan-Meier生存曲線分析

隨訪期間，NPC患者術(shù)后中位生存時(shí)間均為29個(gè)月，血清circRNA_100367低表達(dá)組和高表達(dá)組患者無(wú)進(jìn)展生存率分別為77.0%(114/148)、47.3%(35/74)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.647，P<0.001)；總生存率分別為81.8%(121/148)、59.5%(44/74)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.978，P=0.001)；無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率分別為90.5%(134/148)、68.9%(51/74)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.694，P<0.001)。見(jiàn)圖5。

圖5 Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

放療是鼻咽癌患者的首選治療方法[3]。然而，約30%的NPC因放療抵抗在放療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是許多患者治療成功的主要障礙[11]。因此，確定可靠的預(yù)測(cè)放療敏感性的特異生物標(biāo)志物對(duì)NPC的治療及改善患者預(yù)后至關(guān)重要。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了NPC患者和健康對(duì)照血清circRNA_100367表達(dá)水平的差異，并評(píng)估了其在NPC放療反應(yīng)及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值，結(jié)果表明，NPC患者血清circRNA_100367水平顯著高于對(duì)照組。此外，與放射敏感組NPC患者相比，放射抵抗組患者血清circRNA_100367表達(dá)顯著增加。而且，進(jìn)一步的分析表明基線血清circRNA_100367水平升高可能是NPC患者放療抵抗的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

與線性RNA不同，circRNA以閉環(huán)結(jié)構(gòu)存在于體內(nèi)，在多種體液中穩(wěn)定表達(dá)，具有較高的組織特異性[12]。有證據(jù)[6]揭示了circRNA在癌癥中的功能，它可能作為一個(gè)新的生物標(biāo)志物和癌癥治療的靶標(biāo)。例如，LIU等[13]的研究表明，高水平的circRPMS1與NPC患者的轉(zhuǎn)移和較差的生存結(jié)果相關(guān)，這表明circRPMS1可能是愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒相關(guān)NPC的潛在預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。SHUAI等[14]報(bào)道了hsa_circRNA_001387在NPC中高表達(dá)，與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為NPC良好的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。CHEN等[15]發(fā)現(xiàn)circ_0000215在NPC中的表達(dá)顯著上調(diào)，可用作NPC的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)表明，circRNA可能成為一種新型的癌癥診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)早期診斷腫瘤和改善患者生活質(zhì)量具有重要的潛在臨床價(jià)值[16]。先前有研究也確定了hsa _ circRNA_100367在其他類型的癌癥中的作用，如LIU等[10]證實(shí)circRNA_100367在人類抗輻射食管癌細(xì)胞系中顯著上調(diào)。此外，下調(diào)circRNA_100367通過(guò)下調(diào)miR-217靶基因/Wnt3蛋白抑制KYSE-150R細(xì)胞的增殖和集落形成[10]。這些研究表明，circRNA_100367的功能具有一定的癌癥特異性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NPC患者血清circRNA_100367的表達(dá)明顯不同，NPC組患者的血清circRNA_100367的水平顯著高于對(duì)照組，經(jīng)ROC曲線結(jié)果顯示，基線血清circRNA_100367用于診斷NPC的AUC>0.7，說(shuō)明circRNA_100367有望成為NPC潛在的生物標(biāo)志物。

放射抵抗是目前癌癥復(fù)發(fā)和治療失敗的重要原因之一[4]。因此，提高對(duì)放療的敏感性是提高鼻咽癌治療成功率的重點(diǎn)。非編碼RNA(ncRNA)已被確定為NPC放療的促進(jìn)劑或抑制劑，一般主要通過(guò)調(diào)節(jié)與放療敏感性密切相關(guān)的重要過(guò)程的不同基因來(lái)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞對(duì)放療的反應(yīng)[17]。首先，ncRNA可通過(guò)調(diào)控DNA損傷感覺(jué)和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯影響放療敏感性，例如LncRNA PVT1的敲低顯著降低了ATM、p53和Chk2的磷酸化水平，導(dǎo)致NPC細(xì)胞在放療后的DNA修復(fù)能力下降并增強(qiáng)其放射敏感性[18]。其次，ncRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)影響放療敏感性，例如miR-24可以通過(guò)直接調(diào)節(jié)Jab1/CSN5抑制NPC腫瘤生長(zhǎng)并增加NPC放射敏感性。最近，有證據(jù)[19]發(fā)現(xiàn)一些circRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡來(lái)影響癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。先前研究[5]表明，circRNA通過(guò)以序列特異性方式隔離靶miRNA發(fā)揮作用，從而降低miRNA活性并增加miRNA靶基因的表達(dá)。這些circRNA可能作為miRNA海綿發(fā)揮作用，轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，或與RNA結(jié)合蛋白相互作用，以調(diào)節(jié)其下游靶點(diǎn)。例如，Hsa_circRNA_006660被進(jìn)一步證明可通過(guò)miR-1276增強(qiáng)放射敏感性[20]。circRNA_000543可以作為NPC中miR-9的海綿，通過(guò)靶向miR-9/PDGFRB軸使NPC細(xì)胞對(duì)放療敏感[21]。circRNA_100367可通過(guò)調(diào)控下游靶點(diǎn)miR-217/Wnt3來(lái)調(diào)節(jié)放療敏感性[10]。這些研究表明，circRNA_100367可能是鼻咽癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和放射敏感性的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究結(jié)果顯示敏感組患者放療后血清circRNA_100367水平降低且顯著低于放療抵抗患者，而且進(jìn)一步的研究證實(shí)，circRNA_100367表達(dá)水平是放療抵抗的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。提示血清circRNA_100367水平升高可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，進(jìn)而導(dǎo)致患者放療失敗和預(yù)后不良。

綜上，circRNA_100367水平在NPC患者血清中顯著上調(diào)，并且與患者放射抵抗性有關(guān)，提示血清中 circRNA_100367可能是預(yù)測(cè)NPC放療效果和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)耐藥性的新生物標(biāo)志物。但是本研究也存在一定的局限性，例如樣本量仍然偏小，circRNA_100367作用機(jī)制尚不明確，需要更深入的體內(nèi)外研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)其在NPC中的臨床應(yīng)用價(jià)值。