李哲源，王志剛，王紅梅，閔衛(wèi)平

(1.南昌大學基礎醫(yī)學院a.病理生理教研室； b.免疫學教研室； 2.江西省醫(yī)學科學院腫瘤研究所,南昌 330006)

在我國，由于醫(yī)療資源的不足和個人對身體健康的忽視，很多患者發(fā)現(xiàn)腫瘤時已處于晚期，錯失了最佳治療時機，其治療效果和預后較差[1]；而對外泌體的檢測能夠反映腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，為診斷提供更多信息，為癌癥的早期發(fā)現(xiàn)提供一條新途徑。腫瘤循環(huán)細胞(CTC)檢測主要用于去勢抵抗性前列腺癌患者(CRPC)[2]，CTC是擴散到血液或淋巴系統(tǒng)的癌細胞[3]，外周血高CTC計數(shù)往往與較差的預后有關，在前列腺癌(PCa)、結腸癌、乳腺癌中，以計數(shù)≥5 個·7.5 mL-1可判斷為預后不良，對預測患者的總生存時間及預后有著很好的效果[4]。前列腺癌是世界范圍內男性第二常見的癌癥，大多數(shù)前列腺癌相關死亡是由于局部晚期或轉移性疾病所致[5-6]，目前也缺乏對轉移性前列腺癌有效的治療方案[7]，標準治療方案為雄激素剝奪療法，可控制和緩解癌癥，但這種治療方法仍不能滿足CRPC患者。因此通過開發(fā)能夠檢測惡性腫瘤的方法來提高疾病早期診斷水平顯得尤為重要，且有必要針對前列腺癌開發(fā)更特異的生物標志物，以此來改善和減少過度診斷、過度治療。而外泌體能夠參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移，外泌體中的信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNAs)、非編碼RNA、蛋白質、脂質等可以作為前列腺癌腫瘤標志物，通過檢測尿液、血液等體液中的外泌體相關腫瘤標志物，能提高對疾病的早期預防。本文對外泌體在前列腺癌診斷中的應用研究進展進行綜述，以期為進一步尋找外泌體內容物中更多特異性高的腫瘤生物標志物提供參考。

1 現(xiàn)階段前列腺癌常用的診斷方法

目前一般將前列腺特異性抗原(PSA)檢測與直腸指診(DRE)相結合來篩查前列腺癌。PSA特異性存在于人前列腺腺泡及導管上皮細胞胞漿中，前列腺的結構致密，PSA幾乎不可能進入血液中，當前列腺結構遭破壞，血清PSA水平升高，會顯著增加PCa的風險[8]。但PSA水平升高并不是PCa所特有的，在患有良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎癥的男性中，PSA水平也可升高[9-10]，PSA篩查的假陽性結果以及前列腺穿刺活檢的副作用會產生過度檢測、過度治療，這無疑增加了患者的心理壓力和醫(yī)療費用，甚至會產生不良反應[11]，當PSA水平超過4.0 ng·mL-1或DRE異常時，通常會懷疑是前列腺癌，但此標準可能會隨著年齡、種族和個人生理狀況的變化而變化[12]。PSA檢測不能很好地區(qū)分前列腺癌或BPH[13]。目前對于PSA灰區(qū)患者，可利用游離PSA/總PSA比值來區(qū)分PCa與BPH，但其診斷敏感性和特異性不足，僅為75%和32%[14]。DENHAM等[15]認為游離PSA/總PSA的比值在臨床中區(qū)分PCa和BPH方面并無優(yōu)勢，澳大利亞各州對PSA的要求與游離PSA/總PSA比值的要求有很大差異。PCA3也是目前應用十分廣泛的前列腺癌尿液標志物，尿PCA3檢測是美國食品和藥物管理局(FDA)于2012年批準的，樣本為DRE后的尿液，方法簡單快捷。

2 外泌體簡介

2.1 外泌體的作用機制

外泌體呈杯狀或扁平球形態(tài)，直徑在30～150 nm，外泌體參與細胞間的通訊、凝血、核酸與蛋白質轉移[16-17]，同時也有類似抗原呈遞細胞刺激體內免疫反應的作用[18]，外泌體與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移等過程密不可分[19]。外泌體有3種方式進入受體細胞：1)與細胞膜直接融合進入受體細胞；2)外泌體通過表面分子與受體細胞膜表面分子結合進入；3)受體細胞的內吞作用使外泌體進入并分泌外泌體內容物，進而發(fā)揮外泌體作用[20]。

前列腺癌中跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)與成紅細胞病毒E26致癌物(ERG)融合基因已被證明與較差的預后相關[21]，可利用外泌體液體活檢產品ExoDx Prostate IntelliScore(EPI)對PSA灰區(qū)患者的尿液外泌體中3個RNA(ERG、PC3、SPDEF)進行檢測，避免不必要的穿刺活檢。外泌體作為一把雙刃劍，不僅能夠幫助臨床對疾病的檢測，還能誘導免疫細胞的凋亡，降低人體免疫系統(tǒng)的功能，前列腺癌外泌體中的Fas配體通過誘導CD8+T細胞的凋亡，抑制T細胞反應，完成前列腺癌細胞的免疫逃逸[22]。

2.2 外泌體作為生物標志物的優(yōu)勢

前列腺癌患者血清外泌體可通過PKM2誘導骨髓間充質干細胞的CXCL12促進PCa腫瘤生長[23]，說明外泌體可能是前列腺癌潛在的腫瘤標記物。外泌體作為生物標志物有以下優(yōu)點：1)腫瘤細胞釋放的外泌體中含有腫瘤相關分子，可以在血液[24]、尿液[25]、精液[26]和母乳[27]等體液中進行分析；2)外泌體的脂質雙分子層結構能很好地維持其中核酸的穩(wěn)定性，不會被RNase降解；3)可以通過無創(chuàng)的方法從患者尿液、精液中提取外泌體；4)外泌體膜表面的特異性蛋白有利于反映其親代細胞的生理、病理功能[28]。一些外泌體中包含的蛋白質，mRNAs、miRNAs、脂質已被確定為潛在的前列腺癌生物標志物[29]。

3 外泌體的內容物與前列腺癌的關系

3.1 mRNA

激肽釋放酶3(KLK3)和雄激素受體剪接變異體7(AR-V7)這2種基因分別編碼PSA和AR-V7。最近發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者血漿外泌體中可檢測到KLK3 mRNA，外泌體KLK3與血清PSA值有很強的相關性，AR-V7是前列腺癌特異性mRNA，通過檢測外泌體AR-V7 mRNA的結果顯示，在CRPC患者中，外泌體AR-V7的表達與性激素水平有關，AR-V7的表達與不良預后及對阿比特龍、恩雜魯胺的反應降低相關[30-32]，還有研究[33]發(fā)現(xiàn)晚期前列腺癌患者尿液外泌體中的 AR-V7 mRNA水平和 AR-V7/AR-FL 比值較高。作為典型的PCa生物標志物PSA和PCA3，其mRNA的表達在尿液中PSMA(前列腺特異性膜抗原)陽性外泌體內明顯升高，所以捕獲尿液PSMA陽性外泌體檢測PSA和PCA3 mRNA水平能提高Pca的診斷效率[34]。

3.2 miRNA

miRNAs是長度為18～22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，常通過與其目標蛋白編碼mRNA結合來阻斷基因表達，參與翻譯的抑制和mRNA的降解[7]，外泌體攜帶了豐富的miRNA[5]，在外泌體所含的RNA中，成熟miRNA約占41.72%[13]，miRNA可通過癌基因或抑癌基因影響腫瘤的發(fā)生和進展，所以外泌體miRNA對于腫瘤早期診斷及預后的意義重大，將外泌體中miRNA應用于前列腺癌的液體活檢，能提高PSA檢測的特異性。miR-196A-5p和miR-501-3p在前列腺癌來源尿外泌體樣本中表達下調[5]，PCa患者尿液外泌體中miR-145的水平相比BPH患者顯著升高(P=0.018)，miR-145與Gleason評分顯著相關，Gleason評分≥8分的患者相比于Gleason評分≤7分的患者，miR-145水平顯著增加(P=0.02)，結合外泌體miR-145和血清 PSA，能比單獨用PSA指標更好區(qū)分PCa和BPH，ROC曲線下面積(AUC)分別為 0.863和0.805[35]。另有研究[36]報道PCa患者尿外泌體中的miRNA-21和miRNA-375的表達上調，把兩者結合起來鑒別前列腺癌也具有較大優(yōu)勢，AUC 為 0.872。

miRNA水平與腫瘤的分期有著密切的聯(lián)系，外泌體miRNA具有預測侵襲性或局部性轉移的潛力，可以區(qū)分正常、BPH和侵襲性前列腺癌。miR-888的過表達能使小鼠腫瘤生長加速，且尿外泌體miR-888在CRPC患者中的表達明顯高于正常人和BPH患者[7]。外泌體miRNA 1246在侵襲性PCa中表達失調，侵襲性前列腺癌中外泌體miRNA-1246是正常人的31倍(P=0.026)，是BPH患者的23倍(P=0.035)[37]。

結合PSA與精液外泌體miR-142-3p、miR-142-5p、miR-223-3p的檢測，可以準確地區(qū)分PCa與BPH患者，敏感性為91.7%，特異性為42.9%[26,38]，由此增加PSA篩選測試的特異性。

3.3 lncRNA

lncRNA(長鏈非編碼RNA)能調節(jié)腫瘤抑制、轉移、進展，lncRNA-Myu可以被外泌體包裹運輸，在PCa細胞的細胞外環(huán)境中發(fā)揮作用，lncRNA-Myu水平在前列腺癌組織中顯著上調，lncRNA-Myu通過競爭性結合miR-184上調c-Myc表達，從而誘導前列腺癌細胞的增殖，而Myu基因的敲除會減弱前列腺癌細胞的生長和遷移[39]。外泌體 lncRNA 水平可能有助于診斷 BPH 和 PCa。有證據(jù)證明，lncRNA在不同前列腺疾病中的表達也會不同，BPH組lncRNA-SAP30L-AS1水平明顯高于PCa組(P<0.05)和對照組(P<0.000 1)，PCa組lncRNA-SChLAP1水平明顯高于BPH組(P<0.000 1)和健康人(P<0.000 1)，lncRNA-SChLAP1水平會隨著PCa的進展而增加[40]。

3.4 circRNA

circRNA(環(huán)狀RNA)是一種單鏈閉合RNA，不具有5′端帽子和3′末端poly(A)尾巴，以共價鍵形成閉環(huán)結構，比線性RNA更穩(wěn)定[41]。CircRNA與腫瘤的增殖、遷移有著重要的聯(lián)系[42]。在前列腺癌患者中，能觀察到外泌體circRNA-0044516表達顯著上調，且circRNA-0044516的下調會抑制前列腺癌細胞的增殖和轉移[43]。表明circRNA-0044516在前列腺癌的發(fā)展、轉移中起著重要的作用。通過對前列腺癌患者尿液外泌體circ_0040507的水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組患者尿液外泌體circ_0040507表達水平顯著高于BPH組(t=4.165，P<0.001)，2組ROC曲線下面積為0.767(95%CI0.649～0.884)，4.12 copies·mL-1可作為尿液外泌體circ_0040507診斷前列腺癌最佳臨界值，其靈敏度為68.6%，特異度為77.8%[44]。

3.5 蛋白

外泌體中的PSA可能成為前列腺癌篩查和早期診斷的新工具，以BPH患者作對照，發(fā)現(xiàn)只有PCa患者具有同時高水平表達PSA以及CD81的納米囊泡[12]。與健康人相比，PCa患者血漿中外泌體CA IX(碳酸酐酶9)表達升高[45]， 其原因在于PCa外泌體呈酸性，腫瘤微環(huán)境的酸度導致PCa外泌體中CA IX活性增強，其表達上調[46]。

血清外泌體GGT(γ-谷氨酰轉移酶)活性可能是潛在的PCa生物標志物，免疫組織化學分析顯示，癌組織中GGT1的表達明顯高于BPH組(P<0.01)，且前列腺癌患者血清中外泌體GGT的活性高于BPH患者(P<0.05)[47]。

血漿中CLDN3(封閉蛋白3)的水平隨腫瘤分級的升高而升高。CLDN3是PC3外泌體的一種表面蛋白。Gleason 8級及更高級別的腫瘤患者外泌體表面蛋白CLDN3的表達與BPH或Gleason評分6～7分的患者相比明顯增高 (P=0.029)[48]。

前列腺癌患者血液分離的外泌體高表達αvβ3整聯(lián)蛋白，αvβ3從外泌體中轉移至β3陰性受體細胞，與該疾病高度相關[49]，提示檢測前列腺癌患者的外泌體αvβ3整合素可能是追蹤前列腺癌進展的臨床生物標記物。

3.6 脂類

外泌體中的脂質可能成為潛在的前列腺癌生物標志物。內體分選轉運復合物(ESCRT)在外泌體的形成、釋放中發(fā)揮了重要作用[50]，而有的外泌體是通過ESCRT非依賴機制產生的，中性鞘磷脂酶能夠水解鞘磷脂生成神經酰胺，神經酰胺能不依賴ESCRT形成外泌體，是外泌體形成的關鍵脂質之一[51-52]。對15例前列腺癌患者和13例健康人群尿外泌體進行分析，發(fā)現(xiàn)磷脂酰絲氨酸(PS) 18：1/18：1和乳糖基神經酰胺(LacCer)(d18：1/16：0)最顯著(P<0.001)，后者也是在前列腺癌患者與健康人群樣本中比例差異最高，為95%，特定的脂質組合可以使前列腺癌的診斷得到更好的結果，根據(jù)LacCer(d18：1/16：0)與PS 18：1/18：1和PS 18：0/18：2與PS 18：1/18：1的組合的敏感性為93%，特異性為100%，AUC為0.989[29]。前列腺癌中外泌體相關腫瘤標志物見表1。

表1 前列腺癌中外泌體腫瘤標志物

4 外泌體與前列腺癌的治療與預后

外泌體能夠攜帶各種蛋白質以及核酸等物質的生物學特性，讓它可能成為一種能夠用于腫瘤治療的載體，有證據(jù)表明，外泌體可能具有向癌細胞輸送化療藥物的潛力。前列腺癌患者血清的外泌體，可以影響對多西他賽的反應，CRPC患者以多西紫杉醇為首選抗腫瘤藥，而將紫杉醇裝載到前列腺癌細胞來源外泌體中能增加了它的細胞毒效應，外泌體被PCa細胞持續(xù)攝取，通過內吞作用將紫杉醇輸送到受體細胞，導致藥物從細胞內釋放，增強了藥物能力[53]。

對前列腺癌患者的血漿外泌體進行高通量測序，結果顯示外泌體miR-423-5p在前列腺癌骨轉移中表達下調[54]。在前列腺癌骨轉移過程中，外泌體miR-214能夠記過Notch1信號通路增強了成骨細胞的分化[55]，外泌體miR-940的高表達也明顯增強了前列腺癌骨轉移[56]，骨髓間充質干細胞來源的外泌體miR-21-5p在PC3中的高表達能通過下調PHLPP2蛋白增強其增殖、EMT、遷移、侵襲能力[57]。

LNCAP細胞外泌體miR-26a的過表達能抑制PC-3細胞的增殖、遷移、侵襲能力[58]，人骨髓間充質干細胞衍生外泌體miR-205標高表達有助于抑制前列腺癌細胞并增強其凋亡[59]。隨著前列腺癌臨床分期的增加,外泌體miR-141的表達水平增加[60]，外泌體miR-141-3p能促進成骨細胞骨轉移，縮短生存時間。前列腺癌細胞MDA-PCa-2b外泌體miR-141-3p能調節(jié)骨轉移微環(huán)境，讓成骨細胞活性增強[61]。上述研究表明，通過對前列腺癌這些外泌體內容物的檢測可能為前列腺癌骨轉移治療和預后提供新的可能。

5 總結與展望

PSA結合外泌體內容物的檢測能提高PCa診斷的特異性、敏感性，彌補PSA檢測在假陽性、診斷敏感性、特異性這些方面的不足。外泌體的脂質雙分子層結構使得它還能成為癌癥靶向藥物的載體，增加藥效，說明外泌體不僅是一個有前途的腫瘤生物標志物，更是向人們提供了未來治療癌癥的新途徑。目前外泌體的提取方法主要以超速離心法為主，優(yōu)點是可以適用各種體液類型的標本，但缺點在于儀器昂貴、操作費時、需要的樣本量較大，另外提取的方法還有外泌體沉降法(適合大樣本量，操作簡單，但周期長且純度不高)，免疫親和捕獲法(純度高，但成本高，產率低)、ExoQuick試劑盒法(操作簡單效率高但使用成本也高)、超濾法(純度一般且會因為濾膜的堵塞而有所影響)[16,62]，目前還未開發(fā)出一套效率高、特異性好、成本較低、適用于臨床的標準方案，所以要進一步研究外泌體的提取方案，現(xiàn)有一種新型微流體系統(tǒng)能高效地提取外泌體，操作方便、速度快、純度較高且成本較低，但目前臨床測試很少，效果還有待驗證[62]。若能將這些外泌體生物標記物整合到一個篩查方案中，也許能夠提高PCa診斷水平，避免不必要的穿刺活檢，幫助病患減輕疼痛，降低心理壓力，減少費用。綜上所述，值得進一步尋找外泌體內容物中更多特異性高的腫瘤生物標志物來提高PCa的診斷水平。