劉曉麗，畢 穎，王紹海，陳湘玲，唐軍霞

(1.武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院婦科； 2.華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院婦科，武漢 430015)

宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)是由高危型人乳頭瘤病毒(high risk human pilloma virus，HR-HPV)等引起的一種具有癌變風(fēng)險(xiǎn)的病變。故一旦檢出建議對(duì)患者給予密切隨訪及干預(yù)[1]。物理療法、宮頸冷刀錐切術(shù)或?qū)m頸環(huán)形電切(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)等是CIN的主要治療方法，但術(shù)后可能因病灶殘留、自身免疫等導(dǎo)致HR-HPV未能轉(zhuǎn)陰[2]。若HR-HPV感染持續(xù)存在，可增加CIN復(fù)發(fā)及宮頸癌惡變的危險(xiǎn)，因此早期預(yù)測(cè)CIN術(shù)后HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸對(duì)臨床意義重大[3]。然而，目前臨床尚缺乏預(yù)測(cè)CIN術(shù)后HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸的有效方法。

微小RNA-145(micro RNA-145，miR-145)、miR-135a-5p、miR-365是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的分子。有研究[4-6]顯示，miR-145表達(dá)在HPV感染組織中下調(diào)；浸潤(rùn)宮頸癌患者的miR-135a-5p表達(dá)高于HR-HPV陰性患者[5]；miR-365在宮頸癌組織中表達(dá)低于癌旁組織，并與腫瘤大小、分期等病理特征顯著相關(guān)[6]。目前關(guān)于miR-145、miR-135a-5p、miR-365與HR-HPV宮頸上皮內(nèi)瘤變術(shù)后HR-HPV轉(zhuǎn)歸關(guān)系的報(bào)道鮮見(jiàn)，是否會(huì)影響HR-HPV轉(zhuǎn)歸及是否可作為其預(yù)測(cè)標(biāo)志物尚不清楚?；谝陨媳尘?，本研究探討HR-HPV宮頸上皮內(nèi)瘤變術(shù)后miR-145、miR-135a-5p、miR-365的表達(dá)與HR-HPV轉(zhuǎn)歸的關(guān)系及其聯(lián)合預(yù)測(cè)的價(jià)值，以期為HR-HPV持續(xù)感染機(jī)制的認(rèn)識(shí)及感染轉(zhuǎn)歸的早期預(yù)測(cè)提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年2月至2021年3月于武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院和華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院行手術(shù)治療的98例HR-HPV CIN患者為研究對(duì)象，年齡25～55歲，平均(36.17±5.46)歲，CIN Ⅰ 23例，CIN Ⅱ 41例，CIN Ⅲ 34例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合HR-HPV及CIN診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；2)行激光、微波、宮頸冷刀錐切術(shù)或LEEP等治療者；3)自愿簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)伴免疫缺陷疾病者；2)脫落失訪者；3)伴血液系統(tǒng)疾病者；4)既往有宮頸手術(shù)史者；5)伴急性感染類疾病者；6)伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者。本研究經(jīng)武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院和華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者及直系家屬自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 HR-HPV轉(zhuǎn)陰評(píng)估

采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈法(RT-qPCR)檢測(cè)HR-HPV表達(dá)。以術(shù)后3、6、9、12個(gè)月為門(mén)診隨訪時(shí)間點(diǎn)，以上任意連續(xù)2個(gè)時(shí)間點(diǎn)HR-HPV表達(dá)陰性視為轉(zhuǎn)陰(轉(zhuǎn)陰組)；若術(shù)后 12 個(gè)月仍未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，則定義為持續(xù)感染(未轉(zhuǎn)陰組)。

1.2.2 資料收集

采用一般資料調(diào)查表收集2組年齡、孕次、體重指數(shù)(BMI)、產(chǎn)史、CIN分期、手術(shù)方法、HR-HPV感染數(shù)量和分型。資料收集由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的調(diào)查員實(shí)施。

1.2.3 miR-145、miR-135a-5p、miR-365表達(dá)的檢測(cè)

取活檢或術(shù)中切除的CIN標(biāo)本，采用RT-qPCR法檢測(cè)組織標(biāo)本中miR-145、miR-135a-5p、miR-365表達(dá)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃預(yù)變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，基因的表達(dá)水平以相對(duì)U6作為內(nèi)參。各基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因引物序列

1.3 觀察指標(biāo)

1)比較2組一般資料；2)比較2組CIN組織中miR-145、miR-135a-5p、miR-365的表達(dá)；3)分析影響術(shù)后HR-HPV轉(zhuǎn)陰的因素；4)分析miR-145、miR-135a-5p、miR-365對(duì)HR-HPV轉(zhuǎn)陰的預(yù)測(cè)價(jià)值；5)分析不同miR-145、miR-135a-5p、miR-365表達(dá)者術(shù)后持續(xù)感染的危險(xiǎn)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料比較

術(shù)后3、6、9、12個(gè)月門(mén)診隨訪時(shí)間點(diǎn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)陰組48例(48.98%)，未轉(zhuǎn)陰組50例(51.02%)。2組在年齡、孕次、BMI、產(chǎn)史、CIN分期、手術(shù)方法、HR-HPV感染數(shù)量和分型上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表2。

表2 2組一般資料比較

2.2 2組miR-145、miR-135a-5p、miR-365表達(dá)比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)陰組的miR-145、miR-365表達(dá)低于轉(zhuǎn)陰組，miR-135a-5p表達(dá)高于轉(zhuǎn)陰組(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組組織中miR-145、miR-135a-5p、miR-365表達(dá)比較

2.3 術(shù)后HR-HPV轉(zhuǎn)陰的多因素Logistic回歸分析

以HR-HPV轉(zhuǎn)陰情況為結(jié)局因變量(轉(zhuǎn)陰=0，未轉(zhuǎn)陰=1)，miR-145、miR-135a-5p、miR-365作為自變量(均按實(shí)際值賦值)，結(jié)果顯示，miR-145、miR-365是轉(zhuǎn)陰的保護(hù)因素，miR-135a-5p是轉(zhuǎn)陰的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 術(shù)后HR-HPV轉(zhuǎn)陰的多因素Logistic回歸分析

2.4 miR-145、miR-135a-5p、miR-365對(duì)HR-HPV轉(zhuǎn)陰的預(yù)測(cè)價(jià)值

三者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)HR-HPV轉(zhuǎn)陰的AUC大于三者單獨(dú)檢測(cè)。見(jiàn)圖1和表5。

表5 miR-145、miR-135a-5p、miR-365預(yù)測(cè)HR-HPV轉(zhuǎn)陰的ROC分析

100-特異性/%

2.5 術(shù)后持續(xù)感染的危險(xiǎn)度

以2.4中ROC分析獲得的最佳截?cái)嘀禐榉纸鐦?biāo)準(zhǔn)，將患者分為miR-145、miR-135a-5p、miR-365表達(dá)高水平和低水平，結(jié)果顯示，miR-145、miR-365高水平者持續(xù)感染風(fēng)險(xiǎn)分別是低水平者的0.449、0.465倍，miR-135a-5p高水平者持續(xù)感染風(fēng)險(xiǎn)是低水平者的3.712倍(均P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 不同miR-145、miR-135a-5p、miR-365表達(dá)者術(shù)后持續(xù)感染的危險(xiǎn)度分析

3 討論

CIN術(shù)后部分HR-HPV患者并非即刻轉(zhuǎn)陰，而是隨著時(shí)間推移逐漸轉(zhuǎn)陰。ZHANG等[8]報(bào)道，年長(zhǎng)CIN患者術(shù)后HR-HPV轉(zhuǎn)陰率低于年輕患者，提示年齡是影響HR-HPV轉(zhuǎn)陰情況的因素。本研究在所納入患者年齡、CIN分期等一般資料均衡可比前提下發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)陰組miR-145、miR-365表達(dá)低于轉(zhuǎn)陰組，miR-135a-5p表達(dá)高于轉(zhuǎn)陰組，提示miR-145、miR-135a-5p、miR-365與HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸有關(guān)。

微小RNA是一類非編碼單鏈RNA分子，因可參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，成為近年來(lái)多個(gè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。根據(jù)既往資料[9]，微小NRA的調(diào)節(jié)功能參與了導(dǎo)致宮頸癌和對(duì)病毒感染反應(yīng)的所有過(guò)程，致癌HR-HPV感染會(huì)誘導(dǎo)許多細(xì)胞微小RNA的異常表達(dá)。miR-145可調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲，高表達(dá)miR-145對(duì)原癌基因激活具有明顯抑制作用[10]。YU 等[11]報(bào)道，與健康人相比，HPV感染者miR-145降低，提示miR-145與HPV感染有關(guān)，但在HR-HPV感染臨床轉(zhuǎn)歸中所扮演角色尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，與術(shù)后轉(zhuǎn)陰患者比較，未轉(zhuǎn)陰患者miR-145降低，是轉(zhuǎn)陰的保護(hù)因素。在尖銳濕疣組織中，用miR-145模擬物上調(diào)miR-145表達(dá)后，尖銳濕疣組織細(xì)胞增殖減少，凋亡增加，而敲除miR-145后，HPV感染的尖銳濕疣組織細(xì)胞凋亡顯著減少[12]。孫依娜等[13]利用第二代雜交捕獲法對(duì)HPV-DNA進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中miR-145表達(dá)與HPV感染、HPV E6/E7 mRNA呈負(fù)相關(guān)，提示miR-145高表達(dá)對(duì)HR-HPV感染具有抑制作用，本研究結(jié)果與之相似。miR-145高水平者持續(xù)感染風(fēng)險(xiǎn)是低水平者的0.449倍，亦證實(shí)了miR-145的保護(hù)因子作用。miR-145抑制HR-HPV感染的機(jī)制目前尚未完全闡明。結(jié)合既往資料[14]，miR-145甲基化是通過(guò)靶向核小體結(jié)合的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3影響HR-HPV感染的，但是否還有其他機(jī)制仍需深入論證。

miR-135a-5p在結(jié)直腸癌等癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，與癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡有關(guān)[15]。王亦如等[16]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織miR-135a-5p表達(dá)高于正常宮頸組織。本研究顯示，miR-135a-5p在未轉(zhuǎn)陰患者中表達(dá)高于轉(zhuǎn)陰患者，是轉(zhuǎn)陰的危險(xiǎn)因素，因此對(duì)組織中miR-135a-5p表達(dá)水平較高患者，應(yīng)加強(qiáng)隨訪和管理，警惕其發(fā)生HR-HPV持續(xù)感染的風(fēng)險(xiǎn)。陳丹霞等[17]采用二代測(cè)序方法篩選出微小RNA進(jìn)行穩(wěn)定性分析，發(fā)現(xiàn)HPV16和(或)HPV18感染患者miR-135a-5p呈高表達(dá)。miR-135a-5p高表達(dá)能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、糖代謝等途徑，阻礙腫瘤細(xì)胞侵襲抑制因子合成，為HR-HPV的增殖及病情進(jìn)展創(chuàng)造有利微環(huán)境，從而影響HR-HPV感染的臨床轉(zhuǎn)歸[18]。同時(shí)，miR-135a-5p還能通過(guò)作用于張力蛋白同源物、Akt/mTOR信號(hào)通路，介導(dǎo)HR-HPV持續(xù)感染[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p高水平者持續(xù)感染風(fēng)險(xiǎn)是低水平者的3.712倍，表明miR-135a-5p高表達(dá)會(huì)增加術(shù)后HR-HPV持續(xù)感染風(fēng)險(xiǎn)。另外在單一指標(biāo)中，miR-135a-5p預(yù)測(cè)術(shù)后HR-HPV轉(zhuǎn)陰的AUC最大，表明檢測(cè)miR-135a-5p能為臨床早期預(yù)測(cè)患者HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸提供參考。

miR-365是微小RNA家族中一個(gè)重要成員，已被證實(shí)在多種腫瘤組織中存在miR-365表達(dá)的異常。郭穎等[20]通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，miR-365在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌組織中表達(dá)隨著病理分級(jí)增加而逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-365表達(dá)降低與CIN患者術(shù)后HR-HPV感染未轉(zhuǎn)陰有關(guān)，可作為早期預(yù)測(cè)HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸的分子標(biāo)志物。結(jié)合既往報(bào)道[21]，miR-365是通過(guò)調(diào)節(jié)G1/S-特異性周期蛋白-D1，影響細(xì)胞增殖分化周期機(jī)制發(fā)揮作用的。但COON等[22]報(bào)道，miR-365在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)升高，并能介導(dǎo)癌細(xì)胞增殖、侵襲，提示miR-365起到消極因子作用，與本研究獲得的miR-365是保護(hù)因素結(jié)果不同，這可能是miR-365在不同疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的機(jī)制不同導(dǎo)致的，提示miR-365調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，不同疾病不具有機(jī)制共享作用，所以不同情況應(yīng)分別進(jìn)行針對(duì)性研究。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，miR-145、miR-135a-5p、miR-365在預(yù)測(cè)CIN術(shù)后HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸中呈現(xiàn)出不同的應(yīng)用價(jià)值，其中單獨(dú)應(yīng)用時(shí)miR-135a-5p預(yù)測(cè)價(jià)值最高，其次是miR-365、miR-145，但均低于miR-145、miR-135a-5p聯(lián)合miR-365預(yù)測(cè)HR-HPV轉(zhuǎn)陰的AUC，故三者聯(lián)合檢測(cè)能提高預(yù)測(cè)價(jià)值，從而為臨床提供更可靠的參考數(shù)據(jù)，這可能是三者均與HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸有關(guān)，而聯(lián)合檢測(cè)囊括了HR-HPV感染更多的機(jī)制，所以聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)價(jià)值更高。值得注意的是，受研究時(shí)間、病例、經(jīng)費(fèi)等影響，本研究將隨訪時(shí)間定為12個(gè)月，而在術(shù)后更長(zhǎng)久的時(shí)間中，各指標(biāo)與HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸定量關(guān)系是否還符合這一規(guī)律仍不明確，這是本研究局限所在，有待后續(xù)延長(zhǎng)隨訪時(shí)間來(lái)深入探討。

綜上所述，miR-145、miR-365表達(dá)降低和miR-135a-5p表達(dá)升高，與CIN術(shù)后HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸情況密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)可作為早期預(yù)測(cè)HR-HPV感染轉(zhuǎn)歸的有效方案，可為臨床提供重要參考。