米熱尼沙·阿不都熱西提，帕提古麗·亞森，古再麗努爾·艾麥提

(新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)結(jié)核病防治所暨肺科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，新疆維吾爾自治區(qū) 喀什地區(qū) 844000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是世界上最常見的癌癥類型，約占肺癌患者的80%～85%[1-2]。疾病早期診斷對(duì)于患者手術(shù)后的良好預(yù)后至關(guān)重要，因此發(fā)現(xiàn)和識(shí)別新的生物標(biāo)志物用于NSCLC的預(yù)測(cè)、診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)和靶向治療，從而獲得更有效的治療、降低病死率，是非常必要及迫切的。

微小RNA(miRNAs)通過直接結(jié)合靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)參與各種生理或病理過程的調(diào)控，導(dǎo)致信使RNA(mRNA)降解或翻譯抑制[3]。與蛋白編碼基因類似，miRNAs也可以作為癌基因或抑癌基因，成為潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。miR-146a作為一種與常見癌癥有關(guān)的miRNA，與多種癌癥進(jìn)展有正相關(guān)或負(fù)相關(guān)性[4]，然而其在NSCLC研究中卻存在一定的爭(zhēng)議。樣本容量、癌癥亞型和分期、患者背景、檢測(cè)方法，甚至miRNA-146b代償，都可能是導(dǎo)致研究結(jié)果混亂的原因，因此有待進(jìn)一步豐富臨床循證數(shù)據(jù)。一項(xiàng)女性肺癌隊(duì)列研究[5]發(fā)現(xiàn)miR-146a rs2910164位點(diǎn)CG或GG基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)較低有關(guān)，這可能是由于突變型基因與其靶基因腫瘤壞死因子-α受體相關(guān)因子6(TRAF6)的結(jié)合減少所致。TRAF6是miR-146a的下游效應(yīng)器，在癌癥發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有多效性作用。本研究旨在評(píng)估m(xù)iR-146a/TRAF6通路與NSCLC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的潛在關(guān)系，從而為尋找有效的生物學(xué)靶點(diǎn)提供新的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)結(jié)核病防治所暨肺科醫(yī)院2009—2017年手術(shù)切除的53例非癌肺組織(Non-CLT)和118例NSCLC組織。Non-CLT和NSCLC患者均未接受過放療或化療，且均經(jīng)組織學(xué)確診。NSCLC患者中位年齡67.0歲，男90例，女28例；TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期25例，Ⅲ期68例；腺癌54例，鱗癌64例。Non-CLT患者中位年齡64.0歲，男27例，女26例。Non-CLT和NSCLC患者年齡和性別構(gòu)成基本一致(P>0.05)，具有可比性。與本研究相關(guān)的方案均經(jīng)本院人類實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者術(shù)前均知情同意。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)組織miR-146a表達(dá)

采用RNAiso Plus總RNA提取試劑盒(大連Takara公司)提取石蠟包埋組織中總RNA。用光譜儀檢測(cè)到的A260/A280比例為1.9～2.1，質(zhì)量濃度≥0.1 μg·μL-1。采用Hairpin-it microRNA和U6 snRNA標(biāo)準(zhǔn)化RT-PCR定量試劑盒(上?；蛩帢I(yè)有限公司)將總RNA(1～3 μg)轉(zhuǎn)化為cDNA。每個(gè)樣本均在逆轉(zhuǎn)錄后，在ABI 7500熱循環(huán)儀(美國(guó)Thermo Fisher scientific公司)上進(jìn)行一式3份的定量PCR反應(yīng)。熱循環(huán)條件為：95 ℃ 3 min；40次循環(huán)，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s。所有數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。miR-146a引物：(正向)5′-UGAGAACUGA-AUUCCAUGGGUU-3′，(反向)5′-ACTCTTGAC-TTAAGGTACCCAA-3′；U6引物：(正向)5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′，(反向)5′-AACGCTTC-ACGAATTTGCGT-3′。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織TRAF6蛋白表達(dá)

根據(jù)既往的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)調(diào)整抗體的染色條件。所有石蠟標(biāo)本均切成4 μm連續(xù)(≥3片)切片。切片貼在載玻片上，在恒溫器(60 ℃)中加工60 min。分別用于病理染色、TRAF6抗體免疫組織化學(xué)染色(IHC)和陰性對(duì)照。采用兩步法進(jìn)行IHC染色，石蠟包埋切片用二甲苯脫蠟，用一系列降低乙醇濃度的溶液進(jìn)行再水化。切片置于沸騰檸檬酸緩沖液中(抗原修復(fù))，3%H2O2用于抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。用TRAF6(1∶300稀釋，sc-8409，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)初級(jí)抗體在4 ℃條件下孵育隔夜，次日用兔特異性IHC HRP/DAB試劑盒(ab209101，美國(guó)Abcam公司)在室溫下孵育10 min，蘇木精反染30 s。用光學(xué)顯微鏡獲得圖像。病理學(xué)家對(duì)IHC染色進(jìn)行盲法評(píng)估。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比分別評(píng)為0(0%)、1(1%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)和4(76%～100%)分。根據(jù)染色強(qiáng)度分別評(píng)為0(陰性)、1(輕度表達(dá))、2(中度表達(dá))和3(強(qiáng)表達(dá))分。每個(gè)病例的最終病理評(píng)分用百分比和強(qiáng)度評(píng)分相乘得出。積分大于2的染色被認(rèn)為陽性(圖1)。

圖1 IHC法檢測(cè)Non-CLT、肺腺癌、肺鱗癌組織中TRAF6蛋白表達(dá)(×200)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組織miR-146a相對(duì)表達(dá)量不符合正態(tài)分布，用中位值(四分位距)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU分析。采用卡方檢驗(yàn)分析NSCLC與Non-CLT蛋白表達(dá)的差異，并采用卡方檢驗(yàn)分析miR-146a、TRAF6蛋白與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。對(duì)指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行Spearman秩相關(guān)性分析。生存率采用Kaplan-Meier分析，生存率曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)估獨(dú)立的預(yù)后因素。以P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a和TRAF6蛋白表達(dá)差異

與Non-CLT組織相比，NSCLC組織中miR-146a 相對(duì)表達(dá)量降低[0.550(0.485，0.650)比0.994(0.830，1.121)，Z=-7.847，P<0.001]。TRAF6在肺腺癌和肺鱗癌組織中的陽性表達(dá)率分別為57.41%(31/54)和59.38%(38/64)，Non-CLT組織中TRAF6蛋白陽性表達(dá)率為26.42%(14/53)，TRAF6在肺腺癌和肺鱗癌組織中的陽性表達(dá)率高于Non-CLT組織(χ2=15.091，P<0.001)。見圖2A。

2.2 miR-146a和TRAF6蛋白表達(dá)的相關(guān)性

在NSCLC組織中，TRAF6蛋白陰性表達(dá)組織中miR-146a相對(duì)表達(dá)量高于TRAF6蛋白陽性表達(dá)組織[0.585(0.550，0.765)比0.515(0.435，0.580)，Z=-4.801，P<0.001，圖2B]。NSCLC組織中miR-146a相對(duì)表達(dá)量與TRAF6蛋白IHC評(píng)分呈負(fù)相關(guān)性(rs=-0.515，P<0.001，圖2C)。

A：肺腺癌和肺鱗癌與Non-CLT組織中miR-146a表達(dá)差異；B：TRAF6蛋白陽性表達(dá)和陰性表達(dá)組織中miR-146a表達(dá)差異；C：組織miR-146a和TRAF6蛋白表達(dá)的關(guān)系。

2.3 miR-146a和TRAF6蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)NSCLC組織miR-146a相對(duì)表達(dá)量的中位值，miR-146a≤0.550為低表達(dá)、>0.550為高表達(dá)。TNM分期Ⅲ期患者miR-146a低表達(dá)率高于TNM分期Ⅰ—Ⅱ期患者，而TRAF6陽性表達(dá)率顯著高于TNM分期Ⅰ—Ⅱ期患者(P<0.001)。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者miR-146a低表達(dá)率及TRAF6陽性表達(dá)率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.001)。與TNM分期Ⅰ—Ⅱ期或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者相比，TNM分期Ⅲ期及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-146a低表達(dá)/TRAF6陽性表達(dá)率較高(P=0.006，P<0.001)?；颊適iR-146a低表達(dá)、TRAF6陽性表達(dá)單獨(dú)或聯(lián)合表達(dá)模式的生存率低于其他表達(dá)模式的患者(P<0.05)。見表1。

表1 miR-146a和TRAF6蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的相關(guān)性分析 n(%)

2.4 miR-146a、TRAF6表達(dá)狀態(tài)對(duì)患者預(yù)后的影響

miR-146a低表達(dá)(P=0.012)或TRAF6陽性表達(dá)(P=0.017)的肺腺癌患者的總生存率較低(圖3A)；TRAF6陽性表達(dá)與肺鱗癌患者總生存預(yù)后不良有關(guān)(P=0.007)(圖3B)。在聯(lián)合情況下，miR-146a低表達(dá)/TRAF6陽性表達(dá)的肺腺癌和肺鱗癌患者總生存率低于其他患者(P=0.003，圖3A；P=0.012，圖3B)。

A：肺腺癌患者;B：肺鱗癌患者。

2.5 影響NSCLC患者總生存預(yù)后的臨床因素分析

單因素/多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，只有TNM分期是肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05，表2)；組織TRAF6陽性表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肺鱗癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05，表3)。

表2 肺腺癌患者總生存預(yù)后的單因素/多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析 n=54

表3 肺鱗癌患者總生存預(yù)后的單因素/多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析 n=64

3 討論

肺癌是最具殺傷力和侵襲性的惡性腫瘤之一[6]。隨著基因組和基礎(chǔ)研究的發(fā)展，越來越多的細(xì)胞分子生物標(biāo)記物被認(rèn)為是肺癌的特異性診斷和靶向治療分子。此外，肺癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟的過程，但癌變機(jī)制尚不完全清楚。因此，眾多研究都在努力尋找可靠的分子標(biāo)志物。本研究旨在探討miR-146a/TRAF6通路在NSCLC診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)中的潛在作用。

大多與miR-146a相關(guān)的研究[7]表明，miR-146a在惡性腫瘤中具有抑癌因子的活性。例如在NSCLC細(xì)胞系和組織樣本中，miR-146a的表達(dá)被強(qiáng)烈下調(diào)，并且在肺癌細(xì)胞系中顯示出抗增殖和抗凋亡的特性[8-10]，這與本研究結(jié)果基本一致。TRAF6是核因子κB(NF-κB)的關(guān)鍵激活因子。STARCZYNOWSKI等[11]已經(jīng)確定TRAF6是肺癌細(xì)胞11p13號(hào)染色體上擴(kuò)增的候選癌基因之一，其過表達(dá)可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的形成，而敲除TRAF6表達(dá)則可抑制下游NF-κB信號(hào)的激活，進(jìn)而影響人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤的形成。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)利用干擾小RNA抑制RAS介導(dǎo)的腫瘤形成過程中，TRAF6的缺失可能對(duì)人類肺癌有重要意義[12]。Kras是肺癌中最常見的突變癌基因之一，然而，抑制RAS的有效療法并不存在。因此，將TRAF6作為RAS腫瘤發(fā)生的下游效應(yīng)因子，可能為治療干預(yù)提供一個(gè)替代靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中miR-146a表達(dá)量普遍降低，且多數(shù)組織TRAF6呈陽性表達(dá)。miR-146a、TRAF6單獨(dú)或聯(lián)合表達(dá)異常的NSCLC患者總生存時(shí)間明顯較短。而TRAF6蛋白陽性表達(dá)可能是肺鱗癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因子。本研究結(jié)果表明，NSCLC中miR-146a表達(dá)降低，同時(shí)TRAF6表達(dá)顯著增加，這與既往研究[8-12]結(jié)果一致。此外，miR-146a、TRAF6在臨床晚期患者中的表達(dá)變化更明顯，為其在NSCLC腫瘤發(fā)生進(jìn)展中的作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)，而且兩者在癌變過程中具有明顯的靶向調(diào)控作用。對(duì)于NSCLC患者，TRAF6蛋白表達(dá)與miR-146a相對(duì)表達(dá)量呈一定的負(fù)相關(guān)性。

NSCLC患者中TRAF6蛋白表達(dá)陽性和陰性組織，其miR-146a相對(duì)表達(dá)量均低于Non-CLT組織，說明TRAF6不是miR-146a的唯一調(diào)控因子，miR-146a還可能通過影響其他癌基因或抑癌基因的表達(dá)影響NSCLC進(jìn)程。例如HUANG等[13]通過靶向掃描、熒光素酶檢測(cè)、癌癥基因組圖譜等研究方法證明，miR-146a-5p能夠直接靶向于腫瘤膠原酶刺激因子(TCSF)，進(jìn)而觸發(fā)成纖維細(xì)胞內(nèi)許多基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞的存活和凋亡機(jī)制。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)天然免疫的重要細(xì)胞因子，MIF通過激活NF-κB炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)[14]。在NSCLC中上調(diào)的MIF基因也被證實(shí)是miR-146a的反向靶點(diǎn)。此外miR-146a也通過特異性下調(diào)CCND1/2的表達(dá)，減緩細(xì)胞周期進(jìn)程，并通過抑制胰島素受體底物2(IRS2)的轉(zhuǎn)錄和翻譯而阻礙上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，這些都是miR-146a發(fā)揮抑癌因子活性的重要機(jī)制[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a和TRAF6在NSCLC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性，兩者聯(lián)合表達(dá)異常的患者總生存率低于其他表達(dá)模式的患者。本研究結(jié)果提示miR-146a/TRAF6通路在NSCLC發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有可能成為NSCLC診斷和治療的重要分子標(biāo)志物，但是miR-146a的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，miR-146a、TRAF6之間是直接還是間接的靶向關(guān)系機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NSCLC組織中miR-146a表達(dá)降低，可能具有一定的抑癌因子活性；同時(shí)TRAF6蛋白表達(dá)顯著升高。miR-146a/TRAF6通路可能在NSCLC的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，有望成為預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物和將來靶向制劑研發(fā)的有效靶點(diǎn)。