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        谷氨酸通過(guò)調(diào)控脊髓背角GABABR2參與慢性胰腺炎痛的機(jī)制研究

        2022-08-29 03:22:12徐卉紅邱海波王莉琴朱成成陸智杰
        關(guān)鍵詞:背角孵育脊髓

        徐卉紅,邱海波,王莉琴,朱成成,陸智杰

        (1.海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科,上海 200438; 2.中國(guó)人民解放軍海軍第九0五醫(yī)院麻醉科,上海 200052)

        反復(fù)發(fā)作的腹痛是慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)患者主要的臨床癥狀,疼痛管理成為治療CP的核心[1]。傳統(tǒng)理論認(rèn)為,胰腺自身病變是疼痛的主要來(lái)源,但基于這一理論建立的內(nèi)鏡或手術(shù)治療對(duì)CP痛的緩解不盡人意[2]。有研究[3-5]認(rèn)為,CP患者的腦島、繼發(fā)性軀體感覺皮層及扣帶回皮層發(fā)生重構(gòu),下行抑制疼痛調(diào)節(jié)受損。定量感覺測(cè)試結(jié)果顯示約50%的CP痛患者存在中樞敏化[6],手術(shù)或去內(nèi)臟神經(jīng)治療對(duì)緩解疼痛十分有限[7]。提示中樞敏化可能是難治性CP痛發(fā)生的重要機(jī)制。

        脊髓背角是外周傷害信息向中樞傳遞的第一站。GABA在脊髓背角中廣泛表達(dá),作為GABA發(fā)揮作用的受體之一GABABR(GABABreceptor)也在脊髓表達(dá),并且與疼痛的調(diào)控密切相關(guān)。當(dāng)脊髓背角GABABR激活后,與外周傷害感受密切相關(guān)的Aδ纖維和C纖維的活性降低;神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)、P物質(zhì)、鈣基因相關(guān)肽等傷害性物質(zhì)的釋放減少[8-9]。有研究[10]表明,正常大鼠鞘內(nèi)給予GABABR激動(dòng)劑后,大鼠傷害閾值增加;而給予GABABR拮抗劑后,大鼠會(huì)出現(xiàn)痛覺異常和痛覺過(guò)敏??梢?,脊髓背角GABABR表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致GABA的抑制效應(yīng)減弱是疼痛傳導(dǎo)的重要機(jī)制。

        GABABR是由GABABR1和GABABR2兩個(gè)亞單位組成的異二聚G蛋白偶聯(lián)受體[11]。鏈唑霉素誘導(dǎo)的糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠脊髓背角處GABABR1表達(dá)下調(diào)[10],但未研究GABABR1下調(diào)的機(jī)制。此外,有研究[12]顯示,體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞膜上GABABR的下調(diào),主要是由Glu介導(dǎo)非其自身配體GABA所致。但是,Glu調(diào)控脊髓背角GABABR2參與CP痛并不明確,本研究將著重探討其機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑

        DBTC、1% Triton-X100、DAPI、抗IB4抗體(美國(guó)Sigma公司);RIPA細(xì)胞裂解液(美國(guó)Thermo公司);正常山羊血清封閉液(博士德生物工程有限公司);抗GABABR2抗體、抗MAP2抗體(美國(guó)Abcam公司);抗GAPDH抗體(天津三箭公司);胰酶(上?;瘜W(xué)試劑公司);熒光二抗、多聚-L-鳥氨酸、0.05%EDTA、Neurobasal培養(yǎng)液、DMEM高糖培養(yǎng)液、神經(jīng)生長(zhǎng)因子B27、L-谷氨酰胺、青鏈霉素雙抗、F12、FBS胎牛血清(美國(guó)Invitrogen公司);Sulfo-NHS-LC-Biotin(磺酸基-NHS-生物素)、High Capacity Neutr Agarose Resin(高結(jié)合能力中性親和素瓊脂糖樹脂)(美國(guó)Thermo Scientific Pierce公司)。

        1.2 主要儀器

        常規(guī)手術(shù)精細(xì)解剖器械一套(美國(guó)WPI公司);垂直潔凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);體視解剖顯微鏡、熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司);Von Frey電子測(cè)痛儀(美國(guó)IITC公司);CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);LHR體外灌流泵(上海醫(yī)療器械廠);Western-blot電泳系統(tǒng)、Western Blot轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);熱電臺(tái)式多用冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司);Image Quant LAS4000化學(xué)發(fā)光成像儀(通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與CP模型的構(gòu)建

        200 g左右的Wistar雄性大鼠共42只,購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用處理經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)在海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

        CP模型的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[13]。腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(50 mg·kg-1),大鼠麻醉后經(jīng)尾靜脈注射DBTC溶液(8 mg·kg-1DBTC,溶劑為2:3的甘油和無(wú)水酒精)。建模成功的大鼠為CP組(n=30),其中,6只建模后用于行為學(xué)檢測(cè),并于術(shù)后21 d取脊髓用于免疫熒光實(shí)驗(yàn);24只在DBTC注射后3、7、14、21 d用于Western-blot實(shí)驗(yàn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。對(duì)照組12只僅注射等劑量溶劑,其中6只用于行為學(xué)檢測(cè),完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后取脊髓用于免疫熒光實(shí)驗(yàn);6只用于Western-blot實(shí)驗(yàn)取材。

        1.4 腹部機(jī)械痛的測(cè)定

        腹部機(jī)械痛的測(cè)定參考Randall-Sellito法[14]。測(cè)試前3 d將大鼠放在有機(jī)玻璃箱(22 cm×22 cm×30 cm)中適應(yīng)30 min·d-1。測(cè)試當(dāng)天大鼠適應(yīng)同前,用Von Frey電子測(cè)痛儀探頭逐漸加壓大鼠左上腹部。當(dāng)大鼠抬腹、走開或腹肌收縮時(shí)停止加壓,記錄此時(shí)數(shù)值。每只大鼠測(cè)3次,每次間隔10 min。腹部機(jī)械痛閾值為3次平均值。

        1.5 免疫熒光組織化學(xué)法

        脊髓組織切成20 μm厚度,0.01 mol·L-1PBS漂洗15 min×3次后用(1%NGS+1% Triton-X100+0.01 mol·L-1PBS)室溫封閉2 h。4 ℃孵育一抗(抗GABABR2抗體,1:1000;抗IB4抗體,1:1000)24 h。0.01 mol·L-1PBS漂洗15 min×3次。室溫避光孵育1:2000的二抗(羊抗兔:Alexa Fluor 488,羊抗小鼠:Alexa Fluor 588)2 h。

        1.6 脊髓背角神經(jīng)元原代培養(yǎng)

        脊髓背角神經(jīng)元的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[15]。多聚-L-鳥氨酸包被6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。取胎齡13 d大鼠脊髓背角,并剪成1 mm3大小。用2 mL含0.05%EDTA的胰酶37 ℃消化15 min后用含78%DMEM、10%FBS、10%F12、1%青鏈霉素雙抗、1%L-谷氨酰胺的完全培養(yǎng)液終止消化。重懸后0.07 nm細(xì)胞濾膜過(guò)濾,1000 次·min-1離心5 min去上清。加入培養(yǎng)液重懸沉淀后種于細(xì)胞培養(yǎng)板。接種密度為5×105孔-1,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。每 3~4 d半量換細(xì)胞培養(yǎng)液。

        1.7 細(xì)胞膜蛋白的提取

        原代培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元分別用20、40 μmol·L-1的Glu孵育30 min后,提取細(xì)胞膜蛋白。脊髓背角神經(jīng)元加入含0.5 mg的Sulfo-NHS-LC-biotin溶液2 mL(pH=8.0),4 ℃30 min。用30 μL 1 mol·L-1glycine(pH=7.4)中止生物素反應(yīng)。RIPA裂解液裂解45 min,13 000 次·min-14 ℃ 離心15 min,取上清。取一部分用于直接加入SDS上樣緩沖液,100 ℃×5 min,用于測(cè)定總蛋白濃度;剩余部分用與連接了親和素的瓊脂糖樹脂磁珠(Neutr Avidin beads)處理。4 ℃冰箱過(guò)夜后10 000 g 離心3 min。將離心沉淀物Neutr Avidin beads用4 ℃ PBS溶液洗滌5次,10 000 g離心 1 min,沉淀物加入SDS上樣緩沖液,100 ℃×5 min,即得細(xì)胞膜蛋白。

        1.8 Western-blot實(shí)驗(yàn)

        組織蛋白提取按前法所述[16]。蛋白經(jīng)5%濃縮膠和10%分離膠后,轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶+5%BSA的TBST溶液室溫封閉2 h。4 ℃孵育一抗(抗GABABR2抗體1:1000;抗GAPDH抗體1:2000),24 h。室溫孵育二抗(羊抗兔,1:5000)2 h。ECL顯影。Image J分析定量。

        1.9 細(xì)胞免疫熒光法

        4%PFA固定培養(yǎng)7 d的脊髓背角神經(jīng)元。0.01 mol·L-1PBS漂洗3次,用10%NGS+1%Triton-X100的0.01 mol·L-1PBS溶液室溫封閉2 h。4 ℃孵育一抗GABABR2抗體(1:500)及抗MAP2抗體(1:500),24 h。室溫避光孵育二抗1:2000(羊抗兔:Alexa Fluor 488,羊抗鼠:Alexa Fluor 588)2 h。

        1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。大鼠腹部機(jī)械痛閾值采用重復(fù)測(cè)量方差分析。Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照組為數(shù)值1,其他組測(cè)定數(shù)值為與對(duì)照組的相對(duì)值。多組間的均數(shù)分析采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 大鼠CP模型及腹部機(jī)械痛的測(cè)定

        CP模型大鼠胰腺HE染色可見散在的胰腺細(xì)胞腫脹壞死,廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及大量的纖維結(jié)締組織增生(圖1)。腹部機(jī)械痛測(cè)定結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,在DBTC單次尾靜脈注射后,大鼠對(duì)腹部機(jī)械刺激敏感性明顯增強(qiáng)(圖2),說(shuō)明CP大鼠痛閾明顯降低。

        A:對(duì)照組;B:DBTC注射21 d。

        1—4:依次為DBTC注射3、7、14、21 d。

        2.2 大鼠脊髓背角GABABR2的分布和表達(dá)

        免疫熒光法檢測(cè)顯示GABABR2主要表達(dá)在脊髓背角Ⅰ、Ⅱ?qū)?。同時(shí),GABABR2與傷害感受神經(jīng)元標(biāo)記物IB4共染結(jié)果顯示,GABABR2在傷害感受神經(jīng)元中廣泛表達(dá)(圖3)。這提示脊髓背角GABABR2可能參與疼痛的調(diào)控。

        2.3 CP大鼠脊髓背角GABABR2表達(dá)的變化

        與對(duì)照組比較,CP組大鼠在DBTC注射后3、7、14、21 d時(shí)GABABR2的相對(duì)表達(dá)分別為(105.70±17.78)%(P=1.000)、(53.82±12.40)%(P<0.001)、(53.01±13.01)%(P<0.001)、(48.04±9.31)%(P<0.001),見圖4A。結(jié)果顯示CP大鼠脊髓背角GABABR2的表達(dá)明顯減少。同時(shí),免疫熒光組織化學(xué)法結(jié)果也顯示DBTC注射21 d大鼠脊髓背角處GABABR2的表達(dá)顯著下降(圖4B)。

        1:對(duì)照組;2—5:依次為DBTC注射3、7、14、21 d。*P<0.001與對(duì)照組比較。

        2.4 Glu對(duì)脊髓背角神經(jīng)元GABABR2表達(dá)的影響

        脊髓背角神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后,進(jìn)行GABABR2和神經(jīng)元標(biāo)記物MAP2的共染。結(jié)果顯示,GABABR2在體外培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元上表達(dá)廣泛(圖5A)。用20和40 μmol·L-1的Glu刺激體外培養(yǎng)7 d的脊髓背角神經(jīng)元30 min。Western-blot結(jié)果顯示,GABABR2的相對(duì)表達(dá)分別為(55.01±7.51)%(P<0.001)和(46.28±7.70)%(P<0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)。結(jié)果提示,Glu可能通過(guò)調(diào)控GABABR2參與慢性胰腺炎痛。

        A:藍(lán)色為細(xì)胞核標(biāo)記物DAPI,綠色為GABABR2,紅色為神經(jīng)元標(biāo)記物MAP2,黃色為共標(biāo);B:1為對(duì)照組;2為Glu 20 μmol·L-1;3為Glu 40 μmol·L-1。*P<0.001,n=6。

        3 討論

        CP痛的發(fā)生機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果表明,CP大鼠腹部機(jī)械痛閾值明顯下降(P<0.001);DBTC注射7 d后大鼠脊髓背角GABABR2的表達(dá)顯著下降(P<0.001);Glu刺激脊髓背角神經(jīng)元后GABABR2的表達(dá)下調(diào)(P<0.001)。LüTT等[13,17]的研究表明,單次尾靜脈注射DBTC后24 h內(nèi)誘發(fā)急性水腫性胰腺炎和膽胰管擴(kuò)張。注射DBTC 7 d后胰腺呈現(xiàn)慢性胰腺炎的病理特征(胰腺組織內(nèi)可見廣泛的單核細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死纖維化形成),并持續(xù)2個(gè)月。該模型不但操作簡(jiǎn)單,且能很好地模擬人慢性胰腺炎的發(fā)病過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)利用該方法建立CP模型大鼠的胰腺形態(tài)學(xué)結(jié)果與此相似。

        本研究顯示GABABR2主要表達(dá)在與疼痛密切相關(guān)的脊髓背角淺層,這一結(jié)果與前期的研究[18-19]一致。同時(shí)筆者檢測(cè)到CP模型大鼠脊髓背角中GABABR2的表達(dá)顯著下降(P<0.001)。本實(shí)驗(yàn)未具體研究GABABR2在哪一類神經(jīng)元上減少,主要是因?yàn)镚ABABR2在脊髓背角處分布廣泛,其發(fā)揮功能可以通過(guò)突觸前、突觸后和突觸外機(jī)制。脊髓背角處給予GABABR2激動(dòng)劑可以產(chǎn)生突觸前和突觸后抑制,阻斷初級(jí)感覺神經(jīng)末梢釋放Glu、P物質(zhì)及鈣基因相關(guān)肽[9,20]。鞘內(nèi)給予GABABR2拮抗劑phaclofen誘導(dǎo)觸摸痛和溫覺痛[21]。脊髓處而非延髓頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)給予選擇性的GABABR2拮抗劑CGP 35348可以阻斷baclofen的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[22],這進(jìn)一步提示脊髓處GABABR2的功能與疼痛的發(fā)生密切相關(guān)。因此,本研究結(jié)果提示脊髓背角處GABABR2下調(diào)是導(dǎo)致CP痛的一個(gè)重要機(jī)制。

        調(diào)控細(xì)胞膜上受體表達(dá)的機(jī)制包括基轉(zhuǎn)錄、翻譯和受體磷酸化等修飾、受體的降解、重新分布及與配體的結(jié)合能力等。有研究[12,23]顯示,中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABABR主要存在于興奮性神經(jīng)元上,與谷氨酸能神經(jīng)元密切相關(guān)。海馬和大腦皮層神經(jīng)元GABABR2的表達(dá)并不受其自身配體GABA的影響,而是由Glu通過(guò)調(diào)控GABABR2的內(nèi)吞,導(dǎo)致細(xì)胞膜GABABR的表達(dá)減少。本研究結(jié)果顯示,20和40 μmol·L-1Glu刺激體外培養(yǎng)7 d的脊髓背角神經(jīng)元30 min后,細(xì)胞膜上GABABR2的表達(dá)較未處理組顯著下降(P<0.001),與以往的研究[12,23]結(jié)果一致。本研究未檢測(cè)CP模型大鼠脊髓背角Glu水平,但已有文獻(xiàn)[7,24]證實(shí),Glu通過(guò)激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)受體參與CP痛患者中樞敏化過(guò)程,CP痛患者給予NMDA受體拮抗劑S-氯胺酮后,疼痛顯著緩解。CP痛患者扣帶回皮層Glu的水平增加與疼痛密切相關(guān)[25]。本研究為Glu在CP痛的發(fā)生中提出了另一機(jī)制。

        總之,Glu通過(guò)調(diào)控脊髓背角GABABR2的表達(dá)參與慢性胰腺炎痛的發(fā)生。這一結(jié)果為緩解慢性胰腺炎痛提供了新的中樞敏化機(jī)制。

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