張 森，饒思靜，洪芬芳，楊樹龍,c,d

(南昌大學(xué)a.醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，南昌 330006； b.醫(yī)學(xué)部實驗教學(xué)中心，南昌 330006； c.撫州醫(yī)學(xué)院生理教研室,江西 撫州 344099; d.撫州醫(yī)學(xué)院慢性病研究重點(diǎn)實驗室，江西 撫州 344099)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是由多種致病因素引起的慢性炎癥性疾病，是造成心血管疾病發(fā)病和死亡的主要原因之一[1]。AS涉及脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和泡沫細(xì)胞形成等一系列復(fù)雜的病理過程[2-3]。流行病學(xué)研究[4]表明，2016年中國心血管性疾病死亡人數(shù)為397.5萬人，其中約240萬人死于動脈粥樣硬化性心血管疾病，占心血管性疾病死亡人數(shù)的61%，與1990年100萬死亡人數(shù)相比顯示出快速而顯著的增加。生活方式干預(yù)和降脂藥物的聯(lián)合應(yīng)用對AS具有顯著的治療效果，但AS發(fā)病率和病死率仍然持續(xù)上升。

決明子，又稱草決明，為豆科植物決明(CassiaobtusifoliaL.)或小決明(CassiatoraL.)的干燥成熟種子，味苦、甘、咸而性微寒，歸肝、大腸經(jīng)，《本草綱目》和《本草正義》中分別記載決明子“除肝膽風(fēng)熱，淫夫白膜，青盲”“決明子名目，乃滋益肝腎”[5]。藥理學(xué)研究[6-8]表明決明子具有降脂、降壓、降血糖、抗炎、抗氧化和抑菌等多種藥理作用。中醫(yī)臨床長期使用決明子治療糖尿病、高血壓、高脂血癥和急性肝損傷[9-10]。但決明子與其他傳統(tǒng)中藥一樣，仍然存在著成分復(fù)雜、機(jī)制不清等缺點(diǎn)，對其作用機(jī)制尤其是分子水平的作用機(jī)制至今研究甚少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可獲取并利用使用數(shù)目龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物信息，有助于推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，首次對決明子活性成分、作用靶點(diǎn)及疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行多層次的整合，將初步證明決明子活性成分與AS靶點(diǎn)之間的相互作用以預(yù)測決明子防治AS的分子機(jī)制，為AS的預(yù)防、治療、新藥研究和臨床用藥提供更多理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 決明子活性成分及靶點(diǎn)挖掘

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索決明子活性成分，以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的2個ADME屬性值為檢索條件進(jìn)行篩選。將PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得的化合物SMILES和活性成分2D結(jié)構(gòu)式分別上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmapper/)獲得決明子活性成分靶點(diǎn)蛋白。篩選結(jié)束后，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息。

1.2 AS相關(guān)靶點(diǎn)挖掘

將“atherosclerosis”作為檢索詞，使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://bidd.group/index.html)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(http://www.drugbank.ca)挖掘AS相關(guān)靶點(diǎn)。合并4個數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，得到疾病靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用R語言編程獲取決明子和AS交集靶點(diǎn)，并繪制Venny圖。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI)分析。在String數(shù)據(jù)庫中，生物種類設(shè)置為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“Highest confidence(>0.9)”，刪除游離靶點(diǎn)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

將獲得的String數(shù)據(jù)庫TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，利用Network Analyzer工具計算度值、介度中心度和接近中心度等重要參數(shù)，篩選出核心靶點(diǎn)。進(jìn)一步通過MCODE插件進(jìn)行Cluster分析。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對決明子和AS間的99個交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO(gene ontology)功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。分析結(jié)果按Pvalue進(jìn)行排序，各選取前10條分析結(jié)果，利用R語言編程使結(jié)果可視化。

1.6 決明子活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將獲得的決明子活性成分、交集靶點(diǎn)和前20條KEGG通路數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建決明子活性成分-疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)度值設(shè)置Style，區(qū)分活性成分、靶點(diǎn)和通路的重要性。隨后，對決明子14個活性成分分別構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 決明子活性成分及靶點(diǎn)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共收集到14個決明子有效活性成分，主要為蒽醌類和萘并吡酮類(表1)。將預(yù)測到的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)去重后，共得到?jīng)Q明子活性成分作用靶點(diǎn)542個。

表1 決明子有效活性成分

表1(續(xù))

2.2 疾病靶點(diǎn)獲取結(jié)果

合并4個疾病數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果后，共得到AS相關(guān)靶點(diǎn)574個。經(jīng)過R語言編程取交集，得到?jīng)Q明子活性成分與AS共同靶點(diǎn)99個(圖1A)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

通過String平臺計算交集靶點(diǎn)間的互作關(guān)系，下載其數(shù)據(jù)后Cytoscape 3.7.2軟件可視化PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1B)。經(jīng)Cytoscape 3.7.2軟件的拓?fù)浞治鲇嬎愫蟮贸?，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)由84個節(jié)點(diǎn)和239條邊組成，節(jié)點(diǎn)度的均值為8，介度中心度的均值為0.032，接近中心度的均值為0.351，度越大則表示該節(jié)點(diǎn)越重要，核心靶點(diǎn)包括SRC、JUN、MAPK8、MAPK14、CTNNB1和HSP90AA1等(表2)?；贛CODE算法，整個PPI網(wǎng)絡(luò)可分類為5個不同的Cluster(圖1C—G)。

A：交集靶點(diǎn)Venn圖；B：PPI網(wǎng)絡(luò)；C：Cluster 1，7個節(jié)點(diǎn)、19條邊(score=6.333)；D:Cluster 2，10個節(jié)點(diǎn)、20條邊(score=4.444)；E：Cluster 3，5個節(jié)點(diǎn)、8條邊(score=4.000)；F：Cluster 4，8個節(jié)點(diǎn)、13條邊(score=3.714)；G：Cluster 5，10個節(jié)點(diǎn)、13條邊(score=2.889)。

表2 度值前20位靶點(diǎn)

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

將決明子和AS間99個共同靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫行GO和KEGG富集分析，并利用R語言編程使結(jié)果可視化。結(jié)果顯示，GO術(shù)語條目共481個，其中生物過程(biological process,BP)共340個，細(xì)胞成分(cell components,CC)共43個，分子功能(molecular function,MF)共98個，KEGG結(jié)果共顯示104條通路。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，BP主要集中于轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板化(positive regulation of transcription,DNA-templated)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)和炎癥反應(yīng)(inflammatory response) 等方面(圖2A)；CC主要集中于細(xì)胞外間隙(extracellular space)、胞外區(qū)(extracellular region)、蛋白質(zhì)復(fù)合體(protein complex)等部位(圖2B)；MF主要集中于酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)和蛋白質(zhì)同源二聚活性(protein homodimerization activity)等方面(圖2C)。

KEGG富集分析數(shù)據(jù)表明，血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)等關(guān)鍵通路可能與決明子治療AS相關(guān)(圖2D)。

A:生物過程；B：細(xì)胞成分；C：分子功能；D：KEGG。

2.5 決明子活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

將14個決明子活性成分、99個交集靶點(diǎn)和前20條KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制決明子活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。圖中最外圍三角形代表通路，圓形為有效活性成分，菱形為靶點(diǎn)基因。其中形狀越大、顏色越深、名稱越突出，表明其度值越高，在網(wǎng)絡(luò)圖中也就越重要。隨后對決明子14個活性成分主要作用靶點(diǎn)和通路分別構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)。

圖3 決明子活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

A：aloe-emodin；B：Obtusin；C：9,10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4H-benzo[g]isochrom en-1-one；D：quinizarin；E：rhein；F：toralactone；G：rubrofusarin；H：stigmasterol；I：gluco-obtusifolin；J：rubrofusarin-6-beta-gentiobioside。

K：CLR；L：campest-5-en-3beta-ol；M:aurantio-obtusin；N:obtusin。

由圖4可見，蒽醌類化合物，包括蘆薈大黃素(aloe-emodin,MOL000471)、鈍葉決明素(Obtusin,MOL006475)、大黃酸(rhein,MOL002268)、葡萄糖鈍葉決明素(gluco-obtusin,MOL006481)、橙黃決明素(aurantio-obtusin,MOL006472)主要作用于IL-17、TNF、VEGF、AS流體剪切力和脂質(zhì)代謝靶點(diǎn)和通路；苯并吡喃酮類化合物，包括紅鐮玫素(rubrofusarin,MOL006466)、決明內(nèi)酯(toralactone,MOL002281)、紅鐮玫素-6-O-龍膽二糖苷(rubrofusarin-6-beta-gentiobioside,MOL006465)主要作用于糖尿病性心肌病、AS流體剪切力、VEGF、血小板活化、花生四烯酸代謝等靶點(diǎn)和通路。此外，9,10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4H-benzo[g]isochromen-1-one(MOL006482)可作用于PI3K-Akt等通路，醌茜(quinizarin,MOL006489)可作用于VEGF和IL-17等通路，豆甾醇(stigmasterol,MOL000449)、CLR(MOL000953)和campest-5-en-3beta-ol(MOL005043)可作用于PPAR信號通路。

3 討論

AS是大多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ)，如冠心病、腦梗死、外周血管病等[11]。AS是一種以脂質(zhì)和鈣等物質(zhì)在動脈內(nèi)膜積聚形成粥樣斑塊為特征的進(jìn)行性炎癥性疾病。目前的研究[12]表明，AS主要與脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫功能障礙和泡沫細(xì)胞形成等有關(guān)?，F(xiàn)代藥理研究[8]表明，決明子中含有的蒽醌類和萘并吡酮類等主要成分具有顯著的降脂、抗炎和抗氧化作用。但目前尚缺乏決明子治療AS的相關(guān)實驗研究，故本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對決明子治療AS的潛在作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到OB≥30%和DL≥0.18的決明子有效活性成分14個，主要為蒽醌類和苯并吡喃酮類成分。蒽醌類和苯并吡酮類化合物對高脂高膽固醇飲食所致的AS具有拮抗作用，是決明子降脂、抗炎的主要成分之一[13-14]。

Cytoscape 3.7.2軟件拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，位于前幾位的靶點(diǎn)有JUN、MAPK8、MAPK14、TNF、RHOA、MMP9、IGF1、NOS2等。JUN是激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)家族的主要成員之一，可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、分化和遷移以及介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，常與核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)共同激活[15-16]。絲裂原激活蛋白激酶(recombinant mitogen activated protein kinase,MAPK)家族成員MAPK8又稱C-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)，可通過磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1后上調(diào)一系列下游基因的表達(dá)[17]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎癥因子以及活性氧激活的JNK信號通路在炎癥和氧化應(yīng)激中起著重要的調(diào)控作用[18]。同為MAPK家族成員的MAPK14則被磷酸化為pp38參與炎癥細(xì)胞的信號傳導(dǎo)[19]。小G蛋白Ras超家族RhoGTP亞族的成員RhoA被激活后與Rho激酶結(jié)合并磷酸化下游底物，抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的表達(dá)，從而改善氧化應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙[20]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族的明膠酶B，MMP-9被廣泛激活后導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞大量增殖和遷移，促進(jìn)內(nèi)膜增厚和管壁對損傷的反應(yīng)性重塑[21]。JOHNSON等[22]的研究表明，當(dāng)MMP-9基因敲除時，血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜的遷移和增殖降低，減輕血管狹窄，顯著改善AS病變。胰島素樣生長因子(insulin like growth factor 1,IGF1)幾乎參與了AS病情進(jìn)展的全過程，炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均可以分泌IGF1及其受體，與炎癥細(xì)胞浸潤、血管平滑肌細(xì)胞增殖和新生血管形成等AS病理過程密切相關(guān)[23-24]。NOS2是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的3種亞型之一，又稱為誘導(dǎo)型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，NOS2是AS中炎癥和氧化應(yīng)激的標(biāo)志物[25-26]。通過可視化網(wǎng)絡(luò)圖可見決明子治療AS是通過影響炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能、血管平滑肌細(xì)胞增殖、分化和遷移等多途徑多靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

GO功能富集結(jié)果提示決明子治療AS與調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)，這與PPI得到的結(jié)果相吻合。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示決明子治療AS涉及VEGF、TNF、花生四烯酸代謝等信號通路。此外，活性成分篩選結(jié)果顯示，決明子有效蒽醌類成分主要為蘆薈大黃素、鈍葉決明素、大黃酸、葡萄糖鈍葉決明素和橙黃決明素，這些成分主要作用于TNF、VEGF、IL-17、AS流體剪切力和脂質(zhì)代謝等靶點(diǎn)和通路。苯并吡喃酮類化合物主要包括紅鐮玫素、決明內(nèi)酯、紅鐮玫素-6-O-龍膽二糖苷，且主要作用于糖尿病性心肌病、AS流體剪切力、VEGF、血小板活化、花生四烯酸代謝等靶點(diǎn)和通路。TNF通路可促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，并作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵中介參與AS的發(fā)展，可促進(jìn)大量白細(xì)胞活化、聚集并黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，從而阻塞微血管，同時活化血小板促進(jìn)血栓形成，加重炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致AS的發(fā)生[27-28]。此外，在AS初始階段，TNF-α損傷正常的血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能以及凝血與抗凝系統(tǒng)失衡等機(jī)制，參與AS的發(fā)生發(fā)展[29]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS發(fā)生的主要病理生理機(jī)制之一，VEGF作為介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的關(guān)鍵信號通路，能夠調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、活化，引起血管通透性的改變，因而VEGF信號通路對AS內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)起到至關(guān)重要的作用[30]。此外，VEGF在促進(jìn)血管新生中具有較強(qiáng)的特異性和高效性，是血管新生過程中主要的信號通路[31]。缺氧是促進(jìn)AS血管新生的首要條件，而在缺氧的條件下往往伴隨著斑塊內(nèi)VEGF表達(dá)的增加[32]?；ㄉ南┧?arochidonic acid,ARA)是一種ω-6多不飽和脂肪酸，由磷脂酶A2在細(xì)胞受到刺激時將ARA分解游離并釋放到細(xì)胞液中,隨后在一系列代謝酶的作用下形成大量具有促進(jìn)AS斑塊的形成、發(fā)展及斑塊不穩(wěn)定性生物活性的代謝產(chǎn)物[33-34]。同時，豆甾醇、CLR和campest-5-en-3beta-ol活性成分可作用于PPAR信號通路，并可能干預(yù)AS發(fā)生發(fā)展中的脂質(zhì)代謝紊亂。9,10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4H-benzo[g]isochromen-1-one成分可作用于PI3K-Akt，可能在胰島素的刺激以及細(xì)胞生存當(dāng)中發(fā)揮作用。

綜上所述，決明子主要通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能、修復(fù)氧化與抗氧化失衡狀態(tài)、減輕血小板聚集和改善血管平滑肌細(xì)胞增殖、分化和遷移等影響AS進(jìn)展中的炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、血管新生和斑塊穩(wěn)定性等病理生理過程治療AS。本研究對決明子關(guān)鍵活性成分以及靶標(biāo)進(jìn)行了預(yù)測，表明決明子通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路影響AS發(fā)生和發(fā)展，為進(jìn)一步的基礎(chǔ)與臨床研究提供了生物信息學(xué)數(shù)據(jù)支持。