武藝（Wu Yi），魯翌（Lu Yi），葉絮（Ye Xu），劉爍（Liu Shuo）

（1.國(guó)家血液病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，唐仲英醫(yī)學(xué)研究院，蘇州大學(xué)，蘇州215123；2.武漢塞力斯生物技術(shù)有限公司，武漢430040；3.廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，廣州510260；1. National Clinical Research Center for Hematologic Diseases，Cyrus Tang Medical Institute，Soochow University Suzhou 215123，China.；2.Wuhan Thalys Biotechnology Co.，Ltd.，Wuhan 430040；3.Department of Hematology，Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260）

在基礎(chǔ)與臨床研究中，我們主要依賴于凝血基礎(chǔ)試驗(yàn)（basic tests of coagulation）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）和活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）評(píng)價(jià)凝血功能。凝血酶生成實(shí)驗(yàn)（thrombin generation assay，TGA）的問(wèn)世將凝血功能檢測(cè)提高到新的臺(tái)階。但是，最初TGA的檢測(cè)方法既費(fèi)力又耗時(shí)，需要單獨(dú)采樣，尤其是沒(méi)有考慮凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物對(duì)凝血酶的滅活，因此無(wú)法準(zhǔn)確地反映凝血酶生成的動(dòng)態(tài)變化和整體情況。校準(zhǔn)的自動(dòng)凝血酶生成圖（calibrated automated thrombogram，CAT）系綜合抗凝血酶復(fù)合物的客觀因素，且具備對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)快速且連續(xù)的測(cè)量，大大提高TGA的準(zhǔn)確性、效率和可重復(fù)性。因此，基于CAT的TGA檢測(cè)逐漸成為凝血檢測(cè)的主流方法。與傳統(tǒng)的凝血實(shí)驗(yàn)相比，TGA有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)［1-3］。首先，PT和APTT的測(cè)量依賴于纖維蛋白原的濃度和活性［4］，但是，TGA不受纖維蛋白原的影響，即使在纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)形成后仍然能夠檢測(cè)到凝血酶的生成。其次，在PT和APTT中僅5%的凝血酶發(fā)揮作用形成血凝塊，這意味著95%生成的凝血酶檢測(cè)不到。而且，TGA測(cè)定曲線反映了凝血全過(guò)程的多個(gè)參數(shù)，包括滯后時(shí)間、凝血酶生成速度、凝血酶生成峰值和內(nèi)源性凝血酶生成潛力，其中最重要的參數(shù)是內(nèi)源性凝血酶生成潛力，即生成凝血酶的凈量，但是PT和APTT僅提供凝血完成的終點(diǎn)時(shí)間值。

基于TGA檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，其在臨床中的應(yīng)用日益廣泛。例如，監(jiān)測(cè)服用抗凝劑和抗血小板藥物的患者、評(píng)估接受旁路藥物或替代療法的血友病患者的出血風(fēng)險(xiǎn)、篩查遺傳性或獲得性血栓性和出血性疾病等。與傳統(tǒng)的凝血實(shí)驗(yàn)相比，雖然TGA適合于全面的止血與血栓傾向的評(píng)估，但是為了更可靠地評(píng)價(jià)凝血的特定途徑和階段，以及更精確地評(píng)估整個(gè)凝血過(guò)程，該方法仍然需要進(jìn)一步優(yōu)化，包括其臨床檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1993年Hemker等報(bào)道了TGA的基本原理，他們使用顯色底物甲基丙二酰-甲基苯丙酰-精氨酰-pNA（SQ 68）［5］，建立了連續(xù)凝血酶生成檢測(cè)。2003年該方法升級(jí)為CAT［6］。在過(guò)去的二十年中，在該方法的基礎(chǔ)上，改進(jìn)出三種商業(yè)化的TGA自動(dòng)檢測(cè)方法：Technoclone公司Technothrombin和Diagnostics Stago公司擁有Thrombobinoscope，兩者均使用熒光底物，Behring公司凝血系統(tǒng)（BCS）使用顯色底物。熒光檢測(cè)比顯色法特異性更高，不受血漿樣品中纖維蛋白及其它化學(xué)物理參數(shù)的影響。這三個(gè)系統(tǒng)的共同點(diǎn)是：

（1）檢測(cè)樣品的制備方法相同，應(yīng)用檸檬酸鈉抗凝，制備乏血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）；

（2）均使用低濃度或高濃度磷脂化重組組織因子（tissue factor，TF）啟動(dòng)凝血反應(yīng)；

（3）以底物裂解作為檢測(cè)對(duì)象，連續(xù)監(jiān)測(cè)凝血酶的生成。

但是，這三種系統(tǒng)在樣品設(shè)置、檢測(cè)底物、測(cè)量過(guò)程和標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品等方面存在以下不同：

（1）樣品設(shè)置。盡管這三種方法均使用TF啟動(dòng)凝血，但是BCS系統(tǒng)還需要纖維蛋白抑制劑和配方不公開(kāi)的緩沖液保持測(cè)定體系的穩(wěn)定性。顯色測(cè)定的缺陷之一是僅能測(cè)定PPP樣本。

（2）檢測(cè)底物。BCS系統(tǒng)的顯色底物為H-β-Ala-Gly-Arg-pNA-pNA，凝血酶對(duì)其裂解產(chǎn)生發(fā)色基團(tuán)。熒光檢測(cè)使用Z-Gly-Gly-Arg-AMC（ZGGRAMC）底物，凝血酶將其裂解后釋放出AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)熒光強(qiáng)度的相對(duì)變化的動(dòng)態(tài)曲線（dx／dt），確定內(nèi)源性凝血酶生成潛力（endogenous thrombin potential，ETP）、最大凝血酶生成量（曲線下面積，area under curve，AUC）、滯后時(shí)間（凝血酶產(chǎn)生所需時(shí)間）、達(dá)到峰值時(shí)間（達(dá)到凝血酶生成速率最大值所需的時(shí)間）和速度指數(shù)（凝血酶生成速率）。

（3）測(cè)量過(guò)程。熒光法測(cè)定需要50到120分鐘，顯色測(cè)定法更快，平均需要20分鐘。

（4）校準(zhǔn)品。Technothrombin校準(zhǔn)品是不同稀釋度的人凝血酶。Thrombinoscope使用α-2-巨球蛋白（α2M）-凝血酶復(fù)合物，TGA不受血漿因素的影響，但是樣品中α2M濃度或結(jié)構(gòu)的變化可能會(huì)影響讀數(shù)。BCS系統(tǒng)需使用專有的校準(zhǔn)品。

應(yīng)用Technoclone TGA體系，我們發(fā)現(xiàn)TGA主要參數(shù)，包括延時(shí)（tLag）、峰時(shí)（tPeak）、峰值（Peak）、曲線下面積（AUC）均與PT-INR和APTT顯著相關(guān)（0.61≤r≤0.79）。而且，多元回歸分析顯示，tLag與tPeak（r＝0.91）之間及Peak與AUC（r＝0.95）之間高度相關(guān)，TGA各參數(shù)與常規(guī)凝血測(cè)試（PT-INR和APTT）顯著相關(guān)［7］。

2 應(yīng)用TGA對(duì)內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)活化的特異性評(píng)價(jià)

TG是外源性凝血系統(tǒng)和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)活化的最終產(chǎn)物。外源性凝血系統(tǒng)是血管壁受損后出血管外壁TF暴露于血液，與FVII結(jié)合，激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)（圖1）。內(nèi)源性凝血系統(tǒng)（或接觸活化途徑，contact pathway）是在血管壁完整情況下，凝血因子X(jué)II（FXII）、前激肽釋放酶（prekallikrein，PK）和高分子量激肽原（high-molecular-weight kininogen，HK）與活化表面結(jié)合并形成復(fù)合物，激活凝血反應(yīng)。最初TGA主要用于評(píng)估TF激活外源性凝血系統(tǒng)，不適于檢測(cè)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)活化。為了克服這一缺陷，我們開(kāi)發(fā)了能夠評(píng)估內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的新的TGA檢測(cè)方法［8］（圖1）。內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的主要成分FXII（又稱Hageman因子）是FXIIa的酶原。FXII通過(guò)Arg353-Val354肽鍵的裂解形成雙鏈FXIIa而被激活。FXII的激活存在兩種主要形式。FXII與帶負(fù)電荷表面結(jié)合，發(fā)生構(gòu)象變化而被活化（自身激活）［8］。另外，激肽釋放酶（kallikrein，Kal）裂解FXII使其活化（異源激活）。我們最近發(fā)現(xiàn)FXII在凋亡細(xì)胞介導(dǎo)的促凝活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。利用Technoclone公司TGA儀器，我們開(kāi)發(fā)了評(píng)估細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）活化內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的檢測(cè)方法［8］，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞在無(wú)TF的情況下顯著增強(qiáng)凝血酶生成，后者被膜聯(lián)蛋白V（annexin V，AxV）顯著抑制［8］，提示FXII、PK和HK在PS陰離子表面形成復(fù)合物而被活化。抑制性抗FXII抗體（C6B7）降低凋亡細(xì)胞介導(dǎo)的凝血酶生成，而抗TF抗體無(wú)抑制作用。而且，在FXII缺陷血漿中凋亡細(xì)胞不能誘導(dǎo)TG，而添加純化FXII恢復(fù)其功能。為了確定PS在凝血酶生成中的作用，我們使用了PS脂質(zhì)體包被珠（圖1），發(fā)現(xiàn)PS脂質(zhì)體同樣誘導(dǎo)TG，C6B7抗體顯著降低PS誘導(dǎo)的TG［8］。因此，TGA以PS脂質(zhì)體作為激動(dòng)劑，可用于評(píng)估內(nèi)源性凝血途徑的特異性激活（圖1）。過(guò)去的研究表明，F(xiàn)XII被各種生物或人工陰離子表面激活，如高嶺土、鞣花酸、核苷酸、硫酸鹽、糖胺聚糖、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集體、聚磷酸鹽和膠原蛋白等。FXII介導(dǎo)凋亡細(xì)胞促凝功能的發(fā)現(xiàn)為凋亡細(xì)胞相關(guān)的病理學(xué)研究提供了新的見(jiàn)解［9］。

鑒于TGA檢測(cè)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)活性的敏感性，我們進(jìn)一步嘗試如何在去除內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的影響下，特異地反映外源性凝血系統(tǒng)介導(dǎo)的TG。TF是止血最關(guān)鍵的起動(dòng)蛋白［10］，通常處于非活性（加密）狀態(tài)［11］。最近的研究表明，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）通過(guò)氧化二硫鍵的形成，激活TF［12］，但是缺乏直接證據(jù)表明PDI通過(guò)調(diào)控TF增強(qiáng)凝血功能。因此，我們使用TGA判定PDI在TF介導(dǎo)凝血中的作用［13］。首先，我們應(yīng)用 Technoclone TGA體系發(fā)現(xiàn)，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）顯著上調(diào)外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）表達(dá)TF及凝血酶生成［13］。加入抑制性抗TF抗體4501抑制凝血酶生成，表明PBMC凝血酶生成依賴于TF［13］。用重組野生型PDI預(yù)孵育PBMC顯著提高凝血酶生成，PDI抑制劑PACMA31降低PBMC的凝血酶生成。此外，與野生型細(xì)胞相比，PDI缺陷小鼠骨髓單核細(xì)胞介導(dǎo)凝血酶生成降低［13］。上述應(yīng)用TGA的結(jié)果（圖1）為PDI調(diào)控TF促進(jìn)外源性凝血系統(tǒng)的關(guān)鍵作用提供了直接證據(jù)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞微粒（microparticles，MPs）增加了凝血酶生成峰并縮短了達(dá)峰時(shí)間［14］。MP膜表面TF表達(dá)和PS暴露均參與微粒的促凝活性［15］。由上可見(jiàn)，基于FVII缺陷和FXI缺陷血漿的TGA檢測(cè)可以具體評(píng)價(jià)PS和TF在凝血酶生成中的特異性貢獻(xiàn)（圖1）。

圖1 TGA分析不同凝血途徑

3 TGA檢測(cè)在臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀

3.1 抗凝藥物的效果評(píng)價(jià) 由上述可見(jiàn)，TGA檢測(cè)不但可以評(píng)價(jià)血漿整體的凝血活性，而且能夠分別檢測(cè)兩條凝血系統(tǒng)的活化水平，并兼具優(yōu)良的敏感性與特異性，與常規(guī)凝血實(shí)驗(yàn)相比，TGA檢測(cè)在評(píng)估抗凝藥物療效方面具有優(yōu)勢(shì)，在臨床應(yīng)用中越來(lái)越廣泛。直接口服抗凝劑（如利伐沙班和達(dá)比加群等）引起出血，尤其是存在腎損害患者。有研究應(yīng)用TGA和血栓彈力圖（TEG），對(duì)接受達(dá)比加群（非瓣膜性心房顫動(dòng)）和利伐沙班（髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后預(yù)防深靜脈血栓形成）患者進(jìn)行了評(píng)估［16］，發(fā)現(xiàn)達(dá)比加群顯著增加TEG動(dòng)態(tài)參數(shù)和TGA的延遲時(shí)間，并降低TGA和ETP的峰高。利伐沙班對(duì)TEG無(wú)影響，但會(huì)增加TGA的延遲時(shí)間，降低TGA和ETP的峰高。這些結(jié)果說(shuō)明TGA更有助于監(jiān)測(cè)出血效應(yīng)和設(shè)計(jì)預(yù)防策略。此外，TGA檢測(cè)有助于評(píng)估止血?jiǎng)ㄈ缒冈瓘?fù)合物濃縮物和重組活化FVIIa）逆轉(zhuǎn)異常的凝血酶生成［17］。另一研究發(fā)現(xiàn)，阿哌沙班減少房顫患者凝血酶生成，故有助于預(yù)防中風(fēng)［18］。

RASTEN多中心隨機(jī)3期臨床試驗(yàn)研究了新確診小細(xì)胞肺癌（SCLC）患者接受依諾肝素治療的生存效果［19］，通過(guò)總TF和TGA評(píng)估全身凝血功能，發(fā)現(xiàn)TG峰值的升高與總生存期降低顯著相關(guān)（OS；P＝0.03），尤其是重癥患者。這項(xiàng)研究表明TG峰值具有評(píng)估患者生存和對(duì)低分子肝素治療反應(yīng)的價(jià)值。

3.2 深靜脈血栓（DVT）的監(jiān)測(cè) 為了評(píng)價(jià)TGA在預(yù)測(cè)靜脈血栓栓塞（VTE）危險(xiǎn)因素和復(fù)發(fā)的能力，有前瞻性研究對(duì)914名首次VTE患者進(jìn)行了平均47個(gè)月的隨訪［20］。11%患者出現(xiàn)VTE復(fù)發(fā)，其凝血酶生成量高于未復(fù)發(fā)患者（P＜0.001）。凝血酶生成小于400nM的患者4年后復(fù)發(fā)的概率為6.5%（95%CI，4.0%-8.9%），而凝血酶生成大于400nM的患者4年后復(fù)發(fā)的概率為20.0%（95%CI，14．9%-25．1%）（P＜0.001），這些結(jié)果說(shuō)明TGA反映癌癥的促凝水平。維也納癌癥和血栓研究（CATS）前瞻觀察性隊(duì)列研究，使用TGA評(píng)估新診斷癌癥患者或緩解后疾病進(jìn)展的患者發(fā)生血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)［21］，發(fā)現(xiàn)凝血酶峰值升高（定義為凝血酶值≥611nM）患者發(fā)生VTE的風(fēng)險(xiǎn)增加，風(fēng)險(xiǎn)比為2.1（95%CI，1．3～3．3；P＝0.002）。另一項(xiàng)肺腺癌患者前瞻性研究應(yīng)用TGA確定，凝血酶生成平均速率指數(shù)（mean rate index，MRI）可以作為VTE的危險(xiǎn)因素［22］。這些研究表明，TGA在評(píng)估癌癥凝血系統(tǒng)的活化狀態(tài)和相關(guān)血栓形成的臨床風(fēng)險(xiǎn)中具有價(jià)值。

3.3 造血系統(tǒng)惡性腫瘤 止血并發(fā)癥常見(jiàn)于惡性血液病患者。Damien Gheldof等使用TGA研究新診斷白血病患者的細(xì)胞外囊泡（EV）對(duì)凝血酶生成的影響，評(píng)估EV相關(guān)的促凝活性（EV-PCA）作為患者血栓并發(fā)癥的生物標(biāo)志物［23］。他們發(fā)現(xiàn)EV-PCA具有止血并發(fā)癥（如DIC或血栓形成）標(biāo)志物的預(yù)測(cè)價(jià)值。另一項(xiàng)對(duì)23名接受L-天冬酰胺治療的急性淋巴細(xì)胞白血病患者的研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)期的內(nèi)源性凝血酶生成和凝血酶峰值水平顯著高于再誘導(dǎo)期（P＜0.001）［24］。Nielson等通過(guò)TGA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者存在高凝狀態(tài)，可能是由于較高的TF和促凝磷脂（PPL）活性所致［25］。此外，慢性粒單核細(xì)胞白血病患者間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞衍生EV比健康供體MSCs產(chǎn)生的凝血酶能力更強(qiáng)［26］。

3.4 血栓形成傾向篩查 TGA在臨床篩查血栓性危險(xiǎn)因素中也有潛力，特別是因子V Leiden或凝血酶原G20210A突變患者和蛋白S缺乏癥患者［27］。當(dāng)TGA滯后時(shí)間相差1.5分鐘時(shí)可排除因子V Leiden的影響；當(dāng)凝血酶峰值濃度＜426 nmol／L［28］時(shí)，可排除凝血酶原G20210A影響。當(dāng)APC誘導(dǎo)的內(nèi)源性凝血酶潛力抑制百分比＞63%時(shí)，可以排除蛋白S缺乏癥的影響［28］。此外，在蛋白S缺乏癥患者血漿中，凝血酶峰和TGA速度顯著升高［29］。

原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）和真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）患者血栓并發(fā)癥的發(fā)生率顯著增加，尤其是在JAK2V617F陽(yáng)性患者。與對(duì)照組相比，ET和PV患者TG顯著升高，而且JAK2V617F陽(yáng)性患者TG值更高［30］。鐮狀細(xì)胞貧血病（sickle cell disease，SCD）是促血栓形成疾病。Whelihan等發(fā)現(xiàn)SCD患者全血TG顯著升高，而血漿凝血酶生成卻減少［31］，全血中表達(dá)PS紅細(xì)胞對(duì)SCD的TG具有顯著貢獻(xiàn)?？沽字C合征（APS）患者凝血酶生成增加，表明TGA可用于APS的血栓傾向監(jiān)測(cè)［32］。肝硬化患者的ST-Genesia測(cè)定顯示高凝狀態(tài)［33］。

3.5 心血管疾病和貧血性中風(fēng) 有研究表明血漿TG水平與癥狀性動(dòng)脈粥樣硬化疾病之間的關(guān)聯(lián)［34］。存在頸動(dòng)脈斑塊［35］或內(nèi)膜中層厚度增加［36，37］患者TG增加。急性心肌梗死患者TG升高，且至少持續(xù)6個(gè)月［38］。在老年人中，TG升高與中風(fēng)發(fā)病有關(guān)，但與心肌梗死無(wú)關(guān)［39］。Olson等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)依賴性TG是導(dǎo)致缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素之一［40］，而且凝血因子X(jué)II的單核苷酸多態(tài)性（SNP）在TG中具有重要性。相反地，Balogun等發(fā)現(xiàn)乏血小板血漿TG不適合于檢測(cè)急性缺血性腦卒中的高凝狀態(tài)［41］。另一項(xiàng)研究也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ST段抬高型心肌梗死與TG的內(nèi)源性凝血酶潛力的相關(guān)性［42］。因此，雖然“凝血酶越多，血栓形成風(fēng)險(xiǎn)越大”的概念已在VTE研究中得到證實(shí)，但凝血酶在動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成中的作用尚不明確［43］?？赡艿脑蚴桥cVTE不同，誘發(fā)血栓形成的動(dòng)脈粥樣硬化病理變化發(fā)生在血管壁組織，而TGA難以檢測(cè)到動(dòng)脈壁成分的變化。

4 目前TGA應(yīng)用存在的問(wèn)題與未來(lái)優(yōu)化方向

綜上所述，與其它凝血檢測(cè)技術(shù)相比，TGA在許多臨床疾病研究和評(píng)估方面更有應(yīng)用價(jià)值和前景。但是，目前的TGA檢測(cè)系統(tǒng)仍然存在技術(shù)難點(diǎn)和局限性，這些問(wèn)題的解決將推動(dòng)TGA在臨床實(shí)驗(yàn)更廣泛的應(yīng)用和優(yōu)化，具體有待解決的關(guān)鍵問(wèn)題如下：

4.1 標(biāo)準(zhǔn)化 雖然這三種商業(yè)化TGA檢測(cè)方法均可以檢測(cè)患者樣本凝血酶的連續(xù)生成，但是每種方法在底物、樣品制備及處理數(shù)據(jù)數(shù)學(xué)公式的不同，導(dǎo)致三者的測(cè)量結(jié)果之間發(fā)生顯著差異。因?yàn)檫@三種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，沒(méi)有優(yōu)劣之分，均有待優(yōu)化之處，因此，迫切需要建立在臨床研究中能夠可靠地檢測(cè)、預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)凝血障礙的標(biāo)準(zhǔn)化TGA方法，這對(duì)于全球多中心臨床研究和藥物開(kāi)發(fā)臨床實(shí)驗(yàn)尤其必要。目前，研究者根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)和偏好、實(shí)驗(yàn)室要求或與已建立的光譜儀或熒光計(jì)的兼容性來(lái)選擇合適的方法。TGA現(xiàn)在和未來(lái)臨床適用性取決于控制／標(biāo)準(zhǔn)化變量、檢測(cè)結(jié)果與臨床病情的相關(guān)性，以及對(duì)凝血酶相關(guān)的疾病進(jìn)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)。如果這些問(wèn)題能夠得到解決，TGA將在臨床上得到更廣泛和可靠的應(yīng)用。

4.2 全血樣本測(cè)量 循環(huán)血液中TG涉及血細(xì)胞，如血小板和白細(xì)胞（尤其是單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞），但是目前TGA僅使用乏血小板血漿或富血小板血漿樣本，因?yàn)橹苽溥^(guò)程耗時(shí)，所以無(wú)法快速診斷。理想的TGA檢測(cè)技術(shù)是能夠采用全血樣本［44］，這樣便能直接可靠地反映體內(nèi)凝血狀態(tài)，并建立標(biāo)準(zhǔn)化患者和對(duì)照者的血液采集和樣本制備。

4.3 觸發(fā)劑 由于缺乏針對(duì)TGA測(cè)量條件的標(biāo)準(zhǔn)化觸發(fā)試劑，例如觸發(fā)劑的類型和濃度，或者是否使用接觸活化抑制劑等，因此很難比較不同臨床實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)。目前正在進(jìn)行幾項(xiàng)研究，力圖對(duì)導(dǎo)致變異的主要原因（如觸發(fā)劑的來(lái)源和濃度）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，這些研究將有助于減少分析內(nèi)和分析間的誤差，以及不同實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)差異。

4.4 樣品容器反應(yīng)杯 通過(guò)應(yīng)用凝血因子缺陷的人和小鼠的血漿，我們發(fā)現(xiàn)樣品反應(yīng)杯可以激活血漿接觸系統(tǒng)（負(fù)責(zé)內(nèi)源性凝血途徑的啟動(dòng)）誘導(dǎo)的凝血酶生成。因此我們需要優(yōu)化樣品容器反應(yīng)杯的材料，并考慮使用接觸系統(tǒng)抑制劑，以降低材料所致的凝血系統(tǒng)活化。因?yàn)門GA是一個(gè)開(kāi)放的檢測(cè)系統(tǒng)，所以可以將抗體、蛋白質(zhì)、酶和多肽等引入分析系統(tǒng)以優(yōu)化測(cè)量條件。

4.5 內(nèi)皮細(xì)胞的源性成分 內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)起著預(yù)防凝血的重要作用。未來(lái)的TGA技術(shù)改進(jìn)可以考慮在反應(yīng)中加入內(nèi)皮細(xì)胞的源性成分或使用內(nèi)皮細(xì)胞包被的樣品試管，這一改進(jìn)有望提升血栓形成的整體評(píng)估的價(jià)值。

4.6 溫度 多項(xiàng)研究表明，導(dǎo)致天數(shù)間或室間結(jié)果變異的主要原因之一是血漿樣品的溫度，包括制備乏血小板血漿的離心溫度、TG儀器測(cè)量的溫度［45］。溫度的標(biāo)準(zhǔn)化將有助于減少檢測(cè)的變異。

TGA的標(biāo)準(zhǔn)化和準(zhǔn)確性是其在臨床應(yīng)用的必要條件。目前國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)-科學(xué)和標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ISTH-SSC）正在制定TGA標(biāo)準(zhǔn)化的指南和建議，盡量減少實(shí)驗(yàn)室之間的差異，規(guī)范觸發(fā)劑的使用標(biāo)準(zhǔn)化，例如不同來(lái)源的磷脂、不同品牌的組織因子等。同時(shí)，制造商還需要幫助研究人員制定更精確的臨床樣本檢測(cè)程序。

5 結(jié) 論

TGA已成為最可靠的凝血活化測(cè)量方法。它可以評(píng)估不同內(nèi)源性和外源性凝血途徑誘導(dǎo)的凝血酶生成。由于其廣泛的臨床應(yīng)用，目前迫切需要一種能夠可靠地檢測(cè)、預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)凝血功能障礙的全球性標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法，以達(dá)到更精確地反映體內(nèi)凝血狀態(tài)。

作者貢獻(xiàn)聲明武藝、魯翌、葉絮、劉爍撰寫(xiě)文章；武藝負(fù)責(zé)整體設(shè)計(jì)和校正

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

縮略表

凝血酶生成實(shí)驗(yàn)，TGA；校準(zhǔn)的自動(dòng)血栓形成圖，CAT；血栓彈力圖，TEG；凝血酶原時(shí)間，PT；活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間，APTT；貧血小板血漿，PPP；富血小板血漿，PRP；組織因子，TF；因子X(jué)II，F(xiàn)XII；前激肽釋放酶，PK；高分子量激肽原，HK；鐮狀細(xì)胞貧血病，SCD；靜脈血栓栓塞癥，VTE。